蛋白樣本制備與Western

1、蛋白樣本制備與蛋白樣本制備與Western BlotWestern Blot北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司2主要內(nèi)容主要內(nèi)容123成功的成功的 Western Blot645北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司3一一 蛋白樣本制備蛋白樣本制備-成功蛋白分析的基礎(chǔ)成功蛋白分析的基礎(chǔ)蛋白樣本蛋白樣本activity assaysprotein microarraysSDS-PAGEimmunoblottingmass spectrometry/IEFEMSAEL

2、ISA蛋白樣本制備的目的蛋白樣本制備的目的: 后續(xù)應(yīng)用后續(xù)應(yīng)用北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司4二二 蛋白樣本制備的原則蛋白樣本制備的原則蛋白樣本制備原則方法應(yīng)具備標(biāo)準(zhǔn)化，具有重現(xiàn)性方法應(yīng)具備標(biāo)準(zhǔn)化，具有重現(xiàn)性 、可靠性、簡便性；、可靠性、簡便性；盡量抽提完全；盡量抽提完全；應(yīng)使所有蛋白全部處于溶解狀態(tài)應(yīng)使所有蛋白全部處于溶解狀態(tài)防止發(fā)生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止發(fā)生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止在抽提過程中發(fā)生化學(xué)修飾防止在抽提過程中發(fā)生化學(xué)修飾如做如做2D則需去除高豐度蛋白或無關(guān)蛋白則需去除高豐度蛋白或無關(guān)蛋白必

3、要時去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白必要時去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司5二二 蛋白樣本制備的策略蛋白樣本制備的策略制備蛋白的目的制備蛋白的目的活性分析 免疫印跡雜交 免疫沉淀或共沉淀1D 2D EMSA CHIP等實驗材料實驗材料 細(xì)胞 組織 固定組織或石蠟包埋組織 微生物 酵母 植物 提取RNA后的剩余的蛋白樣本等目的蛋白的結(jié)性質(zhì)目的蛋白的結(jié)性質(zhì)與分布與分布分布于胞槳/胞核/膜 可溶/不可溶 含量多少 分子量大小 四級結(jié)構(gòu)特征 磷酸化等修飾方法的選擇方法的選擇 1 自行配制抽提試劑,根據(jù)文

4、獻(xiàn)方法或經(jīng)驗提取 2 購買商品化試劑盒,按其說明書的方法提取北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司6三三 案例分析案例分析- - 細(xì)胞中總蛋白的制備細(xì)胞中總蛋白的制備裂解樣品離心收集定量檢測北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司7細(xì)胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技術(shù)要點表面活性劑表面活性劑緩沖液緩沖液蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑磷酸酶抑制劑磷酸酶抑制劑其它：其它：H2O、NaCl、等、等還原劑還原劑RIPA Buffer北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為

5、世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司8細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術(shù)要點的配方分析及技術(shù)要點 緩沖液緩沖液Tris-HCl（pH7.5),提供提供pH環(huán)境，使蛋白保持穩(wěn)定，環(huán)境，使蛋白保持穩(wěn)定，增加溶解性增加溶解性。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司9細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術(shù)要點的配方分析及技術(shù)要點溶解膜與脂膜，溶解與穩(wěn)定蛋白質(zhì)（特別是膜蛋白）溶解膜與脂膜，溶解與穩(wěn)定蛋白質(zhì)（特別是膜蛋白

6、）分為離子型（如分為離子型（如SDS、脫氧膽酸鹽等）和非離子型（、脫氧膽酸鹽等）和非離子型（如如NP-40、Triton-100、tween系列等）。系列等）。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司10各類表面活性劑特點各類表面活性劑特點 1 陰離子型陰離子型: SDS 脫氧膽酸鹽 2 陽離子型陽離子型: CPB和CTAB 3 雙性離子型雙性離子型: CHAPS Zwittergent系列 4 非離子型非離子型: Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世

