第五章工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的分離篩選

1、第第五五章章 工業(yè)微生物產(chǎn)生菌工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的分離篩選的分離篩選v第一節(jié)第一節(jié) 含微生物樣品的采集含微生物樣品的采集 v第二節(jié)第二節(jié) 含微生物樣品的富集含微生物樣品的富集培養(yǎng)培養(yǎng) v第三節(jié)第三節(jié) 好養(yǎng)好養(yǎng)微生物的分離微生物的分離 v第四節(jié)第四節(jié) 厭氧微生物的分離厭氧微生物的分離v第五節(jié)第五節(jié) 野生型菌株的篩選和野生型菌株的篩選和菌株菌株鑒定鑒定v第六節(jié)第六節(jié) 極端環(huán)境微生物的分離篩選極端環(huán)境微生物的分離篩選v第七節(jié)第七節(jié) 生物可降解塑料菌株的分離篩選生物可降解塑料菌株的分離篩選v 菌株分離（菌株分離（sepsepa arationration）就是將一個(gè)混雜著各）就是將一個(gè)混雜著各種微生物的

2、樣品通過分離技術(shù)區(qū)分開，并按照實(shí)種微生物的樣品通過分離技術(shù)區(qū)分開，并按照實(shí)際要求和菌株的特性采取迅速、準(zhǔn)確、有效的方際要求和菌株的特性采取迅速、準(zhǔn)確、有效的方法對(duì)它們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需的微生法對(duì)它們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需的微生物的過程。物的過程。v工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的篩選一般包括兩大部分：一工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的野生型菌株進(jìn)一步純化并野生型菌株進(jìn)一步純化并進(jìn)進(jìn)行代謝產(chǎn)物鑒別。行代謝產(chǎn)物鑒別。菌種是發(fā)酵工業(yè)的關(guān)鍵菌種是發(fā)酵工業(yè)的關(guān)鍵v菌種可從以下幾個(gè)途徑進(jìn)行收集和篩選：菌種可從以

3、下幾個(gè)途徑進(jìn)行收集和篩選： （1 1）向菌種保藏機(jī)構(gòu)和個(gè)人索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。向菌種保藏機(jī)構(gòu)和個(gè)人索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。 國際承認(rèn)的培養(yǎng)物保藏單位國際承認(rèn)的培養(yǎng)物保藏單位 保藏單位保藏單位(簡稱簡稱) 所在國家所在國家 保藏范圍保藏范圍澳大利亞國家分析試驗(yàn)室澳大利亞國家分析試驗(yàn)室(AGAL) 澳大利亞澳大利亞 微生物菌種微生物菌種比利時(shí)微生物保藏中心比利時(shí)微生物保藏中心(BCCM) 比利時(shí)比利時(shí) 大部分微生物菌種大部分微生物菌種保加利亞菌種保藏庫保加利亞菌種保藏庫(NBIMCC) 保加利亞保加利亞 微生物菌種微生物菌種中國典型培養(yǎng)物保藏中心中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CC

4、TCC) 中國中國 幾乎所有的培養(yǎng)物幾乎所有的培養(yǎng)物中國普通微生物菌種保藏中心中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC) 中國中國 普通菌種普通菌種捷克微生物保藏所捷克微生物保藏所(CCM) 捷克捷克 普通微生物菌種普通微生物菌種法國微生物保藏中心法國微生物保藏中心(CNCM) 法國法國 幾乎所有的培養(yǎng)物幾乎所有的培養(yǎng)物德國微生物保藏中心德國微生物保藏中心(DSM) 德國德國 普通微生物菌種普通微生物菌種匈牙利國家農(nóng)業(yè)和匈牙利國家農(nóng)業(yè)和 工業(yè)微生物保藏中心工業(yè)微生物保藏中心(NCAIM) 匈牙利匈牙利 工業(yè)菌種工業(yè)菌種 日本國家生命科學(xué)日本國家生命科學(xué) 和人類技術(shù)研究所和人類技術(shù)研究所(NIBH

