基因工程和細(xì)胞工程整理后的知識(shí)點(diǎn)

1、專題1   基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃贒NA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫做DNA重組技術(shù).操作水平 :分子 原理:基因重組（一)基因工程的基本工具1.“分子手術(shù)刀”限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶)(1）來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的.（2）功能:能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開,因此具有專一性.(3）結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式:黏性

2、末端和平末端。2?！胺肿涌p合針”-DNA連接酶（1）兩種DNA連接酶（E·coliDNA連接酶和T4-DNA連接酶)的比較:相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵。區(qū)別:E·coliDNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體,只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)；而T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。（2）與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵.3?！胺肿舆\(yùn)輸車”-載體（1）載體具備的條件：能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)

3、,供外源DNA片段插入.具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇.(2）最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子.(3）其它載體： 噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒(二)基因工程的基本操作程序一基因的結(jié)構(gòu):基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段(注：RNA病毒為RNA），分為編碼區(qū)和非編碼區(qū).編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄出mRNA，原核生物中也就是能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段非編碼區(qū)：不能轉(zhuǎn)錄出mRNA,也不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段（）原核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)中存在調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列:編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，即啟動(dòng)子，可控制RNA聚合酶的結(jié)合。RNA聚

4、合酶是一種蛋白質(zhì)，能識(shí)別并結(jié)合調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn),能催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA編碼區(qū)下游有終止子,可控制RNA聚合酶的停止、脫落.（2)真核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)第一步：目的基因的獲取1.目的基因是指： 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 。2。原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成.人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法_和化學(xué)合成法_。3。PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1)原理：DNA雙鏈復(fù)制（2）過(guò)程：第一步:加熱至9095DNA解鏈；第二步：冷卻到5560,引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈;第三步:加熱至7075,熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。(3） 前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物.

5、（4) 條件：a。四種脫氧核苷酸b。DNA的兩條鏈為模板c.熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）d。一對(duì)引物(一小段單鏈DNA或RNA，一般2030個(gè)堿基，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)）e。溫度控制和緩沖液4. 從基因文庫(kù)中獲取目的基因:基本概念的理解:將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。將某種生物體內(nèi)的DNA全部提取出來(lái)，選用適當(dāng)?shù)南拗泼?，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后將這些片段分別與載體連接起來(lái)，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,每個(gè)受體菌都含有了一段不同的DNA片段。這個(gè)群體包含了這種生物的所有基因。這

6、種基因文庫(kù)叫基因組文庫(kù).有些基因文庫(kù)比較小，只包含了一種生物的一部分基因，這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù)，如cDNA文庫(kù)（用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA（也叫cDNA)片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，這個(gè)受體菌群體叫做這種生物cDNA文庫(kù)。）怎樣提取:根據(jù)目的基因有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列，基因的功能,基因在染色體的位置，基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因. 5 。 人工合成：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA,然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因轉(zhuǎn)錄成的

7、mRNA 單鏈DNA雙鏈DNA（目的基因)根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白質(zhì)中氨基酸的序列mRNA中的堿基序列DNA堿基序列目的基因目的基因第二步:基因表達(dá)載體的構(gòu)建1。目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.組成:目的基因啟動(dòng)子終止子標(biāo)記基因（1）啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì).（2）終止子:也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段 ，位于基因的尾端.（3）標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)

8、。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因.第三步:將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞_1。轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。2。常用的轉(zhuǎn)化方法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有 基因槍法和花粉管通道法等.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞:最常用的方法是 顯微注射技術(shù).此方法的受體細(xì)胞多是 受精卵。將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞:原核生物作為受體細(xì)胞的原因是繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，最常用的原核細(xì)胞是大腸桿菌 ，其轉(zhuǎn)化方法是:先用Ca2+處理細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸

9、收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過(guò)程.3。重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá).第四步：目的基因的檢測(cè)和表達(dá)1.首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子雜交技術(shù)。2.其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，方法是采用用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。3。最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的 抗體進(jìn)行抗原抗體雜交.4.有時(shí)還需進(jìn)行 個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。(三）基因工程的應(yīng)用1.植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。2。動(dòng)物

10、基因工程:提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物。3。基因治療:把正常的外源基因?qū)氩∪梭w內(nèi),使該基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮作用.（四)蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ),通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造,或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求.（基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)錄 翻譯專題2 細(xì)胞工程(一）植物細(xì)胞工程 ：細(xì)胞或細(xì)胞器水平的操作1。理論基礎(chǔ)(原理)：細(xì)胞全能性全能性表達(dá)的難易程度:受精卵生殖細(xì)胞干細(xì)胞體細(xì)胞；植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞2。植物組織培養(yǎng)技術(shù)(1）過(guò)程：離體的植物器官、組織或細(xì)胞(外植