7、紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司11選用表面活性劑考慮的因素選用表面活性劑考慮的因素參考文獻(xiàn)報告保持生物活性時使用的表面活性劑參考文獻(xiàn)報告保持生物活性時使用的表面活性劑選選用用表表面面活活性性劑劑考考慮慮的的因因素素工作條件下表面活性劑的溶解性工作條件下表面活性劑的溶解性使用分子生物學(xué)級的表面活性劑使用分子生物學(xué)級的表面活性劑,無核酸酶蛋白酶等無核酸酶蛋白酶等根據(jù)樣本下游的應(yīng)用來選擇表面活性劑的種類根據(jù)樣本下游的應(yīng)用來選擇表面活性劑的種類考慮表面活性劑的去除方法考慮表面活性劑的去除方法表面活性劑的純度影響提取蛋白的質(zhì)量表面活性劑的純度影響提取蛋白的質(zhì)量保護蛋白活性

8、時保護蛋白活性時,不僅考慮表面活性劑的種類還有濃度不僅考慮表面活性劑的種類還有濃度盡量使用毒性較低的表面活性劑盡量使用毒性較低的表面活性劑因不明原因某些蛋白適用專門的表面活性劑進行分離因不明原因某些蛋白適用專門的表面活性劑進行分離使用非表面活性劑使用非表面活性劑NDSB結(jié)合表面活性劑來增加膜蛋白溶解性結(jié)合表面活性劑來增加膜蛋白溶解性有時比較難僅一種表面活性劑既能溶解蛋白又適用于蛋白分析有時比較難僅一種表面活性劑既能溶解蛋白又適用于蛋白分析,常先用一種表面活性劑將蛋白溶解常先用一種表面活性劑將蛋白溶解,而另一種表面活性劑取代進而另一種表面活性劑取代進行蛋白的后續(xù)分析行蛋白的后續(xù)分析北京康為世紀(jì)生

9、物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司12去除未結(jié)合的表面活性劑去除未結(jié)合的表面活性劑1疏水吸附方法疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption 2透析法透析法 Dialysis3凝膠層析法凝膠層析法 Gel Chromatography4離子交換層析離子交換層析Ion-exchange Chromatography 根椐表面活性劑的疏水性根椐表面活性劑的疏水性,CMC,凝聚數(shù)目凝聚數(shù)目,和電荷等性質(zhì)來去除和電荷等性質(zhì)來去除. 北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司1

10、3細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術(shù)要點的配方分析及技術(shù)要點蛋白蛋白酶抑酶抑制劑制劑抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前臨抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前臨時加入時加入北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司14蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司15細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術(shù)要點的配方分析及技術(shù)要點磷酸磷酸酶抑酶抑制劑制劑抑

11、制磷酸酶的活化，防止蛋白樣本脫磷酸化，使抑制磷酸酶的活化，防止蛋白樣本脫磷酸化，使用前臨時加入。用前臨時加入。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司16磷酸酶抑制劑選擇磷酸酶抑制劑選擇 磷酸酶主要包括非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶，磷酸酶主要包括非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶，酸性磷酸酶），特異性的絲氨酸酸性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（例如：蘇氨酸磷酸酶（例如：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。）。 常規(guī)的抑制劑主要包括：常規(guī)的抑制劑主要包括： 試劑

12、名稱試劑名稱抑制作用抑制作用氟化鈉氟化鈉酸性磷酸酶，絲氨酸酸性磷酸酶，絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶蘇氨酸磷酸酶正釩酸鈉正釩酸鈉堿性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶堿性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸鈉焦磷酸鈉絲氨酸絲氨酸-蘇氨酸磷酸蘇氨酸磷酸 北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司17細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術(shù)要點的配方分析及技術(shù)要點防止蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，保護二硫鍵。防止蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，保護二硫鍵。DTT、 巰基乙醇等。巰基乙醇等。.北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理

13、 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司18細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術(shù)要點的配方分析及技術(shù)要點水；溶劑水；溶劑NaCl：北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司19全蛋白抽提時注意事項全蛋白抽提時注意事項可以適量加入甘可以適量加入甘油油,穩(wěn)定蛋白穩(wěn)定蛋白注意事項注意事項可以適量加入可以適量加入Benzonase /DNase I等核酸等核酸酶酶,去除去除DNA,充充分提取蛋白分提取蛋白,降降低提取的粘度低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷抑制蛋白酶及磷酸酶酸酶使用的使用的Deter