5、) 日本日本 幾乎所有的培養(yǎng)物幾乎所有的培養(yǎng)物荷蘭真菌保藏所荷蘭真菌保藏所(CBS) 荷蘭荷蘭 真菌類真菌類韓國細(xì)胞系研究聯(lián)盟韓國細(xì)胞系研究聯(lián)盟(KCLRF) 韓國韓國 動(dòng)植物細(xì)胞系動(dòng)植物細(xì)胞系韓國微生物保藏中心韓國微生物保藏中心(KCCM) 韓國韓國 微生物菌種微生物菌種韓國典型培養(yǎng)物保藏中心韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC) 韓國韓國 培養(yǎng)物培養(yǎng)物俄羅斯微生物保藏中心俄羅斯微生物保藏中心(VKM) 俄羅斯俄羅斯 工業(yè)微生物工業(yè)微生物俄羅斯科學(xué)院微生物理化所俄羅斯科學(xué)院微生物理化所(IBFMVKM) 俄羅斯俄羅斯 所有培養(yǎng)物所有培養(yǎng)物俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(

6、VKPM) 俄羅斯俄羅斯 工業(yè)菌種工業(yè)菌種斯洛伐克酵母保存所斯洛伐克酵母保存所(CCY) 斯洛伐克斯洛伐克 酵母菌酵母菌西班牙普通微生物保藏中心西班牙普通微生物保藏中心(CECT) 西班牙西班牙 普通微生物菌種普通微生物菌種英國藻類和原生物動(dòng)物保藏中心英國藻類和原生物動(dòng)物保藏中心(CCAP) 英國英國 藻類、原生動(dòng)物藻類、原生動(dòng)物歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC) 英國英國 動(dòng)物細(xì)胞系等動(dòng)物細(xì)胞系等國際真菌學(xué)研究所國際真菌學(xué)研究所(IMI) 英國英國 真菌、細(xì)菌等真菌、細(xì)菌等英國國家食品細(xì)胞保藏中心英國國家食品細(xì)胞保藏中心(NCFB) 英國英國 工業(yè)細(xì)菌工業(yè)細(xì)菌英國國家典型

7、培養(yǎng)物保藏中心英國國家典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC) 英國英國 普通微生物普通微生物英國國家酵母菌保藏中心英國國家酵母菌保藏中心(NCYC) 英國英國 酵母菌酵母菌英國國家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏中心英國國家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏中心(NCIMB) 英國英國 工業(yè)及海洋細(xì)菌工業(yè)及海洋細(xì)菌美國北方農(nóng)業(yè)研究所培養(yǎng)物保藏中心美國北方農(nóng)業(yè)研究所培養(yǎng)物保藏中心(NRRL) 美國美國 以微生物菌種為主以微生物菌種為主美國典型培養(yǎng)物保藏中心美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 美國美國 幾乎所有的培養(yǎng)物幾乎所有的培養(yǎng)物（2 2）由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體等，從中進(jìn)行分離

8、篩選。等，從中進(jìn)行分離篩選。（3 3）從一些發(fā)酵制品中分離從一些發(fā)酵制品中分離目目的菌株。的菌株。v菌株的分離和篩選一般可菌株的分離和篩選一般可分依序以下分依序以下幾幾個(gè)步驟個(gè)步驟: :v采樣采樣v富集富集v分離分離v產(chǎn)物鑒別產(chǎn)物鑒別v生化鑒定生化鑒定第一節(jié)第一節(jié) 含微生物樣品的采集含微生物樣品的采集v一、從土壤中采樣一、從土壤中采樣1 1克土壤的含菌量大體有如下的遞減規(guī)律：克土壤的含菌量大體有如下的遞減規(guī)律：細(xì)菌（細(xì)菌（10108 8）放線菌（）放線菌（10107 7）霉菌（）霉菌（10106 6）酵母菌（酵母菌（10105 5）藻類（）藻類（10104 4）原生動(dòng)）原生動(dòng)物（物（10103

