本科畢業(yè)設(shè)計(論文)外文翻譯

1、華南理工大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計（論文）翻譯班 級 姓 名 學(xué) 號 指導(dǎo)教師 填表日期 中文譯名水溶性過度金屬咔咯配合物對DNA連接和氧化裂解的作用外文原文名DNA Binding and Oxidative Cleavage by a Water-soluble Carboxyl Manganese(III) Corrole外文原文版出處Chinese Journal of Chemistry,2013,Vol.31(10)譯 文： 吸收光譜，熒光光譜和CD光譜，以及粘度測量已經(jīng)研究了小牛胸腺DNA(ct-DNA)與錳的咔咯配合物5,10,15-三(4-羧基苯基)咔咯的相互作用。結(jié)果表明錳的咔咯配合

2、物通過外部溝與ct-DNA結(jié)合，該結(jié)合常數(shù)Kb為 4.67×104 Lmol1 。在多種氧化劑存在下，由MnIIITCPC作用，ct-DNA裂解作用也被研究。在過氧化氫或叔BuOOH存在下，MnIIITCPC可以以缺口和線性形式切割超螺旋質(zhì)粒pBR322，然而以KHSO5作為氧化劑卻并沒有觀察到核酸酶的活性。抑制劑試驗表明，羥基自由基，單線氧沒有參與MnIIITCPC為介質(zhì) 的DNA氧化裂解。在這種氧化裂解反應(yīng)中，氧代錳(V)的咔咯配合物是可能的活性中間體。關(guān)鍵詞：咔咯，錳，DNA聯(lián)接，核酸酶活性引言在自然中，經(jīng)由水解磷酸二酯是金屬酶催化的DNA高效裂解的途徑。在過去幾十年里，作為探

3、索生物醫(yī)藥的工具和抗癌藥物，旨在結(jié)合并切割DNA的過渡金屬配合物已被廣泛研究。卟啉及其金屬配合物在生命系統(tǒng)中無處不在并發(fā)揮了重要的作用，例如細胞色素P450，過氧化物酶和過氧化氫酶。為追求潛在的應(yīng)用，在光動力療法，腫瘤顯像，人工核酸酶中，許多水溶性卟啉，如陽離子型卟啉，磺化卟啉，羧酸卟啉已經(jīng)合成，它們中的一些甚至被用在臨床診斷和治療中。類似的研究已擴大到其他類似卟啉的分子。咔咯大環(huán)化合物與卟啉是有許多相似之處。咔咯金屬配合物的許多性能與卟啉的比較已經(jīng)引起了人們極大的興趣。 水溶性磺化咔咯及其金屬配合物的合成可以被視為咔咯在生物無機化學(xué)的最有價值的應(yīng)用。磺化咔咯可以與人血清白蛋白(HSA)和轉(zhuǎn)鐵

4、蛋白緊密結(jié)合，而且，它是白蛋白共軛鐵與錳配合物產(chǎn)生的一個非常簡單卻非常有效的仿生氧化系統(tǒng)。以前的工作證明，該磺化咔咯可以與小牛胸腺DNA(ct-DNA)通過外部結(jié)合模式綁定并且表現(xiàn)出氧化裂解或光切割pBR322DNA的活動。陽離子吡啶基取代咔咯形成另一個類水溶性咔咯。這種帶正電的咔咯可以穩(wěn)定G-四鏈體DNA并由于具有良好的核酸酶活性而表現(xiàn)出的與帶負電負的DNA更好的親和力，錳(III)配合物在KHSO5存在下與非雙螺旋區(qū)選擇性作用，并且能選擇性地靠近雙鏈DNA環(huán)形及凸起部位的鳥嘌呤。 羧基卟啉已明顯表現(xiàn)出與DNA結(jié)合和裂解的良好活性。與此相反，水溶性羧基咔咯化合物與DNA的相互作用仍未報道，而

