6細(xì)胞分析與檢測(cè)技術(shù)

1、methods and techniques內(nèi)容提要內(nèi)容提要 一、一、 細(xì)胞顯微技術(shù)細(xì)胞顯微技術(shù) （一）光學(xué)顯微鏡（一）光學(xué)顯微鏡 （二）電子顯微鏡（二）電子顯微鏡 （三）顯微操作技術(shù)（三）顯微操作技術(shù) 二、二、 細(xì)胞生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) 三、三、 細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù) 一一. . 顯微技術(shù)顯微技術(shù) 光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。 電子顯微鏡：以電子束為光源。（）光學(xué)顯微鏡）光學(xué)顯微鏡 1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng) 機(jī)械裝置 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡light pathway of mi

2、croscope 3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 光學(xué)顯微鏡的分辨力光學(xué)顯微鏡的分辨力 r=0.61/na 其中其中為入射光線波長；為入射光線波長； na為鏡口率為鏡口率 sin/2， n=介質(zhì)折射率； =鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角） 。表一、幾種介質(zhì)的折射率 顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)： 介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的（ 1. 7 ）越好。 sin /2的最大值小于1；油鏡介質(zhì)為香柏油，鏡口率可接近1.5。 普通光線的波長為400700nm，光鏡分辨力約為0.2m，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000x。熒光顯微鏡 fluorescent mi

3、croscope特點(diǎn)：光源為短波光；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。fluorescence image, dna in blue and microtubules in green 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。激光共聚焦掃描顯微境激光共聚焦掃描顯微境 laser confocal scanning microscope, lcsm 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。laser confocal scanning micros

4、cope, lcsm激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖lcsm image of a xenopus melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) /暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡 dark field microscope 聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的。 可觀察 4200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。 把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種

5、結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。1. 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。2. 相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。（五）相差顯微鏡（五）相差顯微鏡原理（六）偏光顯微鏡（六）偏光顯微鏡polarizing microscope 用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。 光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器 （與起偏器方向垂直的偏振片）。 載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)。淀粉（七）微分干涉差顯微鏡（七）微

6、分干涉差顯微鏡 differential interference contrast microscope （dic） 1952年nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。（八）倒置顯微鏡）倒置顯微鏡 inverse microscope 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒； 用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差或dic物鏡，有的還具有熒光裝置。 （九）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì) 采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、dic、攝影裝置于一體。 自動(dòng)化與電子化。（二）電子顯微鏡（二）電子顯微鏡 原理原理 以電

7、子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50120kv)的平方根成反比。 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。 用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2m）。透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡transmission electron microscope, tem表二、不同光線的波長表二、不同光線的波長tem light pathway透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡transmission electron microscope，tem制樣技術(shù) 1）超薄切片）超薄切片 用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用

8、超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。2）負(fù)染技術(shù)）負(fù)染技術(shù) 用重金屬鹽(如磷鎢酸) 染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。negative stained archaebacteria 3）冰凍蝕刻）冰凍蝕刻 freeze-etching 亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜

9、（replica）。an onion root tip cell with no etching. 斷面的三種處理方法： 蝕刻（ etching ）、不蝕刻（no etching ）、深度蝕刻（deep etching ）培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示 clathrin衣被網(wǎng)格蛋白(clathrin)是一種進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，由分子量為180kda的重鏈和分子量為3540kda的輕鏈組成二聚體, 三個(gè)二聚體形成包被的基本結(jié)構(gòu)單位-三聯(lián)體骨架(triskelion), 稱為三腿蛋白(three-legged protein)。 20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。 分辨力為610

10、nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000x。掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡scanning electron microscope（ sem） 工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。sem light pathway人類紅細(xì)胞人類紅細(xì)胞酵母酵母

11、人類精子人類精子掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡scanning tunneling microscope，stm 原理：根據(jù)隧道效應(yīng)設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mv2v），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率：橫向?yàn)?.10.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。 用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。掃描隧道顯微鏡原理引自http:/www.iap.tuwien.ac.at stm image of a dna molecule原

12、子力顯微鏡原子力顯微鏡atomic force microscope (afm) 基本原理基本原理 將探針裝在一彈性微懸臂的一端，微懸臂的另一端固將探針裝在一彈性微懸臂的一端，微懸臂的另一端固定，當(dāng)探針在樣品表面掃描時(shí)，探針與樣品表面原子間定，當(dāng)探針在樣品表面掃描時(shí)，探針與樣品表面原子間的排斥力會(huì)使得微懸臂輕微變形，這樣，微懸臂的輕微的排斥力會(huì)使得微懸臂輕微變形，這樣，微懸臂的輕微變形就可以作為探針和樣品間排斥力的直接量度。一束變形就可以作為探針和樣品間排斥力的直接量度。一束激光經(jīng)微懸臂的背面反射到光電檢測(cè)器，可以精確測(cè)量激光經(jīng)微懸臂的背面反射到光電檢測(cè)器，可以精確測(cè)量微懸臂的微小變形，這樣就