11、體）愈傷組織 試管苗 植物體（2）用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn).A 植物繁殖微型繁殖：可以高效快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖作物脫毒:采用莖尖組織培養(yǎng)來(lái)除去病毒（因?yàn)橹参锓稚鷧^(qū)附近的病毒極少或沒(méi)有)人工種子：以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經(jīng)人工薄膜包裝得到的種子.優(yōu)點(diǎn)：完全保持優(yōu)良品種的遺傳特性，不受季節(jié)的限制;方便儲(chǔ)藏和運(yùn)輸B 作物新品種培育單倍體育種：a過(guò)程:植株（AaBb)通過(guò)減數(shù)分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四種類型)；對(duì)花粉進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)（技術(shù)是植物組織培養(yǎng))；得到單倍體植株;對(duì)其幼苗時(shí)期進(jìn)行秋水仙素處理;得到了

12、正常的純合二倍體植株(AABB、AAbb、aaBB、aabb四種類型）。b 優(yōu)點(diǎn):明顯縮短育種年限C 突變體利用：在組織培養(yǎng)中會(huì)出現(xiàn)突變體，通過(guò)從有用的突變體中選育出新品種（如篩選抗病、抗鹽、含高蛋白的突變體)D 細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn):通過(guò)能夠產(chǎn)生對(duì)人們有利的產(chǎn)物的細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，從而讓它們能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞產(chǎn)物.（3）地位:是培育轉(zhuǎn)基因植物、植物體細(xì)胞雜交培育植物新品種的最后一道工序.3。植物體細(xì)胞雜交技術(shù)（1）過(guò)程:注意：核融合標(biāo)志原生質(zhì)融合結(jié)束 再生壁形成標(biāo)志著雜種細(xì)胞形成 雜種植株形成標(biāo)志著植物體細(xì)胞雜交技術(shù)結(jié)束 目的 ： 為了獲得雜種植株原理：膜的流動(dòng)性和細(xì)胞全能性（2)誘導(dǎo)融合的方法：

13、物理法包括離心、振動(dòng)、電刺激等?；瘜W(xué)法一般是用聚乙二醇(PEG）作為誘導(dǎo)劑.（3）意義:克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙.（二)動(dòng)物細(xì)胞工程1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（1)概念：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng):動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖.原代培養(yǎng)定義：人們通常將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)定義：當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞處于接觸抑制后， 用胰蛋白酶處理，使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來(lái)，然后加入新的培養(yǎng)液,將細(xì)胞分離稀釋，并從原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，這個(gè)過(guò)程稱傳代培養(yǎng)。（分瓶培養(yǎng)的過(guò)程）細(xì)胞株：傳代細(xì)胞一般能傳到40-50代，遺傳物質(zhì)一般不

14、會(huì)發(fā)生改變,叫細(xì)胞株細(xì)胞系：傳代50代以后又出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，能連續(xù)傳代，獲得不死性,叫細(xì)胞系.細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別：細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變,具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制,容易傳代培養(yǎng).（2）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的流程：取動(dòng)物組織塊（動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的器官或組織）剪碎用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)貼滿瓶壁的細(xì)胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。（3）細(xì)胞貼壁和接觸抑制:懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。細(xì)胞數(shù)目不斷增多，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互抑制時(shí),細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)

15、象稱為細(xì)胞的接觸抑制。(4）原理：細(xì)胞增殖（5)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要滿足以下條件無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境：培養(yǎng)液應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌處理。通常還要在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素，以防培養(yǎng)過(guò)程中的污染。此外,應(yīng)定期更換培養(yǎng)液，防止代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害。營(yíng)養(yǎng)：合成培養(yǎng)基成分:糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等。通常需加入血清、血漿等天然成分。溫度：適宜溫度:哺乳動(dòng)物多是36。50.5；pH：7.27。4。氣體環(huán)境：95%空氣5CO2。O2是細(xì)胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。(5）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測(cè)有毒物質(zhì)、培養(yǎng)醫(yī)學(xué)研究的各種細(xì)胞。2。動(dòng)物體細(xì)胞