5、且，由錳的咔咯配合物引起的DNA氧化裂解機制仍不清楚。本論文要闡述錳的咔咯配合物5,10,15-三(4-羧基苯基)咔咯及其與ct -DNA的相互作用，以及通過凝膠電泳實驗證明，在氧化劑的存在下，其對pBR322DNA的氧化裂解活性，所采用方法已顯示在方案1中。方案一 錳的5,10,15-三（4-羧基苯基）咔咯的合成實驗 所有購買的試劑，均為分析純并且未經(jīng)進一步純化而使用。小牛胸腺DNA買自Sigma-Aldrich，pBR322DNA購買自上海生工公司。三羥甲基甲氨(Trisbase)，溴化乙錠(EB)，氯化鈉，硼酸酸，二甲亞砜(DMSO)，30過氧化氫(H2O2)，瓊脂糖凝膠加樣緩沖液，和乙

6、二胺四乙酸(EDTA)均來自購買。所有水溶液由去離子水制備。小牛胸腺DNA的儲液（貯存于4和所用時間不超過5天），制備緩沖液I與ct- DNA溶液，ct-DNA的濃度根據(jù)其在260 nm處的吸光度和摩爾消光系數(shù)值(6600 M-1·cm-1)進行計算。若A260/A280介于1.8和1.9之間，說明該DNA溶液蛋白質(zhì)含量足夠低，無需做進一步處理。緩沖溶液I(5 mM Tris/ 50 mM NaCl, pH=7.2)，所有涉及到ct-DNA的實驗均在該溶液中進行。緩沖溶液II(50 mMTris/ 18 mM NaCl, pH= 7.4)，配合物的核酸酶活性研究反應(yīng)在此溶液中進行。緩

7、沖溶液III(89mM Tris/ 89 mM H3BO3/ 2 mM EDTA，pH =8.3)，凝膠的制備和電泳液均使用該TBE電泳緩沖溶液。物理測量 Hitachi(日立) 3900H 型紫外可見光譜儀；Hitachi(日立) F-4500熒光分光光度計；JASCO(日本分光) J-810圓二色光譜儀；烏氏粘度計；北京六一31-CN凝膠電泳儀；Bio-rad凝膠自動成像分析儀。5,10,15-三(4-甲氧基羰基-苯基)咔咯的合成 在250mL圓底燒瓶中加入200 mL 甲醇/ 水(體積比1 :1)，820 mg 4-(甲氧基羰基)苯甲醛(5mmol)和670 mg吡咯(10 mmol),

8、 完全溶解后加入2.1 mL 37% HCl(0.25mmol)溶液，室溫下攪拌反應(yīng)3 h； 反應(yīng)結(jié)束后用DCM萃取, 收集有機相并水洗3 次,用Na2SO4干燥后過濾, 加入1 g DDQ反應(yīng)45min。按照方法一中步驟純化，得純凈產(chǎn)物220 mg，產(chǎn)率達19%。UV-Vis (CH2Cl2) max: 420,581, 617,647 nm; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : 8.73(s, 4H), 8.59 (s, 6H), 8.45 (d, J12 Hz, 4H), 8.33 (s,4H), 8.18 (s, 2H), 3.37 (s, 9H); ESI-MS (T

9、HF, negative)m/z: 699.1 MH錳(III)的5,10,15-三（4-甲氧基羰基-苯基）咔咯的合成 將5,10,15-三（4-甲氧基羰基-苯基）咔咯（50毫克）溶于甲醇溶液（20毫升）中，混合物在乙酸錳四水合物（100毫克）存在下在回流下2小時。將反應(yīng)混合物冷卻，然后用CH2Cl2/ H 2 O（200毫升，1:1）洗滌。有機相收集并用去離子水洗滌兩次。將粗產(chǎn)物通過色譜法純化（堿性氧化鋁，CH2Cl2/ CH 3CN=100:5），通過氯仿/己烷結(jié)晶后得到綠色產(chǎn)物。產(chǎn)物產(chǎn)率為91%。UV-Vis (CH2Cl2) max: 414,427, 595, 648 nm; MS

10、(MALDI-TOF,negative) m/z:752.023 MH.錳（III）的5,10,15-三（4-羧基苯基）咔咯的合成 將上述合成的羧酸酯咔咯金屬配合物溶解在100 mL甲醇/ THF(2 :1)溶液中，加入6 mL40%的氫氧化鉀水溶液,在40下攪拌反應(yīng)，TLC檢測反應(yīng)進度，原料點完全消失后停止反應(yīng)，用5%鹽酸酸化后用THF/ DCM/ H2O(1:1:2)萃取,收集有機相并水洗3次，由Na2SO4干燥。減壓蒸餾后得到粗產(chǎn)物，以丙酮/正己烷(1:4)重結(jié)晶，得到純凈的5,10,15-三(4-羧基苯基) 咔咯金屬配合物，產(chǎn)率為87%。UV-Vis (Tris-HCl buffer