9、 3） v（一）根據(jù)土壤特點(diǎn)一）根據(jù)土壤特點(diǎn) 1 1土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況v采土樣最好采土樣最好的土層的土層是是5-25cm5-25cm、一般每、一般每克土中克土中含含菌數(shù)約幾十萬到幾十億個(gè)，并且各種類型的細(xì)菌數(shù)約幾十萬到幾十億個(gè)，并且各種類型的細(xì)菌和放線菌幾乎都能分離到?？偟膩碚f酵母菌菌和放線菌幾乎都能分離到?？偟膩碚f酵母菌分布土層最淺，約分布土層最淺，約5-10 cm5-10 cm；霉菌和好氧芽孢桿；霉菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層菌也分布在淺土層。厭氧菌分布較深。厭氧菌分布較深。 2 2土壤的酸堿度和植被狀況土壤的酸堿度和植被狀況 3 3地理?xiàng)l件：南方、北方地理

10、條件：南方、北方 4 4季節(jié)條件季節(jié)條件 ：710710個(gè)月個(gè)月v（二）采樣方法（二）采樣方法v 用用取樣鏟，將表層取樣鏟，將表層5cm5cm左右的浮土除去，取左右的浮土除去，取5-5-25cm25cm處的土樣處的土樣101025 g25 g，裝入事先準(zhǔn)準(zhǔn)備好的塑料，裝入事先準(zhǔn)準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)袋內(nèi)扎好。給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤土質(zhì)、扎好。給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤土質(zhì)、植被名稱、時(shí)間及其他環(huán)境條件。植被名稱、時(shí)間及其他環(huán)境條件。v 北北方土壤干燥在方土壤干燥在10-30cm10-30cm處取處取樣。樣。v 一般一般樣品取回后應(yīng)樣品取回后應(yīng)馬上分離，以免馬上分離，以免微生物微生物死亡。死亡

11、。 v 樣品較多時(shí)，可樣品較多時(shí)，可先采用選擇性培養(yǎng)基做好試管先采用選擇性培養(yǎng)基做好試管斜面，隨身斜面，隨身帶走。帶走。v v二、根據(jù)微生物生理特點(diǎn)取樣二、根據(jù)微生物生理特點(diǎn)取樣v 1 1根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型v每種微生物對(duì)碳、氮源的需求不一樣，分布也有差異。每種微生物對(duì)碳、氮源的需求不一樣，分布也有差異。若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產(chǎn)或處理這種化合物的工廠附近采集樣品，容易得到滿生產(chǎn)或處理這種化合物的工廠附近采集樣品，容易得到滿意的效果。意的效果。v森林、肉類加工廠、面粉廠、糖廠、柑橘、油田、化工廠森

12、林、肉類加工廠、面粉廠、糖廠、柑橘、油田、化工廠等等v不少微生物對(duì)碳源的利用是不完全專一的，如以油脂為碳不少微生物對(duì)碳源的利用是不完全專一的，如以油脂為碳源的某些脂肪酶產(chǎn)生菌同樣也可以分解淀粉獲得能源而生源的某些脂肪酶產(chǎn)生菌同樣也可以分解淀粉獲得能源而生長。長。 v2.2.根根據(jù)微生物的生理特性據(jù)微生物的生理特性v高溫、低溫、耐壓、耐高滲等高溫、低溫、耐壓、耐高滲等v 三、特殊環(huán)境下采樣三、特殊環(huán)境下采樣v1 1局部環(huán)境條件的影響局部環(huán)境條件的影響v2 2極端環(huán)境條件的影響極端環(huán)境條件的影響特定微生特定微生物的分離物的分離 嗜嗜 極極 菌菌嗜壓、嗜酸嗜壓、嗜酸嗜減嗜減v一一、控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成

