激光共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用

1、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope lscm ）是20 |比紀80年代發(fā)展起 來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品，是當今世界最先進的細胞生物學分析儀器。它是 在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計 算機進行圖象處理，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究。已廣泛應(yīng)用于細胞生物 學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經(jīng)生物學等領(lǐng)域。一.組成倒置或直立熒光顯微鏡、掃描頭（照明針孔、探測針孔、熒光濾片系統(tǒng)、鏡掃描系統(tǒng)和光電 倍增管）、掃描頭控制電路、計算機和圖像輸

2、出設(shè)備二原理con focal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來口光源 的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測 針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探 測點來說是共輒的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計-算機以像 點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路屮的掃描系統(tǒng) 在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只耍載物臺沿著z軸上下移動，將 樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著z軸的不斷

3、 移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點：1. 點照明2. 具有照明pinhole和探測pinhole3. 照明pinhole和探測pinhole共覘（共焦），共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦 平面4. 具有掃描系統(tǒng)一一逐點掃描成像5. 具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標記物例如:leica tcs nt的技術(shù)指標：1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x傳統(tǒng)顯微鏡:rxy二0.611/naconfocal: rxy=0.4l/na2. 樣品的最大厚度:大約2mm（10x/0.2物鏡）取決于三點：物鏡的景深，與na成反比z軸的最大移動范圍

4、激光的穿透力3. 樣品的最小光切厚度：大約0.35 mm取決于兩點：物鏡的數(shù)值孔徑naz軸的最小移動步距:40nmz軸的分辨率:0.35 mm4. 激光器kr/ar 激光器：477nm, 488nm, 568nm, 647nmai激光器（uv）: 361nm激光器的特點：1）方向性好：激光基本眼直線傳播2）單色性好l=10-8nm3）髙亮度：激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集屮的4）偏振性：激光為平面偏振光，光纖耦合5. 四個熒光通道，一個透射光通道，即除了可同吋采集 多標記熒光圖像外還可以同時采集透射光圖像，但透 射光圖像為非共焦圖像四. 共焦顯微鏡的類型：1點（慢）掃描共焦顯微鏡：

5、分辨率高，圖像清晰；噪音低；采集圖像速度慢；目鏡中觀察不到共焦圖像；2. 線（狹縫）扌描共焦顯微鏡（video rate）:分辨率低；噪音高；掃描速度快240幅/秒；目鏡中可觀察到共焦圖像3. nipkov轉(zhuǎn)盤式掃描共焦顯微鏡：性能介于上述兩者z間 功能：1.多熒光標記樣品的圖像釆集2. 無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“ct”3. 真正的三維重組4. 假三維圖的顯示5. 可沿z軸（xy平面）和y軸（xz平而）方向進行光切6. 定量分析7. xyt、xzt xyzt和xt掃描吋間序列掃描&圖像處理9. 旋轉(zhuǎn)掃描10. 區(qū)域掃描11. 光譜掃描五、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用定位、定量三維重組

6、動態(tài)測量*活細胞或組織內(nèi)游離ca2+濃度的測量*活細胞內(nèi)h+濃度（ph值）的測量*自由基的檢測*藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量應(yīng)用：細胞膜電位的測量熒光漂白恢復(fù)（frap）的測量籠鎖解籠鎖的測量熒光能暈共振轉(zhuǎn)移(fret)的測暈其他應(yīng)用1、定位、定量免疫熒光標記(單標、雙標或三標)的定位、定量。如：細胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位細胞凋亡:annexinv-fitc + pi末端原位雜交-fitc + pi熒光原位雜交：染色體基因定位單細胞凝膠電泳gfp的表達游離ca2+的分布與定量定位、定量研究中常用熒光探針1) amine