16、核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物（1）哺乳動(dòng)物核移植可以分為胚胎細(xì)胞核移植(比較容易）和體細(xì)胞核移植（比較難）。（2）選用去核卵（母）細(xì)胞的原因:卵（母)細(xì)胞比較大，容易操作；卵（母）細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)多,營(yíng)養(yǎng)豐富。卵母細(xì)胞培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期（3）體細(xì)胞核移植的大致過(guò)程是：(右圖）核移植胚胎移植(4）體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用：加速家畜遺傳改良進(jìn)程,促進(jìn)良畜群繁育;保護(hù)瀕危物種,增大存活數(shù)量；生產(chǎn)珍貴的醫(yī)用蛋白；作為異種移植的供體；用于組織器官的移植等。(5)體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問(wèn)題：克隆動(dòng)物存在著健康問(wèn)題、表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷等.3。動(dòng)物細(xì)胞融合(1)動(dòng)物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交,是指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成

17、一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程.融合后形成的具有原來(lái)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。(2）動(dòng)物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同，誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法與植物原生質(zhì)體融合的方法類似，常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。(3）動(dòng)物細(xì)胞融合的意義：克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性,成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段.（4)原理：膜的流動(dòng)性（5）為了獲得雜交細(xì)胞（6）動(dòng)物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交的比較：比較項(xiàng)目細(xì)胞融合的原理細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)手段用法植物體細(xì)胞雜交細(xì)胞膜的流動(dòng)性去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合離心、電刺激、振動(dòng)，聚乙二醇等試劑誘導(dǎo)克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性

18、，獲得雜種植株動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞膜的流動(dòng)性使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合除應(yīng)用植物細(xì)胞雜交手段外,再加滅活的病毒誘導(dǎo)制備單克隆抗體的技術(shù)之一4。單克隆抗體(1)抗體：一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體.從血清中分離出的抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差.(2)單克隆抗體的制備過(guò)程：注入小鼠細(xì)胞融合分離抗原注入小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)選擇培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)從腹水提取從培養(yǎng)液提取單克隆抗體（3)雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)：既能大量繁殖，又能產(chǎn)生專一的抗體。（4）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并能大量制備。（5）單克隆抗體的作用:作為診斷試劑：準(zhǔn)確識(shí)別各種抗原物質(zhì)的細(xì)微差異，并跟一

19、定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速的優(yōu)點(diǎn)。用于治療疾病和運(yùn)載藥物：主要用于治療癌癥治療，可制成“生物導(dǎo)彈"，也有少量用于治療其它疾病。專題三:胚胎工程1、精子的發(fā)生大體可以分為三個(gè)階段：精原細(xì)胞有絲分裂 分裂，發(fā)生在睪丸曲細(xì)精管。精原細(xì)胞(部分精原細(xì)胞仍然保持為精原細(xì)胞）滋長(zhǎng),完成 DNA復(fù)制和相關(guān)蛋白質(zhì) 合成，即進(jìn)行染色體復(fù)制復(fù)制。初級(jí)精母細(xì)胞（開始減數(shù)分裂 分裂） 由 中心體發(fā)育_減I分裂高爾基體次級(jí)精母細(xì)胞減分裂頭細(xì)胞核精（子）細(xì)胞_這是精子形成 線粒體鞘線粒體的第三個(gè)階段:精子 精細(xì)胞 精子 由細(xì)胞質(zhì)的其他部分發(fā)育2、卵子形成：胚胎在性別分化以后，雌性胎兒卵巢內(nèi)的 卵原細(xì)胞,通過(guò)有絲分裂,不斷增加數(shù)量，并經(jīng)DNA 復(fù)制和相關(guān) 蛋白質(zhì) 合成，即復(fù)制，滋長(zhǎng)，成為初級(jí)卵母細(xì)胞 細(xì)胞，這個(gè)細(xì)胞被卵泡 細(xì)胞包圍，成為 卵泡。即雌性胎兒在出生時(shí),已經(jīng)準(zhǔn)備好了所有的 初級(jí)卵母細(xì)胞(卵泡) .初級(jí)卵母細(xì)胞排卵：是指卵子從卵泡中排出,排出時(shí)是初級(jí)卵母細(xì)胞細(xì)胞（馬、犬）或者是 次級(jí)卵母細(xì)胞細(xì)胞（豬、羊).卵子形成過(guò)程中的減數(shù)分裂：減數(shù)第一次分裂在 排卵前后完成，產(chǎn)生一個(gè)次級(jí)卵母細(xì)胞 和第一極體,進(jìn)入輸卵管 ，減