神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)技術

1、1光學顯微鏡倒置熒光顯微鏡冰凍切片機 光明 DZKW 型電熱恒溫水浴鍋XK96-A 快速混勻器HT-200 電子天平FA1004型精密電子天平MP 8001 單臂腦立體定位儀10 d微量進樣器0.5ml、1ml Eppe ndorff 管神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)與鑒定、八一前言神經(jīng)干細胞(Neural stem cells, NSC s)是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)能產(chǎn)生神經(jīng)元和膠質(zhì)細 胞的未分化原始細胞【1-2】。文獻報道，NSC具有無限增殖、自我更新和多向分 化能力，在適宜的環(huán)境條件下，能分化形成各種靶組織細胞【3-5】。此外， NSC還可用作為是細胞移植治療的有效載體，被廣泛用于神經(jīng)疾病細胞或載體治療。 根據(jù)

2、目前的研究結(jié)果，其主要作用包括下列三方面：NSC分化成宿主細胞來替代丟失細胞的作用；分泌多種細胞因子發(fā)揮生物學功能； 橋接作用【6-8】。 基于NSC的上述特性，從而奠定了 NSC在細胞替代治療中有廣泛應用前景， 而 如何獲取 NSC 則是科學研究和臨床實踐中首先面臨的關鍵問題。本實驗擬建立 綠色熒光蛋白(Green fluoresce nt protein, GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠NSCs原代和傳代培 養(yǎng)技術，為后面的實驗提供方法支持。二 實驗所需儀器、試劑及其配制一) 實驗儀器(Olympus,Japan)(LEICA DMIRB )( Leica CM1900， Germany)(北京市光明

3、醫(yī)療儀器廠)(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司) (成都普瑞遜電子有限公司川制) (上海良平儀器儀表有限公司 ) (深圳市瑞沃德科技有限公司 )Pressure-Lok， PRECISION SAMPLINGCORP ， BATON ROUGE ，LOUISIANA ， Made in USA)( Ependorff)手術器械：眼科剪、解剖剪、顯微剪、顯微有齒鑷及無齒鑷、蚊式鉗、刀柄刀片等。(二) 試劑1. DMEM/F12 , Hank's液(Hyclone), N2 (Gibico), bFGF(lnvitrogen)。2. 碳酸氫鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸氫二鉀，氯化鉀，氯化鈉，

4、 多聚甲醛等為國產(chǎn)分析純試劑，谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素。(三) 主要試劑的配制1. 基礎培 養(yǎng)基 DMEM/F12 1:1的配制DMEM 粉劑 1.34g ， F12 1.06g 。( 1 )稱取以上試劑量后放入 200ml 燒杯中。( 2)加三蒸水至 200ml 攪拌溶解。(3) 用 1mol/LNaOH 或 1mol/LHCI 調(diào) pH 值為 7.20。(4) 過濾分裝，置4C冰箱保存。2. D-Hanks 液(g/L)的配制KCl 0.40g ,KH2PO4 0.06g , NaCI 8.00g , NaHCOs 0.35g , Na2HPO4 72O 0.09g，酚紅 0.01g。(

5、1 )稱取以上試劑量。( 2)取 1000ml 燒杯盛約 700ml 三蒸水，依次加入所稱試劑量溶解。( 3)再加足水至 1000ml。(4) 用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 調(diào) pH 值為 7.20。(5) 過濾分裝，置4C冰箱保存。3. 抗生素液配制青霉素1 X10 IU/甁，鏈霉素1g/瓶。加入0.9%無菌的生理鹽水50ml，即可配制成青霉素濃度為2X10 iu/ml，鏈 霉素濃度為20mg/ml液體，無菌分裝，-20C保存，使用時稀釋成青霉素工作濃 度為100IU/ml、鏈霉素為100 pg/ml。4. bFGF-20 T保存，使用時用三蒸水稀釋至20n g/ml

6、的工作濃度。5. 3.6% 水合氯醛溶液的配制：稱取 3.6g 水合氯醛置于 250ml 量筒中，加入少量無菌生理鹽水溶解后定容至 100ml。6. 培養(yǎng)液的準備DMEM/F12 1:1100mlGB液9ml混合后，0.22 g微孔濾膜過濾除菌，雙抗（青、鏈霉素）各0.25m每瓶分裝為10-20 ml, 4C儲存。bFGF2 用B271ml7. 4%多聚甲醛磷酸緩沖液的配制：稱取40g多聚甲醛置于1000ml燒杯中，加入0.1 mol/L PBS 800ml, 60C加 熱至多聚甲醛完全溶解為止，冷卻后滴加1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液，用PHS-3C型精密pH計調(diào)整pH

7、值在7.2-7.4之間，添加0.1 mol/L PBS定容至 1000ml，4C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?. 鉻明膠溶液的配制：分別稱取5g明膠和0.5g鉻明磯，用60C 800ml左右的單蒸水先溶解明膠后， 再加入鉻明磯，待完全溶解后定容至 1000ml，過濾，用于包被玻片。包被時將 玻片浸入60E的鉻明膠溶液中15-20min,取出后37C烤干備用。9. 20%、25%、30%蔗糖溶液的配制：分別取蔗糖20g,25g,30g,分別用0.1 mol/L PB緩沖液溶解后，定容至100ml。三實驗步驟（一）神經(jīng)干細胞懸液制備取孕E1214d的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，用75%乙醇浸泡消毒GFP轉(zhuǎn)基因孕 鼠。無