7、-reactive probes與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核背酸 耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等2) fitc (fluorescent isothiocyanate) bodipy fl 503/5123) 異硫氤基熒光素494/5184) tritc四甲基異硫氟基羅丹明544/572 bodipytmr 543/5695) texas red 徳州紅 595/615 bodipytr592/6186) pe藻紅蛋白565/5787) cy3 490/5308) cy5 650/690(1) 細胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋片免役熒光標記：與抗體耦聯(lián)，直

8、標：一抗+熒光探針間標：二抗+熒光探針 如：微管蛋白抗tublin抗體+熒光探針 肌動蛋白palloidine+熒光探 針(2) 細胞膜表面受體配體+熒光探針 如:nachr、machr、多巴胺受體(dld2)標記gml:霍亂毒素受體霍亂毒素+fitc2. 標記細胞器熒光探針(1) 線粒體mitochondria rodamin 123 505/534 ,可染活細胞,陽離子性，可檢測線粒體膜電 位，且在多數(shù)細胞屮停留時間短jc1線粒體膜電位低時為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位低吋為多聚體490/590發(fā)紅光可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最佳探|-： mitotracker gr

9、een fm 490/516,染活細胞或固定細胞，穩(wěn)定不漏出：mitoracker orange cmtmros 551/576,(氧化型)mitoracker orange 還原型，只 能染活細胞(2) 溶酶體lysosome中性紅541/640:微偏堿性，可標記溶酶體等酸性器官為非特界性ao : lysotracker green dnd-26 504/511,染活細胞 lysotracker blue lysotrackerred(3) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)endoplasmic reticulum dioc6 484/500:非特異性，較高濃度標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，較低濃 度標記線粒體(4) 高爾基體golg

10、i apparatus nbd c6-ceramie 466/536,可染活或死細胞"細胞器的單克隆 抗體(5) 細胞核 pi propidium iodide 536/617 dna/xrna 死細胞碘化丙唏 eb ethidium bromide 518/617 dna/rna 死細胞hochest 33342 352/461 dna a-t 活細胞hochest 33258 (同上)dapi 358/461 dna a-t 半通透細胞chromomycin a3 450/470 dna g-cao 500/526 dna 活細胞460/650 rnatoto-1 514/533

11、 dna 死細胞syto活細胞3. gfp綠色熒光蛋白gfp的的發(fā)現(xiàn)：60年代，shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren), 該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證 實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白gfp,后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生 藍色熒光，gfp在藍光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。將外源基因與gfp dna相連,gfp可作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達.gfp主要應(yīng)用：對活細胞中的蛋白質(zhì)進行準確定位及動態(tài)觀察如：可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長

12、、分裂、分化過程中的時空表達gfp基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細胞，可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程gfp基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾 基體、線粒體等細胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程:定位與定量測量應(yīng)注意的問題定位：1.可以對圖像進行修飾，2. pinhole可盡可能的小。3. 確認共定位時要取兩個通道熒光相互干擾的對照圖像定量：1. 儀器的各個條件必須一致2. 必須用原始圖像進行定量測量3. pinhole盡可能的大六. 顯微ct與三維重組光切的層數(shù)：voxelsizez £ 2voxelsizex七. 動態(tài)測量physiology:細胞

13、內(nèi)離子動態(tài)變化測量1).游離ca2+測量檢測游離ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為ca2+螯合劑，不與ca2+結(jié)合時不發(fā)熒 光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯am相連方可進入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)酯酶水 解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。kd值為ca2+解離常數(shù)，表明檢測ca2+濃度的范|5|:0.1xkd-10xkd,kd和很多因素有關(guān)，如ph、mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細胞內(nèi)生理ca2+濃度值(10-100n m),細胞內(nèi)ca2+超載濃度值(基礎(chǔ)ca2+濃度的10倍左右)熒光探針激發(fā)波長發(fā)射波長kdfluo3-am, k+, dextran 506nm 525nm 390nmf