11、I, pH7.2)max: 402, 432, 656 nm; MS (MALDI-TOF, negative)m/z: 709.981 MH.DNA氧化裂解實驗紫外可見光譜顯示Mn(III) 咔咯配合物在Tris-鹽酸緩沖溶液是非常穩(wěn)定的，并且可以使用3天（圖S8）在緩沖溶液I中，Mn(III) 咔咯配合物吸收滴定使用3mL濃度為2×105molL1 的咔咯溶液，并且加入微升的ct-DNA溶液。連續(xù)加入DNA溶液并溫育5分鐘后，記錄其吸收值。熒光光譜測定了溴化乙錠（EB）-DNA系統(tǒng)的發(fā)光強度。在3mL含有5molL1 EB 溶液和30molL1 DNA溶液的混合溶液中加入微升的濃

12、縮咔咯配合物溶液，并進行熒光光譜測定。每次加入Mn(III) 咔咯配合物后記錄熒光光譜數(shù)據(jù)。所有樣本的激發(fā)光譜波長為370nm,發(fā)射光譜在500-700nm處記錄。ct-DNA（1.5×104 molL1）的圓二色光譜測定時，在25下，使用氮氣流吹掃旋光儀，在1cm比色皿中，測定不加入以及加入不同濃度Mn(III) 咔咯配合物 (r0, 0.1, 0.2, 0.5，其中r是Mn(III) 咔咯配合物與ct-DNA的摩爾比）的數(shù)值。CD光譜以500nm/min掃描220600 nm作為背景，之后所有樣品掃描后自動扣除該背景。CD光譜記錄三次掃描的平均值。ct-DNA的CD譜的記錄作為對

13、照實驗。 黏度測定時采用烏氏粘度計，測定時將烏氏粘度計浸沒在30.00.1的恒溫水浴槽中。加入不同濃度的混合溶液后(r0, 0.02, 0.04, 0.06,0.08,0.1,其中r是Mn(III) 咔咯配合物與ct-DNA的摩爾比），恒溫培育5min后，使用秒表測得ct-DNA溶液流動的5次時間并求平均值。所得的相對粘度以對咔咯與DNA組成的混合物進行分析，其中和分別為譯文成績（百分制）： 指導(dǎo)教師簽名： 年 月 日加入以及未加入樣品時的DNA相對黏度，對照樣品在EB溶液中以相同方法處理。 超螺旋pBR322DNA（0.1微克）的裂解反應(yīng)是在37，體積為10L的緩沖液II中進行的。pBR32

14、2DNA（0.1微克）的10微升混合以及，氧化劑和不同濃度的混合物在黑暗培育中30分鐘，然后加入2微升緩沖液。得到的反應(yīng)混合物通過瓊脂糖凝膠(1%)電泳進行分析，以70 V為參數(shù)電泳2 h后將凝膠放入EB (1 mg/L)中染色，用水沖洗去EB后放入凝膠成像系統(tǒng)中成像并分析。結(jié)果與討論DNA結(jié)合方式 吸收光譜研究 電子吸收光譜是最方便的為確定復(fù)合體和DNA之間結(jié)合的工具。DNA堿基對和芳香族發(fā)色團之間插入的結(jié)合方式通常導(dǎo)致較大的減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象。而外部結(jié)合的方式則會引起較小的減色現(xiàn)象和較弱的紅移。在ct-DNA存在下的Mn(III) 咔咯配合物的吸收光譜的變化如圖1 。在Mn(III) 咔咯

15、配合物溶液中加入ct-DNA導(dǎo)致7.6增色和一個小的紅移（從432至435納米）。這一結(jié)果表明Mn(III) 咔咯配合物與DNA的結(jié)合強弱為中等，二者應(yīng)該以外部結(jié)合的方式進行作用。 吸 收 率 波長/nm圖1 Mn(III) 咔咯配合物(2.0×105molL1)與ct-DNA相互作用的UV-Vis光譜(pH7.2,5 mmolL1 Tris-HCl and 50 mmolL1 NaCl緩沖溶液加入ct-DNA溶液濃度(1: 0; 2: 2.0×106; 3:4.0×106;4: 6.0×106; 5: 8.0×106; 6: 1.0×