13、分控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分v1 1 根據(jù)環(huán)境條件選擇合適的培養(yǎng)基根據(jù)環(huán)境條件選擇合適的培養(yǎng)基v2 2、根據(jù)微生物的類型、根據(jù)微生物的類型v3 3、根據(jù)微生物對(duì)環(huán)境的耐受范圍具有可塑性、根據(jù)微生物對(duì)環(huán)境的耐受范圍具有可塑性的特點(diǎn)的特點(diǎn)( (抗性菌株、污染物分解菌）抗性菌株、污染物分解菌） 第二節(jié)第二節(jié) 含微生物樣品的富集培養(yǎng)含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)（富集培養(yǎng)（enrichment breeding) )：是在目的：是在目的微生物含量較少時(shí)根據(jù)微生物的特點(diǎn)設(shè)計(jì)一種微生物含量較少時(shí)根據(jù)微生物的特點(diǎn)設(shè)計(jì)一種選擇培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微選擇培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環(huán)

14、境下迅速生長繁殖，數(shù)量增加，生物在最適的環(huán)境下迅速生長繁殖，數(shù)量增加，由原來的自然條件下的劣勢菌株變成人工環(huán)境由原來的自然條件下的劣勢菌株變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利分離到所需菌株。下的優(yōu)勢種，以利分離到所需菌株。富集培養(yǎng)主要是根據(jù)微生物的富集培養(yǎng)主要是根據(jù)微生物的碳源碳源、氮源氮源、pH、溫度溫度、需氧需氧等生理因素加以控制。等生理因素加以控制。v二、控制培養(yǎng)條件二、控制培養(yǎng)條件 細(xì)菌、放線菌的生長繁殖要求偏堿（細(xì)菌、放線菌的生長繁殖要求偏堿（pH7.0-7.5)pH7.0-7.5)霉菌和酵母菌的生長繁殖要求偏酸（霉菌和酵母菌的生長繁殖要求偏酸（pH4.5-6.0pH4.5-6.0）溫度、通

15、氣量等溫度、通氣量等 極端微生物極端微生物 微生物的生理特點(diǎn)微生物的生理特點(diǎn)v三、抑制不需要的菌類三、抑制不需要的菌類 1、分離真菌時(shí)可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素等抗生素抑制細(xì)菌、分離真菌時(shí)可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素等抗生素抑制細(xì)菌 2、分離放線菌時(shí)在培養(yǎng)基中加入、分離放線菌時(shí)在培養(yǎng)基中加入10滴滴10%的酚或加青霉素、的酚或加青霉素、鏈霉素等抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌，或加入丙酸鈉鏈霉素等抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌，或加入丙酸鈉10ug/ml抑制霉菌和細(xì)菌生長抑制霉菌和細(xì)菌生長 3、加入放線菌酮可以有效抑制真菌的生長、加入放線菌酮可以有效抑制真菌的生長4 4、在富集培養(yǎng)基中加人適量的膽鹽和十二烷基磺酸鈉可

16、抑、在富集培養(yǎng)基中加人適量的膽鹽和十二烷基磺酸鈉可抑制革蘭陽性菌的生長，對(duì)革蘭陰性菌無抑制作用制革蘭陽性菌的生長，對(duì)革蘭陰性菌無抑制作用5 5、分離厭氧菌時(shí)，可加人少量硫乙醇酸鈉作為還原劑、分離厭氧菌時(shí)，可加人少量硫乙醇酸鈉作為還原劑6 6、在、在分離除鏈霉菌以外的放線菌時(shí)，先將土樣分離除鏈霉菌以外的放線菌時(shí)，先將土樣在空氣中干燥，再加熱到在空氣中干燥，再加熱到100100保溫保溫1h1h，可簡，可簡少細(xì)菌和鏈霉菌的數(shù)少細(xì)菌和鏈霉菌的數(shù)量。量。7 7、分離、分離耐高濃度酒精和高滲酵母菌時(shí)，可分別耐高濃度酒精和高滲酵母菌時(shí)，可分別將樣品在高濃度酒精和高濃度度甘蔗溶液中處將樣品在高濃度酒精和高濃度