14、luo4 506nm 525nmcalcium green-1 507nm 530nm 190nmcalcium green-2 507nm 535nm 550nmfura red 420/480nm 637nm 140nmoregon green 488 494nm 520nm 20,000nmcalcium crimson 583nm 602nm 328nmindo-1 356nm 405/458nm 230nmfura-2 340/380 476nm 145nm相對測量df/f=(f-fbase)/(fbase-fbg)ca2+濃度絕對測量單波長公式法fluo3: 530nm kd=45

15、0nmca2+i =kd(f-fmin)/(fmax-f)fmin:細胞內(nèi)無鈣時的熒光強度(mncfmax：細胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強度(a23187)測量吋切記細胞內(nèi)靜息ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低(f值不低于40)細胞內(nèi)生理ca2+濃度值(10-8-10-7 m)細胞內(nèi)ca2+超載濃度值(基礎(chǔ)ca2+濃度的10倍左右)標準曲線法：根據(jù)儀器條件和負載條件，以不同02+濃度的buffer(egtaca2+)做標準曲線，橫軸為ca2+濃度，縱軸為熒光強度比例熒光的測量：雙波長(比例熒光：ratio) indo 1(360, 420/480), fura2(340/380,440)ca2+i

16、=kd(r-rmin)/(rmax-r)ff2/fs2細胞器的ca2+測量1. 線粒體內(nèi)游離ca2+測量fluo-3+tmrm(線粒體熒光探針，紅色)2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白與ca2+結(jié)合后發(fā)藍光用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，可測定亞細胞器內(nèi)的游離 ca2+變化冃前己商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核內(nèi)的游離ca2+,因生物發(fā) 光很弱不能使用confocal檢測細胞內(nèi)游離ca2+測量的應(yīng)用：鈣的特性1. 細胞內(nèi)外的電化學梯度103-104倍2. 細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣明顯升高3. 細胞內(nèi)鈣為細胞激活“開關(guān)”細胞

17、內(nèi)鈣的生理作用1. 肌肉的興奮收縮收縮偶聯(lián)2. 神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3. 學習記憶的增強4. 卵子受精5. 細胞分裂和再生6. 細胞調(diào)亡7. 細胞間通訊8. 細胞信號傳導(dǎo)9. dna合成10. 基因表達細胞內(nèi)鈣超載與疾病1. 高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病一胞內(nèi)鈣濃度異常2. 糖尿病、風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病一胞內(nèi)鈣濃度增高3. 人體缺鈣一骨鈣大量丟失，神經(jīng)細胞的鈣濃度增髙4. 老化和老年性癡呆神經(jīng)細胞內(nèi)鈣濃度增高細胞內(nèi)生理ca2+濃度值(10-8-10-7 m),細胞內(nèi)ca2+超載濃度值(基礎(chǔ)ca2+濃度的10倍 左右)八. 熒光漂 口恢復(fù)(frap: fluorescence recover

18、 after photobleaching)定義:經(jīng)熒光探針標記的細胞的某一區(qū)域一旦被高強度的激光照射后，熒光物質(zhì)的光化學結(jié)構(gòu) 被迫壞，熒光強度下降，且為不可逆的過程，但此處熒光強度會漸漸恢復(fù)，熒光強度和恢復(fù)的快慢和多少,代表周圍分子擴散的速率，或分子運動速度。r=(i2-11 /i0-i2)100%r熒光漂白恢復(fù)率：代表分子的運動速度應(yīng)用：細胞間通訊，細胞膜流動性，蛋白分子的運動九. 籠鎖解籠鎖的測量定義：籠鎖化合物全稱為光致不穩(wěn)定籠鎖化合物，為人工合成的用隱蔽基團修飾生物活性分 子的化合物，一旦被紫外光照射，兩者間的共價鍵兒解離而釋放出活性分子，這一光解作用 稱為解籠鎖?；\鎖化合物的種類：籠鎖的神經(jīng)遞質(zhì)、籠鎖的第二信使、籠鎖鈣等十.熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energytransfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一 個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。能量共振轉(zhuǎn)移：分子可以看作為正負電荷分離的一個偶極子，受激發(fā)以一定的頻率振動，如 果其附近有一個振動