13、實(shí)現(xiàn)了通過檢測(cè)樣品與探針微懸臂的微小變形，這樣就實(shí)現(xiàn)了通過檢測(cè)樣品與探針之間的原子排斥力來反映樣品表面形貌和其他表面結(jié)構(gòu)。之間的原子排斥力來反映樣品表面形貌和其他表面結(jié)構(gòu)。 schematic drawing of afm（三）顯微操作技術(shù)（三）顯微操作技術(shù)micromanipulation technique 是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。 包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。 細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，1952 年，briggs和king等將不同階段的蛙胚細(xì)胞核注入去核的蛙卵，構(gòu)建核移植胚。gordon（1962）證明原腸胚

14、以后的細(xì)胞核移植能發(fā)育到成體。1997年，wilmut等克隆了綿羊dolly。 顯微操作儀顯微操作儀轉(zhuǎn)基因顯微操作過程 三三. 細(xì)胞生物化學(xué)與細(xì)胞生物化學(xué)與 分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)（一）細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（一）細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。 在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離組織

15、中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。 培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定 1臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色； 用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力； 方法： (1)將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中； (2)加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘； (3)吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片； (4)鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。 臺(tái)盼藍(lán)法 死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀

16、。 活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。 2四唑鹽（mtt）比色法四唑鹽（mtt）商品名為噻唑藍(lán)； mtt比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（dmso）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定od值； mtt法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。 操作步驟：（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升

17、），37、5 co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）；（2）加入2毫克毫升的mtt液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)； 操作步驟：（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入dmso液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；（4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔o(hù)d值（檢測(cè)波長570納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法用于對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。 固定方法固定方法1. 物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。2. 化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。顯示方法顯示方法1.金屬沉

18、淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成cos或pbs有色沉淀，而顯示出酶活性。2.schiff反應(yīng)：醛基可使schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（feulgen反應(yīng)）。3.聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解h202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。4.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。5.茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。（二）免疫細(xì)胞化學(xué)（二）免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry 是利用抗體同特定抗原專一結(jié)合的原理，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。 免疫熒光法（immunofluorescent

19、technique）：如異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeled antibody method）：如辣根過氧化物酶。 免疫金法（immunogold technique） abc法（ avidin-biotin complex） 親和素avidin又稱卵白蛋白，是一種分子量為68kd的糖蛋白。它與生物素biotin(又稱維生素h)之間會(huì)發(fā)生非共價(jià)性反應(yīng)，具有高度親和力。這種親和力要超過抗體對(duì)大多數(shù)抗原親和力100萬倍。所以，avidin對(duì)biotin的結(jié)合是不可逆的。同時(shí), avidin有4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可與biotin結(jié)合。因此,在免疫酶技術(shù)中可利用avidin與b

20、iotin之間的這種反應(yīng)特性，以biotin標(biāo)記抗體或與酶結(jié)合,再通過avidin-biotin的架橋把酶與抗體連接起來,以提高檢測(cè)方法的敏感度。abc法（ avidin-biotin complex） 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 利用某些熒光素，如fitc、r-pe(r-phycoerythrin藻紅蛋白)等通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測(cè)抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)未知抗原或相應(yīng)配體。細(xì)胞膜蛋白分子的檢測(cè) 原理： 細(xì)胞膜表面的抗原或受體可特異地與相應(yīng)的抗體或配體結(jié)合，將針對(duì)細(xì)胞表面抗原

21、的抗體或配體用不同的熒光素標(biāo)記，根據(jù)不同熒光物質(zhì)的最大激發(fā)和發(fā)射波長的不同，即可準(zhǔn)確定量每種熒光物質(zhì)的強(qiáng)度，從而推出相應(yīng)細(xì)胞表面抗原表達(dá)量（1） 直接法直接法：細(xì)胞熒光素標(biāo)記的抗cd分子的抗體 4c反應(yīng)30- 60 min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析。（2） 間接法：間接法：細(xì)胞抗cd分子的抗體 4c 反應(yīng)30-60 min 熒光素標(biāo)記的二抗 4c 反應(yīng)30-60 min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析懸浮細(xì)胞：用pbs洗二次后再做染色貼壁細(xì)胞：先用胰酶消化成懸浮細(xì)胞再染色1 細(xì)胞膜細(xì)胞膜cd分子的檢測(cè)分子的檢測(cè) 2 annexin v檢測(cè)技術(shù) (檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一個(gè)常規(guī)指標(biāo)) 磷脂酰絲氨酸