14、gent的種的種類類 純度純度 濃度濃度 干干擾擾 去除等因素去除等因素Temperature 試劑和器皿冰上試劑和器皿冰上預(yù)冷預(yù)冷,低溫低溫4操操作作細(xì)胞或組織的樣細(xì)胞或組織的樣本量本量裂解液的用量裂解液的用量北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司20細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術(shù)要點的配方分析及技術(shù)要點北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司21四四 蛋白樣本制備產(chǎn)品選擇指南蛋白樣本制備產(chǎn)品選擇指南北京康為世紀(jì)生

15、物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司22核蛋白樣本制備核蛋白樣本制備抽提原理低滲裂解細(xì)胞膜,釋放出胞漿蛋白與胞核;離心分離出胞核;高滲破裂胞核,釋放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,釋放出DNA結(jié)合蛋白(組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子)實驗注意事項試劑和器皿冰上預(yù)冷裂解液的用量細(xì)胞總量抑制蛋白酶蛋白酶抑制劑北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司23膜蛋白樣本制備膜蛋白樣本制備北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司24膜蛋白的抽提

16、v 方法及原理方法及原理 方法多 直接抽提法 分級抽提法 1:先機械法等非表面活性劑方法裂解細(xì)胞,再用表面活性劑抽提 2:按溶解性分級抽提 3:按亞細(xì)胞分級抽提 v 產(chǎn)物產(chǎn)物 細(xì)胞膜蛋白 細(xì)胞器質(zhì)膜蛋白v 注意事項注意事項 根椐膜蛋白種類和后續(xù)研究目的的不同,選擇不同的產(chǎn)品或表面活性劑變性劑等. 抑制蛋白酶. 樣本量北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司25膜蛋白的直接提取膜蛋白的直接提取北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司26蛋白的分級提取蛋白的分級提取 按蛋白溶

17、解度不同進行分級抽提按蛋白溶解度不同進行分級抽提,降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)第一步：用非表面活性劑溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第一步：用非表面活性劑溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白提取高疏水性蛋白(膜蛋白膜蛋白)；第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。）。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河

18、南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司27亞細(xì)胞分級抽提亞細(xì)胞分級抽提v 用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進行溶解。當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進行溶解。其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對分離的蛋白復(fù)雜性，而且可對分離的蛋白質(zhì)進行亞細(xì)胞定位。但該法需質(zhì)進行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。性。v 根椐胞漿根椐胞漿/胞膜胞膜/胞核胞核/骨架骨架蛋白的亞細(xì)胞策略用不同蛋白的亞細(xì)胞策略用不同提取液逐級溶解提取液逐級溶解北京康為世紀(jì)生物科技

19、河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司28四種亞細(xì)胞組分分離提取的結(jié)果四種亞細(xì)胞組分分離提取的結(jié)果北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司29線粒體蛋白樣本制備線粒體蛋白樣本制備v 首先用密度梯度離心方法分別分離首先用密度梯度離心方法分別分離出線粒體出線粒體,胞質(zhì)胞質(zhì),胞核胞核.v 再用線粒體抽提再用線粒體抽提Buffer溶解線粒體溶解線粒體蛋白蛋白.北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司30蛋白抽提產(chǎn)品蛋白抽提產(chǎn)品v哺乳動物

20、蛋白抽提試劑盒哺乳動物蛋白抽提試劑盒（CW0002）v組織蛋白抽提試劑盒組織蛋白抽提試劑盒（CW0004）v真核膜蛋白抽提試劑盒真核膜蛋白抽提試劑盒（CW0005）v細(xì)菌蛋白抽提試劑盒細(xì)菌蛋白抽提試劑盒（CW0001）v酵母蛋白抽提試劑盒酵母蛋白抽提試劑盒（CW0003）v植物蛋白抽提試劑盒植物蛋白抽提試劑盒（CW2033）vNc-細(xì)胞核細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒漿蛋白抽提試劑盒（CW0006）北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司31五五 蛋白定量產(chǎn)品選擇指南蛋白定量產(chǎn)品選擇指南北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河