16、;105; 7: 1.2×105;8: 1.4×105 molL1).箭頭方向是隨著ct-DNA溶液濃度增加吸收度變化Mn(III) 咔咯配合物與DNA的內(nèi)在結(jié)合常數(shù)Kb可以根據(jù)從增加在432 nm測定的吸光度的變化并使用吸收光譜滴定數(shù)據(jù)結(jié)合下列公式計算：式中，a是配合物與DNA結(jié)合時的摩爾消光系數(shù)，f和b分別為配合物未與DNA結(jié)合以及完全與DNA結(jié)合的摩爾消光系數(shù)。以DNA/ |af | 對DNA作圖，擬合直線的斜率與截距的比值即為結(jié)合常數(shù)Kb。經(jīng)計算，Mn(III) 咔咯配合物與DNA的內(nèi)在結(jié)合常數(shù)Kb 為4.67×104 Lmol1 。這一結(jié)合常數(shù)比錳的陽離

17、子咔咯配合物小，但要大于錳的磺化咔咯配合物。圖2 是DNA/|a-f |與DNA的關(guān)系圖 熒光光譜研究 無論與ct-DNA結(jié)合與否，錳咔咯配合物并未在熒光光譜窗口中觀察到明顯熒光現(xiàn)象，為了研究錳咔咯配合物與ct-DNA的結(jié)合，通過改變加入的咔咯配合物的濃度，進而測得EB-DNA系統(tǒng)的熒光發(fā)射光譜。單獨的EB是一個弱熒光試劑，但當(dāng)它與DNA結(jié)合后，其發(fā)射光譜強度會大大增加。當(dāng)一些小分子加入EB-DNA系統(tǒng)后，小分子可以取代EB，發(fā)光強度降低。EB與Mn(III) 咔咯配合物結(jié)合后引起的熒光猝滅示于圖4?？梢钥闯觯坏┘尤隡n(III) 咔咯配合物，發(fā)射強度將會減小，這意味著加入Mn(III) 咔

18、咯配合物將會釋放EB。根據(jù)經(jīng)典的Stern-Volmer方程：式中，I0 和I 分別代表EB-DNA自身熒光強度以及與咔咯結(jié)合時的熒光強度，Q代表配合物的濃度，以I0 / I對Q作圖,線性擬合的斜率即為KSV 。由圖四可知，MnIIITCPC的KSV為7.22×104 Lmol1。這一結(jié)果與電子滴定譜結(jié)果相同，這兩類實驗都證明MnIIITCPC與DNA以外部結(jié)合模式結(jié)合。 熒 光 強 度 a.u.波長/nm圖3. EB與ct-DNA結(jié)合的發(fā)射光譜(pH7.2,5 mmolL1 Tris-HCl and 50 mmolL1 NaCl緩沖溶液, r MnIIITCPC/DNA,EB5.0

19、 molL1, DNA30 molL1, ex370 nm)箭頭表示隨著MnIIITCPC濃度增加熒光強度的變化圖四 I0/I對咔咯濃度作的線性圖圓二色光譜研究 在化合物與DNA結(jié)合時，圓二色光譜是一種高效的探究DNA形態(tài)改變的方法。ct- DNA一般顯示兩個峰，由于右旋螺旋性導(dǎo)致在246納米產(chǎn)生負峰值；由于基堆疊，在272納米產(chǎn)生正峰值。在DNA與小分子作用時，其圓二色光譜的觀測值的改變通常與DNA結(jié)構(gòu)變化有關(guān)：簡單的外部溝結(jié)合方式和化合物的靜電作用對基堆疊（272nm）和螺旋性（246nm)并沒有明顯的作用；而內(nèi)部插入方式會加強兩個波段的強度并且穩(wěn)定ct-DNA右手B的構(gòu)型。一般說來，還原