22、（phosphatidylserine, ps）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，ps可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。annexin-v是一種分子量為3536kd的ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與ps高親和力特異性結(jié)合。將annexin-v進(jìn)行熒光素（fitc、pe）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的annexin-v作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 原理原理樣本處理和染色方法（1） 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.51106）用pbs洗2次，加入100ul binding buffer和fitc標(biāo)記的annexin

23、-v（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入pi（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入400ul binding buffer，立即用facscan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過1h）， 同時(shí)以不加annexinv-fitc及pi的一管作為陰性對(duì)照。（2） 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。（3） 爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。 table 1. flow cytometric analysis of annexin-v and pi double stained hela cellst

24、ime after 2p photo-induce (h)percentage of apoptosis necrosis0261.70 1.008.54 1.5654.14 13.68 control 2p/ 4m, 2h 2p/ 4 m, 6hqiao et al., unpublished data細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)、凋亡相關(guān)蛋白tfar19的檢測(cè)等。操作過程：操作過程：（1）直接法： 細(xì)胞 3多聚甲醛固定和 滲透化 封閉 熒光素標(biāo)記的 抗體 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析 （2）間接法： 細(xì)胞 3多聚甲醛固定和滲透化 封閉 針對(duì)蛋白的特異 抗體 洗滌 熒光素

25、標(biāo)記的二抗 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析 凋亡相關(guān)蛋白tfar19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 tfar19（pdcd5）促進(jìn)細(xì)胞凋亡。利用熒光素（fitc）標(biāo)記的tfar19單克隆抗體為探針，對(duì)細(xì)胞凋亡過程中tfar19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期tfar19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。凋亡早期tfar19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（ps）外翻和細(xì)胞核dna的片段化，提示tfar19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期tfar19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)tfar19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提

26、供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。 1 懸浮細(xì)胞的染色：懸浮細(xì)胞的染色： （1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.51106），pbs洗2次， （2）3%多聚甲醛冰浴10min，pbs洗2次，1000rpm10min。（3）加入pbs-t溶液，37c孵育15min，pbs洗2次， （4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。（5）加入 fitc標(biāo)記的tfar19單抗(3a3)，4c反應(yīng)30min（6）洗液洗細(xì)胞2次，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察tfar19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測(cè)tfar19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。 2 貼壁細(xì)胞的原位染色貼壁細(xì)胞的原位染色（1） 貼壁生長的對(duì)數(shù)期細(xì)胞

27、鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到50%80%滿時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。 （2） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。（3） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ul）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察tfar19在細(xì)胞中的定位。staurosporin(e), 星孢菌素（三）放射自顯影術(shù)（三）放射自顯影術(shù) 用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。 原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 由于有機(jī)大分子

28、均含有碳、氫原子，一般用14c和3h標(biāo)記。常用3h-tdr來顯示dna，用3h-udr顯示rna；用3h氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3h甘露糖、3h巖藻糖研究多糖。 均為弱放射性同位素，的射線：能量低、射程短、電離作用強(qiáng)； 半衰期長，14c半衰期為5730年，3h為12.5年。（四）分子雜交技術(shù)（四）分子雜交技術(shù) 具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成dna-dna，dna-rna或rna-rna雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。 1. 原位雜交（原位雜交（in situ hybridization）。）。 用于檢測(cè)染色體上的

29、特殊dna序列。最初是使用放射性dna探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。人類染色體端粒dna的熒光原位雜交照片 2. 核酸雜交 southern雜交：是體外分析特異dna序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核dna或線粒體dna切成dna片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。 northern雜交：將rna轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交。（五）（五）pcr 技術(shù)技術(shù) pcr即：polymerase chain reaction。 反應(yīng)體系：樣品dna；引物（primer），約15-20個(gè)核苷酸；4種dntp；tag dna聚合酶，

30、來自于嗜熱水生菌thermus aquaticus，最適作用溫度7580，短時(shí)間在95下不失活。緩沖體系和mg2+。 反應(yīng)過程：變性：約90-95；復(fù)性：約60左右；延伸：70-75；重復(fù) “變性復(fù)性延伸” 過程20-30次循環(huán)。pcr原理三三. 細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù)（一）離心技術(shù) 是分離細(xì)胞器及各種大分子基本手段。 轉(zhuǎn)速為1025kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。 轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89k者稱為超速離心機(jī)。 超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100kr/min，離心力超過500kg。 差速離心差速離心 differential centrifugation 特點(diǎn)： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級(jí)離心。 用途：