21、南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司32BCABCA法蛋白定量法蛋白定量（CW0014CW0014） BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白質(zhì)定量方法。）是理想的蛋白質(zhì)定量方法。該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對不同種類蛋白質(zhì)檢測的該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對不同種類蛋白質(zhì)檢測的變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白將是，在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為還原為Cu+，Cu+與與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物，測定其在試劑形成紫色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收處的吸收值，并與標(biāo)

22、準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細(xì)胞裂解實驗中，低濃度的去垢劑在組織細(xì)胞裂解實驗中，低濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測結(jié)果，但螯合劑（不影響檢測結(jié)果，但螯合劑（EDTA，EGTA）、還原劑（）、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類會對檢測結(jié)，巰基乙醇）和脂類會對檢測結(jié)果有一定影響。實驗中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身果有一定影響。實驗中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用背景值較高，可試用Br

23、adford法測定蛋白濃度。法測定蛋白濃度。 北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司33BradfordBradford法法蛋白定量蛋白定量（CW0013CW0013） 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（染料的最大吸收峰的位置（lmax），由），由465nm變?yōu)樽優(yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特

24、別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。測定快速、簡便，只需加一種芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏分鐘即可完成，其顏色可以在色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至分鐘至20分鐘之間，分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族顏色的穩(wěn)定性最好。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測法用于不同蛋白質(zhì)

25、測定時有較大的偏差。去污劑、定時有較大的偏差。去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫、十二烷基硫酸鈉（酸鈉（SDS）干擾此法的測定。）干擾此法的測定。 北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司34LoweryLowery法蛋白定量法蛋白定量（CW0015CW0015） Lowry法蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是法蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵應(yīng)用最廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 Folin酚試劑中的

26、磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽磷磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，缺度與蛋白的量成正比。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是點是費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司

27、鄭州森斯科貿(mào)有限公司35六六 成功的成功的Western BlotWestern BlotDiagram通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進行檢測，蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白 原理原理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司36六六 成功的成功的Western BlotWestern Blot二抗孵育二抗孵育蛋白提取與定量蛋白提取與定量一一抗孵育抗孵育封閉封閉

28、轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜SDS-PAGE蛋白變性蛋白變性顯影顯影北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司37蛋白變性蛋白變性蛋蛋白質(zhì)白質(zhì)-SDS膠束膠束加入Sample buffer沸水浴5min北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司38SDS-PAGESDS-PAGE產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠加速劑加速劑催化劑催化劑單體單體交聯(lián)劑交聯(lián)劑四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）過硫酸胺或核黃素（過硫酸胺或核黃素（AP）甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙

29、丙烯酰胺（Bis）北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司39SDS-PAGESDS-PAGE 作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠濃縮膠使蛋白樣品濃縮使蛋白樣品濃縮PH6.8Tris-ClPH6.8Tris-Cl 低，低，2-5%2-5%分離膠分離膠使蛋白樣品分離使蛋白樣品分離PH8.8Tris-ClPH8.8Tris-Cl 高，根據(jù)蛋白高，根據(jù)蛋白大小大小電泳緩沖液：電泳緩沖液：PH8.3Tris-PH8.3Tris-甘氨酸甘氨酸-SDS-SDS系統(tǒng)系統(tǒng)。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司

30、鄭州森斯科貿(mào)有限公司40SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠最佳分離范圍聚丙烯酰胺凝膠最佳分離范圍不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司41聚丙烯酰胺分離膠配方聚丙烯酰胺分離膠配方北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司42SDS-PAGESDS-PAGE灌制分離膠 隔絕空氣灌好后一般室溫放置灌好后一般室溫放置3040分鐘分鐘北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭

31、州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司43SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃縮膠配方聚丙烯酰胺凝膠濃縮膠配方北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司44SDS-PAGESDS-PAGE灌制積層膠灌制積層膠 插入梳子插入梳子北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司45SDS-PAGESDS-PAGE膠制備注意事項膠制備注意事項v過硫酸銨一般現(xiàn)配現(xiàn)用，如連續(xù)實驗可在過硫酸銨一般現(xiàn)配現(xiàn)用，如連續(xù)實驗可在4度放度放置置23天。配制天。配制30丙烯酰胺儲存液要過濾。丙烯酰胺儲存液要過

32、濾。v配制過程中每加入一種試劑要充分混勻，防止膠配制過程中每加入一種試劑要充分混勻，防止膠出現(xiàn)濃度不均的情況。出現(xiàn)濃度不均的情況。v要根據(jù)溫度調(diào)整要根據(jù)溫度調(diào)整TEMED的使用量。的使用量。v水封的時候水要慢慢加入，太快會導(dǎo)致膠面不平。水封的時候水要慢慢加入，太快會導(dǎo)致膠面不平。v插梳子的時候要用力均勻，一次成型。插梳子的時候要用力均勻，一次成型。v在上樣前可在上樣前可20V恒壓預(yù)電泳恒壓預(yù)電泳20分鐘，可去除泳道分鐘，可去除泳道中的雜質(zhì)。中的雜質(zhì)。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司46上樣及電泳上樣及電泳v提前將樣品沸水浴提

33、前將樣品沸水浴5分鐘，分鐘，1200014000rpm離心離心5分鐘。分鐘。v根據(jù)自己的設(shè)計上樣。根據(jù)自己的設(shè)計上樣。v80V恒壓跑濃縮膠。恒壓跑濃縮膠。v看溴酚藍(lán)壓縮成一條線后把電壓調(diào)為看溴酚藍(lán)壓縮成一條線后把電壓調(diào)為100V。v當(dāng)溴酚藍(lán)跑至離膠的下面還有當(dāng)溴酚藍(lán)跑至離膠的下面還有0.40.6mm時停止電泳。時停止電泳。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司47轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，凝膠在負(fù)極一側(cè)，膜在正極蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，凝膠在負(fù)極一側(cè)，膜在正極一側(cè)，接通電源以后，蛋白質(zhì)由負(fù)極向正極轉(zhuǎn)移一側(cè)，接通電源以后，蛋白質(zhì)由負(fù)極向正極

34、轉(zhuǎn)移至膜上。至膜上。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司48轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司49轉(zhuǎn)膜注意事項轉(zhuǎn)膜注意事項v PVDF膜要預(yù)先用甲醇活化；膜要預(yù)先用甲醇活化；NC膜要預(yù)先泡水，除去中間的氣泡。然膜要預(yù)先泡水，除去中間的氣泡。然后在轉(zhuǎn)膜也中平衡后在轉(zhuǎn)膜也中平衡20分鐘。分鐘。v 膜、膠、濾紙夾好后要將中間的氣泡全部趕出來，否則有氣泡的地方膜、膠、濾紙夾好后要將中間的氣泡全部趕出來，否則有氣泡的地方就會斷路，蛋白無法轉(zhuǎn)到膜上。就會斷路，蛋白無

35、法轉(zhuǎn)到膜上。v 轉(zhuǎn)膜要在冰浴中進行，防止散熱量太大導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜溫度過高。轉(zhuǎn)膜要在冰浴中進行，防止散熱量太大導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜溫度過高。v 根據(jù)蛋白分子量大小選擇適合的轉(zhuǎn)膜條件。根據(jù)蛋白分子量大小選擇適合的轉(zhuǎn)膜條件。分子量（分子量（kd）轉(zhuǎn)膜條件轉(zhuǎn)膜條件200同上，可在轉(zhuǎn)膜液中加同上，可在轉(zhuǎn)膜液中加0.1SDS北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司50膜的封閉膜的封閉 為避免膜與作為檢測試劑的特異性第為避免膜與作為檢測試劑的特異性第一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結(jié)合位點進行封景提高，