17、度甘蔗溶液中處理一段時(shí)間。殺死理一段時(shí)間。殺死非目的非目的微生物微生物后再進(jìn)行后再進(jìn)行分離。分離。v從土壤中分離芽孢桿菌從土壤中分離芽孢桿菌v對(duì)對(duì)于含菌數(shù)量較少的樣品或分離一些稀有微生于含菌數(shù)量較少的樣品或分離一些稀有微生物時(shí)，采用物時(shí)，采用富集培養(yǎng)可以富集培養(yǎng)可以提高提高分離工作效率。分離工作效率。 第三節(jié)第三節(jié) 好氧好氧微生物的分離微生物的分離較粗放的分離方法較粗放的分離方法 “菌落純菌落純” 如稀釋涂布法，劃線分離法，組織分離法等如稀釋涂布法，劃線分離法，組織分離法等 。組織分離法則通常是從有病或特殊組織中分離組織分離法則通常是從有病或特殊組織中分離菌株。菌株。 較細(xì)較細(xì)的分離方法的分離

18、方法 “菌株純菌株純” 單細(xì)胞或單孢子分離方法單細(xì)胞或單孢子分離方法” ” 這類方法需采用專門的儀器設(shè)備，復(fù)雜的如顯這類方法需采用專門的儀器設(shè)備，復(fù)雜的如顯微操縱裝置，簡單的可利用培養(yǎng)皿或凹玻片作微操縱裝置，簡單的可利用培養(yǎng)皿或凹玻片作分離小室進(jìn)行分離、分離小室進(jìn)行分離、 v一一 稀釋涂布法稀釋涂布法v二二 劃線分離法劃線分離法v三三 利用平皿的生化反利用平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離應(yīng)進(jìn)行分離1 1透明圈法透明圈法2 2變色圈法變色圈法 3 3生長圈法生長圈法4 4抑菌圈法抑菌圈法飽浸含某種指示飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈的濾紙片變色圈 指示劑直接摻入或噴灑固指示劑直接摻

19、入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液噴上稀碘液 固體培養(yǎng)基中滲入溶解性固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。質(zhì)形成透明圈。利用一些有特別營養(yǎng)要利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養(yǎng)如待篩選菌具有該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物 能力，工具菌就能圍繞能力，工具菌就能圍繞該菌生長該菌生長 待篩選的菌株能待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能分泌產(chǎn)生某

20、些能抑制工具菌生長抑制工具菌生長的物質(zhì)的物質(zhì) v四四 組織分離法組織分離法v1 1對(duì)一般有病組織的分離方法對(duì)一般有病組織的分離方法 用用10%10%漂白粉或漂白粉或0.10.1升汞浸泡升汞浸泡v2 2食用菌孢子分離法食用菌孢子分離法 （1 1）多孢子分離法多孢子分離法 （2 2）單孢子分離法：單孢子?。﹩捂咦臃蛛x法：單孢子稀釋釋v五五 單細(xì)胞或單孢子分離法單細(xì)胞或單孢子分離法v1 1、小滴分離純化方法、小滴分離純化方法 稀釋樣品為稀釋樣品為1500/ml1500/ml，滴管，滴管4000d/ml4000d/mlv2 2、濾、濾紙片紙片法法 六六、通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件進(jìn)行分離、通過控制營養(yǎng)和培

21、養(yǎng)條件進(jìn)行分離v1.1.培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 v2.2.培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的pHpHv3.3.排除不需要的排除不需要的菌類菌類v4 4控制培養(yǎng)溫度控制培養(yǎng)溫度 50-6050-6020-4020-401515或更低或更低 （1 1）分離細(xì)菌時(shí)，在培養(yǎng)基中加入濃度為）分離細(xì)菌時(shí)，在培養(yǎng)基中加入濃度為50U50Umlml制霉菌素；制霉菌素；可以抑制霉菌和酵母菌的生長?？梢砸种泼咕徒湍妇纳L。 （2 2）分離放線菌時(shí)，在樣品中加入）分離放線菌時(shí)，在樣品中加入 0.05 0.05 十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉（SDSSDS）不僅可以抑制細(xì)菌的主長；還能激活放線菌孢子的菌）不僅可以抑制細(xì)菌的