20、卟啉與ct-DNA的結(jié)合會導(dǎo)致圓二色光譜的減弱，這一特性被用來檢驗還原卟啉與DNA的結(jié)合方式：負ICD帶證明是內(nèi)部插入結(jié)合，而正ICD帶證明是外部勾結(jié)合。而雙功能結(jié)合模式(又稱混合模式)，會產(chǎn)生一個正的ICD峰和一個負的ICD峰。隨MnIIITCPC濃度增加，DNA的圓二色光譜結(jié)果示于圖5。正峰和負峰都證明強度有明顯的減弱，并且當(dāng)MnIIITCPC濃度增加時，最大的峰值出現(xiàn)一個微小的紅移。然而，當(dāng)MnIIITCPC與DNA結(jié)合時，無論是正的還是負的ICD帶都沒有觀測到。這些結(jié)果強有力的證明了外部結(jié)合方式。圓二色光譜同時說明當(dāng)ct-DNA與MnIIITCPC結(jié)合時，其結(jié)構(gòu)并沒有明顯改變。 CD/

21、mdeg波長/nm圖5. ct-DNA(1.5×104 molL1)的圓二色光譜(pH7.2,5 mmolL1 Tris-HCl and 50 mmolL1 NaCl緩沖溶液, r MnIIITCPC/DNA),箭頭表示隨著MnIIITCPC濃度增加強度的變化 黏度研究 為了進一步說明ct-DNA與MnIIITCPC的結(jié)合方式，同時進行了黏度實驗，這是在沒有結(jié)晶以及NMR數(shù)據(jù)的情況下，最明確也是最重要的方法來確定DNA的結(jié)合方式。通常情況下，當(dāng)化合物以插入DNA時，DNA相鄰堿基對的距離會隨之變大，導(dǎo)致DNA雙螺旋伸長，使DNA溶液的粘度增大；相反的，當(dāng)化合物以部分插入模式與DNA

22、作用時， 可能會使DNA的雙螺旋發(fā)生扭結(jié),，反而會導(dǎo)致DNA溶液黏度減?。欢?dāng)小分子化合物以靜電、溝面結(jié)合等非插入方式與DNA 作用時，DNA溶液的黏度無明顯變化。當(dāng)加入MnIIITCPC后，DNA的黏度并沒有明顯變化（如圖6），這說明MnIIITCPC與DNA以外部方式結(jié)合，這與光譜的結(jié)論一致。此外，內(nèi)消旋四（4-羧基苯基）卟啉（TCPP）已被報道與ct-DNA通過外部溝模式結(jié)合，其中TCPP內(nèi)的羧基和DNA堿基對之間氫鍵起主要作用。結(jié)合實驗結(jié)果以及MnIIITCPC與TCPP結(jié)構(gòu)的相似性，我們推斷出MnIIITCPC與ct-DNA結(jié)合方式也是外部溝模型。圖6. ct-DNA溶液與EB溶液（

23、a）和不同濃度的MnIIITCPC（b）作用的相對粘度(pH7.2,5 mmolL1 Tris-HCl and 50 mmolL1 NaCl緩沖溶液)pBR322 DNA質(zhì)粒的氧化斷裂 我們都知道，在過氧化氫存在下，錳的咔咯以及卟啉配合物都能使DNA裂解。本文研究了在不同氧化劑存在下，例如過氧化氫，叔-BuOOH和KHSO5存在時，錳咔咯配合物的核酸酶活性研究。我們使用瓊脂糖凝膠電泳研究pBR322DNA質(zhì)粒的裂解反應(yīng)。DNA鏈的斷裂發(fā)生在一條鏈還是兩條鏈上會相應(yīng)形成圓形（形式II）或者直線（形式III）。這兩種形式會慢于完整的超螺旋形式（形式I）遷移，而圓形是遷移最慢的。圖7顯示了在過氧化氫

24、，叔-BuOOH和KHSO5等氧化劑存在時，加入MnIIITCPC后， pBR322 DNA質(zhì)粒的氧化斷裂。只有氧化劑（泳道2-4）和MnIIITCPC（泳道5）存在并未觀測到DNA的裂解，當(dāng)在DNA和過氧化氫或叔-BuOOH混合液中加入咔咯溶液后，從形式I和形式II可以看出DNA的裂解，同時，叔-BuOOH表現(xiàn)出更好的裂解活性（泳道6-7）。然而，加入KHSO5氧化劑后，并未發(fā)現(xiàn)DNA 裂解。 形式I 形式II圖7 加入不同氧化劑MnTCPC (15molL1)對pBR322 DNA (0.1 g) 的裂解結(jié)果(pH7.2，50 mmolL1 Tris-HCl and 18 mmolL1 N