36、需對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理閉處理,一般用一般用5的脫脂奶粉或者的脫脂奶粉或者3的的BSA室溫或室溫或37度封閉度封閉2小時。小時。北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司51轉(zhuǎn)好蛋白的膜轉(zhuǎn)好蛋白的膜ProteinProtein北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司52封閉封閉ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agent北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限

37、公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司53一抗孵育一抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary Antibody北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司54二抗孵育二抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondary Antibody北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司55顯影

38、顯影ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondaryAntibodyEnzyme (E)sssssPPPP Substrate北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司56顯色方法顯色方法- HRP- HRP酶促底物直接顯色酶促底物直接顯色北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司57顯色方法顯色方法化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光cECL低背景(CW0048)eECL高靈敏型(

39、CW0049)主要優(yōu)點適用于HRP檢測的最靈敏的化學(xué)發(fā)光底物適用于HRP檢測的最靈敏的化學(xué)發(fā)光底物檢測下限10-12g10-15g 信號持續(xù)時間8小時8小時首選檢測方法成像設(shè)備或X膠片成像設(shè)備或X膠片建議一抗稀釋度0.2ug-1ug/ml50ng-1ug/ml建議二抗稀釋度10ng-50ng/ml5ng-50ng/ml產(chǎn)品保存期室溫1年41年建議印跡膜硝化纖維或PVDF硝化纖維或PVDF北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司58成功的要素成功的要素1質(zhì)優(yōu)量足的蛋白樣本質(zhì)優(yōu)量足的蛋白樣本2科學(xué)的對照科學(xué)的對照3正確的抗體選擇正確的抗

40、體選擇 保存和使用保存和使用4細(xì)致的實驗操作細(xì)致的實驗操作5步步監(jiān)測步步監(jiān)測北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司59科學(xué)的對照科學(xué)的對照v 蛋白蛋白Marker：預(yù)染或非預(yù)染各種分子量的蛋白，用于標(biāo)示電泳中蛋：預(yù)染或非預(yù)染各種分子量的蛋白，用于標(biāo)示電泳中蛋白的大小和示蹤白的大小和示蹤v 陽性對照：目的蛋白或明確表達(dá)目的蛋白的組織或細(xì)胞的蛋白提取物，陽性對照：目的蛋白或明確表達(dá)目的蛋白的組織或細(xì)胞的蛋白提取物，用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性/特別是一抗的質(zhì)量和特別是一抗的質(zhì)量和效率

41、效率v 陰性對照：非目的蛋白或明確不表達(dá)目的蛋白組織或細(xì)胞的蛋白提取陰性對照：非目的蛋白或明確不表達(dá)目的蛋白組織或細(xì)胞的蛋白提取物，用于檢驗抗體的特異性物，用于檢驗抗體的特異性v 二抗對照：不加一抗，用于檢驗二抗的特異性二抗對照：不加一抗，用于檢驗二抗的特異性v 內(nèi)參對照：管家基因編碼的、很多組織和細(xì)胞中都穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，內(nèi)參對照：管家基因編碼的、很多組織和細(xì)胞中都穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，用于檢測整個用于檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測實驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測目的蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)對照目的蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)對照v 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉

42、的效果空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司60蛋白蛋白MarkerMarker中分子量中分子量CW0142可視型中分子量可視型中分子量CW0139藍(lán)色預(yù)染中分子量藍(lán)色預(yù)染中分子量CW0140可視型藍(lán)色預(yù)染中分子量可視型藍(lán)色預(yù)染中分子量CW0141彩虹預(yù)染中分子量彩虹預(yù)染中分子量CW0177Western中分子中分子量量CW0021Western中低分子中低分子量量CW2014北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿(mào)有限公司鄭州森斯科貿(mào)有限公司61WBWB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)antibody AC-15 (ab6276) at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per laneLane 1 : HeLa nuclearLane 2 : HeLa whole cell lysateLane 3 : A431 cell lysateLane 4 : Jurkat cell lysateLane 5 : HEK293 cell lysate.WB內(nèi)參對照內(nèi)參對照CW0081北京康為世紀(jì)生物科技河南總代理北京康為世紀(jì)生物科技河南總