22、主長；還能激活放線菌孢子的菌絲。加人氟哌酸（絲。加人氟哌酸（5mg/L5mg/L）+ +制霉菌素（制霉菌素（50mg/L50mg/L）+ +青霉素青霉素（0.5mg/L0.5mg/L）也可有效地抑制細(xì)菌和真菌，而不影響放線菌的）也可有效地抑制細(xì)菌和真菌，而不影響放線菌的生長。生長。 （3 3）分離霉菌和酵母菌時(shí)，在培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素）分離霉菌和酵母菌時(shí)，在培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素和四環(huán)素各和四環(huán)素各30U30Umlml，可以抑制細(xì)菌和放線菌生長。，可以抑制細(xì)菌和放線菌生長。 （4 4）分離根霉和毛霉時(shí)由于這些微生物的菌絲易蔓延成片，）分離根霉和毛霉時(shí)由于這些微生物的菌絲易蔓延成片，難

23、以得到純化的菌落通常在培養(yǎng)基中添加難以得到純化的菌落通常在培養(yǎng)基中添加0.1%0.1%去氧膽酸鈉或去氧膽酸鈉或山梨醇防止菌絲蔓延，使菌落長得小而緊密。山梨醇防止菌絲蔓延，使菌落長得小而緊密。 第四節(jié)第四節(jié) 厭氧厭氧微生物微生物的分離的分離v一、厭氧培養(yǎng)中幾種除氧的方法一、厭氧培養(yǎng)中幾種除氧的方法v（一）加還原劑（一）加還原劑 分離培養(yǎng)基內(nèi)加人還原劑，如半胱氨酸、分離培養(yǎng)基內(nèi)加人還原劑，如半胱氨酸、D D型維生素型維生素C C、硫化鈉等，操作時(shí)以最快的速、硫化鈉等，操作時(shí)以最快的速度劃線分離，然后立即置于事先已抽真空度劃線分離，然后立即置于事先已抽真空密閉的容器內(nèi)（充密閉的容器內(nèi)（充COCO2

24、2或或N N2 2），適溫培養(yǎng)。），適溫培養(yǎng)。（二）焦性沒食子酸法二）焦性沒食子酸法 （1,2,3-1,2,3-三羥基苯）三羥基苯）（三）平皿厭氣培養(yǎng)法（三）平皿厭氣培養(yǎng)法（四）試管厭氣培養(yǎng)法（四）試管厭氣培養(yǎng)法（五）玻璃板隔絕空氣培養(yǎng)法（五）玻璃板隔絕空氣培養(yǎng)法（六）生物吸氧法（六）生物吸氧法 除以上的方法外，還有肝塊肉湯培養(yǎng)，除以上的方法外，還有肝塊肉湯培養(yǎng)，高層瓊脂法，共棲培養(yǎng)法等高層瓊脂法，共棲培養(yǎng)法等 實(shí)例實(shí)例; ; 1 1）保加利亞乳桿菌的分離篩選）保加利亞乳桿菌的分離篩選 2 2）反硝化細(xì)菌的分離反硝化細(xì)菌的分離（ 1 1 ）單個(gè)平皿法）單個(gè)平皿法 按常規(guī)在瓊脂平板上劃線接種。將