25、aCl 緩沖液) .泳道1, DNA 對照;泳道2, DNAH2O2 (20 molL1); Lane 3, DNA叔-BuOOH (20 mmolL1); 泳道 4, DNA KHSO5 (150molL1); 泳道 5, DNAMnTCPC;泳道 6, DNAH2O2 (20mmolL1) MnTCPC; 泳道 7, DNA 叔-BuOOH (20mmolL1) MnTCPC; 泳道 8, DNA KHSO5 (150molL1)MnTCPC圖8顯示了在過氧化氫存在時，加入不同濃度MnTCPC后 pBR322 DNA質(zhì)粒的氧化斷裂情況。結(jié)果顯示隨著MnTCPC濃度增加形式增加（泳道4-8）

26、。當(dāng)叔BuOOH作氧化劑時也觀察到類似結(jié)果。有趣的是，在過氧化氫或叔-BuOOH存在時，當(dāng)MnIIITCPC的濃度達到30微摩爾L-1時，形式III出現(xiàn)。因此，該羧基錳咔咯在叔-BuOOH或過氧化氫作為氧化劑時可以有效地切割DNA。 形式I 形式 形式圖 8 在H2O2 (20 mmolL1)存在下,不同濃度MnTCPC對 pBR322 DNA (0.1 g) 的氧化裂解 (pH7.2，50 mmolL1 Tris-HCl and 18 mmolL1 NaCl 緩沖液). 泳道 1, DNA 對照; 泳道2, DNAH2O2; 泳道 3,DNAMnTCPC (30 molL1); 泳道 4,

27、DNA H2O2 MnTCPC (5 molL1); 泳道 5, DNAH2O2MnTCPC (15molL1); 泳道 6, DNAH2O2MnTCPC (30 molL1);泳道 7, DNA H2O2 MnTCPC (45 molL1); 泳道 8,DNAH2O2MnTCPC (60 molL1). 為了估計觀察到的線性化是否表示非隨機線性的過程，我們對雙鏈裂解進行了統(tǒng)計學(xué)計算。我們根據(jù)Poisson分布公式計算在反應(yīng)切段線性DNA和質(zhì)粒后單鏈斷裂(n1)和雙鏈斷裂(n2)的平均個數(shù)。根據(jù)FreiMnlder-Trumbo關(guān)系，通過隨機斷裂過程得到1個線型DNA至少需要120個超螺旋DN

28、A，n1/ n2越小表示配合物使DNA發(fā)生雙鏈斷裂的活性越高。MnTCPC的n1/ n2值在10-16之間變化（表S1），說明是一個非隨機斷裂過程。由于MnIIITCPC的羧基與DNA的堿基對之間的氫鍵作用，在發(fā)生一次斷裂后配合物分子仍然停留在斷裂位置的附近，并催化下一次裂解反應(yīng)的進行。在這種情況下，MnIIITCPC的活化起了重要作用。為了探究裂解機制，我們使用更多的添加劑進一步實驗。加入DMSO（二甲亞砜）、叔丁醇、羥基自由基（OH）對DNA裂解影響很小。 NaN3和L組氨酸會限制DNA裂解，單態(tài)氧(1O2)的作用也可以忽略不計。這些結(jié)果有力地表明該DNA裂解機制與任何羥基自由基或單線態(tài)氧

29、無關(guān)。 形式I 形式圖 9 在H2O2 (20 mmolL1)存在下,MnTCPC(15molL1)對 pBR322 DNA (0.1 g) 的氧化裂解 (pH7.2,50 mmolL1 Tris-HCl and 18 mmolL1 NaCl 緩沖液).泳道 1, DNA 對照;泳道2, DNAH2O2; 泳道 3, DNAMnIIITCPC; 泳道 4, DNAH2O2MnIIITCPC ; 泳道 5, DNAH2O2MnIIITCPCDMSO (500 molL1); 泳道6, DNAH2O2MnTCPC叔-BuOH (500 molL1); 泳道 7, DNAH2O2MnTCPCNaN3 (50 mmolL1); 泳道 8, DNAH2O2Mn