8、菌條件下，剪開腹部皮膚及皮下筋膜，暴露并分離子宮，取出子宮，將其 放入含D-Hanks液的培養(yǎng)皿中清洗。用剪刀，鑷子分離胎鼠（102d）,取其頭 部，在解剖顯微鏡下用纖維剪，鑷暴露大腦，無菌條件下分離腦膜獲取海馬，制 成1mm3組織塊，剪碎并反復吹打制成細胞懸液，加入DMEM/F12 1:1 （ Hyclone） 培養(yǎng)液（其中添加 1 %N2 （Gibico）, 20/L bFGF （Invitrogen）, 2mmol/L 谷氨 酰胺，50000U/L青霉素，50mg/L鏈霉素），用吸管吹打20- 30次，細胞濾網(wǎng)過 濾后制成單細胞懸液，（二）細胞計數(shù)1.取10 d細胞懸液，加入1%臺盼藍試

9、劑計數(shù)存活細胞，計算細胞總數(shù)。 具體操作方法為：用10 d的移液槍吸取細胞，讓槍頭在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù) 板凹槽處流出懸液，至蓋玻片下被液體充滿為止。3. 置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。對于壓線的細胞只計數(shù)在上 線和左線者，對于細胞團按單個細胞計數(shù)。4. 按下式計算細胞懸液的密度：細胞密度 =（4大格細胞總數(shù)/4） X 10000 （個/ml ）。按此公式，測得細胞密度。（三）神經(jīng)干細胞培養(yǎng)調(diào)整細胞濃度為5X10個/ml，加入無血清的NSCs培養(yǎng)基，成份為DMEM/F-12 1:1（Hyclone），添加1% N2（Gibico）, 20/L堿性成纖維細胞生長因 子（bFGF，Invi

10、trogen），2mmol/L 谷氨酰胺，10000U/L 青霉素，10mg/L 鏈霉素。 接種于24孔培養(yǎng)板，37C 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔日半量換液1次。2d即可見 有漂浮的神經(jīng)球形成（圖1），5d左右神經(jīng)球增大，數(shù)量增多（圖2）,傳一代后， NSC 形態(tài)與原代類似（圖 3）。（四）培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的鑒定根據(jù)文獻報道（ LIU Shi-yong，et al. 2000），我們用針對培養(yǎng)細胞的特異染 色抗體 Nestin 來鑒定培養(yǎng)細胞。分別將培養(yǎng)純化的神經(jīng)球涂于多聚賴氨酸溶液（40g/L）包被的載玻片上制成涂片。用4%多聚甲醛固定1520min， 0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5m

11、in；按文獻報道的免疫組化兩步法 （Zhai JW, et al. 2010）染色鑒定細胞。具體方法簡介如下：3%出。2避光處理30min以滅活內(nèi) 源性過氧化物酶，0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min; 0.3%TritonX-100 37 C孵 育30mi n； 5%羊血清37C孵育30min以封閉非特異性結(jié)合位點；滴加兔 Nest in 一抗（Chemicon, 1:100），另一組只滴加0.01mol/L PBS為陰性對照組。4C濕盒 孵育過夜，0.01mol/L PBST漂洗3次，每次5min,加入酶標羊抗兔IgG （二抗， 1:100）, 37C 孵育 30min ,0.

12、01mol/L PBS 漂洗 3 次，每次 5min; DAB 顯色 35mi n 后,用單蒸水終止顯色，脫水、透明、裱片，在普通光學顯微鏡下觀察陽性反應 產(chǎn)物部位并拍照。四實驗結(jié)果（一）, NSC形態(tài)學源于海馬的單細胞懸液后接種在24孔培養(yǎng)板1h后，即有細胞貼壁，單個細胞 呈球形。24h后見一些貼壁的扁平細胞，立體感較差，透亮度一般，這些一般是 成纖維細胞。此時將培養(yǎng)液放入另一培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，3d后離心收集細胞并在 細胞內(nèi)加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。NSC生長特性為懸浮生長，3d即可見一些克隆球， 5d增大，傳一代時已較純。（圖1A,B ）（二）, NSC組化染色鑒定結(jié)果本實驗用Nestin免疫組

13、化染色鑒定NSC，源于GFP的NSC本可發(fā)綠色熒光 （圖 2）， Nestin 染色呈陽性反應 （圖 3）。（三）結(jié)果分析與討論本實驗顯示：培養(yǎng)的神經(jīng)球呈Nestin免疫染色陽性，說明陽性細胞是 NSC。 神經(jīng)干細胞是一類未成熟細胞，選擇性地表達某些抗原標志如巢蛋白（Nestin）。巢蛋白屬中間絲蛋白。是目前作為神經(jīng)干細胞的標記分子。Nestin的表達起始于神經(jīng)板的形成，在神經(jīng)遷移及神經(jīng)分化開始后逐漸消失，因而利用Nest in的抗體標記成為我們證明所分離細胞為胚胎早期細胞的重要方法之一。 Schmidt-Kastner 等（Schmidt-Kastner, et al. 2002在實驗中發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)28周的成年大鼠腦組織 切片中可見Nestin持續(xù)呈陽性表達，這說明組織中出現(xiàn)了幼稚的神經(jīng)干細胞。本 實驗取胎鼠海馬組織進行培養(yǎng)， 在顯微鏡下觀察可見圓形細胞團， 由數(shù)十至數(shù)百 個細胞組成，免疫組化染色見Nesti n陽性，證明培養(yǎng)細胞確為神經(jīng)干細胞。關于 NSC 在體外的生長形態(tài)，已有不少文獻報道， NSC 在培