25、固體石蠟置于一容器中按常規(guī)在瓊脂平板上劃線接種。將固體石蠟置于一容器中加熱融化。取方形玻板一塊加熱融化。取方形玻板一塊 , , 中央置紗布或重疊濾紙一小塊中央置紗布或重疊濾紙一小塊 , , 上面放焦性沒食子酸上面放焦性沒食子酸 0.5g 0.5g ，加，加 10 10 氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液 0.5ml 0.5ml 后迅速將平皿底倒置于其上，周圍立即用融化石蠟封閉。置后迅速將平皿底倒置于其上，周圍立即用融化石蠟封閉。置 37 37 溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng) 2-3d 2-3d ，取出觀察。，取出觀察。 （ 2 2 ）試管培養(yǎng)法）試管培養(yǎng)法 取約取約 100cm3 100cm3 容積的大試管一支，在管

26、底放焦性沒食子容積的大試管一支，在管底放焦性沒食子酸酸 10g 10g 及玻璃珠數(shù)個(gè)。將已接種的培養(yǎng)管放入大試管中，加入及玻璃珠數(shù)個(gè)。將已接種的培養(yǎng)管放入大試管中，加入 20 20 氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液 1m1 1m1 ，立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時(shí)，立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時(shí)周圍封以石蠟，周圍封以石蠟， 3737培養(yǎng)培養(yǎng) 2-3d 2-3d 觀察。觀察。 3 3 ）干燥器（玻罐）法）干燥器（玻罐）法 計(jì)算好容器的體積，根據(jù)其體積稱取焦性沒食子酸（置計(jì)算好容器的體積，根據(jù)其體積稱取焦性沒食子酸（置于平皿內(nèi)）和配制氫氧化鈉溶液。將氫氧化鈉溶液倒人干燥器于平皿內(nèi)）和配制氫氧化鈉溶液。將氫

27、氧化鈉溶液倒人干燥器底部，把盛有焦性沒食子酸的平皿輕輕漂浮于液面上。放好隔底部，把盛有焦性沒食子酸的平皿輕輕漂浮于液面上。放好隔板，將接種好的平板或試管置于隔板上，把干燥器蓋蓋上密封板，將接種好的平板或試管置于隔板上，把干燥器蓋蓋上密封（可預(yù)先在罐口抹一薄層凡士林）。輕輕搖動(dòng)干燥器，使焦性（可預(yù)先在罐口抹一薄層凡士林）。輕輕搖動(dòng)干燥器，使焦性沒食子酸和氫氧化鈉溶液混合，置沒食子酸和氫氧化鈉溶液混合，置 37 37 溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng) 2-3d 2-3d ，取，取出觀察出觀察第五節(jié)第五節(jié) 野生型目的菌株的篩選野生型目的菌株的篩選 和菌株鑒定和菌株鑒定v 一、初篩一、初篩v1 1平板篩選平板篩選 較

28、粗放的檢篩方法較粗放的檢篩方法 v2 2搖瓶篩選搖瓶篩選 效果比較一致，由此篩選到的菌株易于推廣效果比較一致，由此篩選到的菌株易于推廣, ,通通過該法可淘汰過該法可淘汰85-90%85-90%不符合要求的微生物不符合要求的微生物 v 二、復(fù)篩二、復(fù)篩 一個(gè)菌株通常要重復(fù)一個(gè)菌株通常要重復(fù)3-53-5個(gè)瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液個(gè)瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液采用精確分析方法測定采用精確分析方法測定 v三三 菌株鑒定菌株鑒定 三個(gè)步驟：三個(gè)步驟：1 1、獲得該微生物的純種培養(yǎng)物；、獲得該微生物的純種培養(yǎng)物； 2 2、測定一系列必要的鑒定指標(biāo)；、測定一系列必要的鑒定指標(biāo)； 3 3、根據(jù)權(quán)威性的鑒定手冊(cè)進(jìn)行菌種鑒定、根

29、據(jù)權(quán)威性的鑒定手冊(cè)進(jìn)行菌種鑒定。 四個(gè)水平：細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性水平；細(xì)胞組分水平；四個(gè)水平：細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性水平；細(xì)胞組分水平；蛋白質(zhì)水平；基因或蛋白質(zhì)水平；基因或DNADNA水平。水平。高產(chǎn)類胡蘿卜素紅酵母的分離篩選高產(chǎn)類胡蘿卜素紅酵母的分離篩選取樣取樣富集培養(yǎng)（初篩和復(fù)篩）富集培養(yǎng)（初篩和復(fù)篩）菌株鑒定菌株鑒定分離篩選方法分離篩選方法1 1、水池邊紅色附著物中紅酵母的分離、水池邊紅色附著物中紅酵母的分離1111：取適量從水池邊取適量從水池邊刮下的紅色附著物，用無菌水稀釋后涂布接種于刮下的紅色附著物，用無菌水稀釋后涂布接種于分離平板分離平板上上，置于，置于2828培養(yǎng)，待菌落長出后，挑選紅色、粉紅

30、色、培養(yǎng)，待菌落長出后，挑選紅色、粉紅色、橙紅色顏色較深且生長迅速的菌落進(jìn)行分離純培養(yǎng)，純化橙紅色顏色較深且生長迅速的菌落進(jìn)行分離純培養(yǎng)，純化的菌株接種于保存斜面上，置于冰箱中的菌株接種于保存斜面上，置于冰箱中44保存；保存；2 2、公共浴室紅色附著物中紅酵母的分離、公共浴室紅色附著物中紅酵母的分離：同水池邊紅色附：同水池邊紅色附著物中紅酵母的分離；著物中紅酵母的分離；3 3、空氣中紅酵母的分離、空氣中紅酵母的分離：將分離平板暴露于空氣中，數(shù)天：將分離平板暴露于空氣中，數(shù)天后將平板置于后將平板置于2828培養(yǎng)，待菌落長出，菌落的挑選、分離培養(yǎng)，待菌落長出，菌落的挑選、分離純培養(yǎng)和保存方法同水池

31、邊紅色附著物中紅酵母的分離純培養(yǎng)和保存方法同水池邊紅色附著物中紅酵母的分離；4 4、果園土壤、汽車修理廠土壤中紅酵母的分離、果園土壤、汽車修理廠土壤中紅酵母的分離1111：?。喝∫欢康耐翗佑谘b有一定量的土樣于裝有50mL50mL無菌水和數(shù)粒玻璃珠的無菌水和數(shù)粒玻璃珠的250mL250mL三三角瓶中，振蕩后靜置片刻，取角瓶中，振蕩后靜置片刻，取5mL5mL懸浮液接種于裝有懸浮液接種于裝有30mL30mL富集培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)基的250mL250mL三角瓶中，在三角瓶中，在2828振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)24h24h。再取。再取200200LL富集培養(yǎng)液涂布接種于分離平板上，置于富集培養(yǎng)液涂布接種于分離平

32、板上，置于2828培養(yǎng)，培養(yǎng)，待菌落長出，菌落的挑選、分離純培養(yǎng)和保存方法同水池待菌落長出，菌落的挑選、分離純培養(yǎng)和保存方法同水池邊紅色附著物中紅酵母的分離；邊紅色附著物中紅酵母的分離；5 5、醪糟、葡萄汁中紅酵母的分離、醪糟、葡萄汁中紅酵母的分離：取：取200200LL醪糟液或葡醪糟液或葡萄汁涂布接種于分離平板上，置于萄汁涂布接種于分離平板上，置于2828培養(yǎng)，待菌落長出培養(yǎng)，待菌落長出后，菌落的挑選、分離純培養(yǎng)和保存方法同水池邊紅色附后，菌落的挑選、分離純培養(yǎng)和保存方法同水池邊紅色附著物中紅酵母的分離著物中紅酵母的分離。培養(yǎng)基培養(yǎng)基1 1、平板篩選培養(yǎng)基（、平板篩選培養(yǎng)基（20%20% P

33、DAPDA）：）：馬鈴薯馬鈴薯2020% %，葡萄糖，葡萄糖2%2%，瓊脂，瓊脂1.8%1.8%，自然，自然p pH H，121121滅菌滅菌30min30min；2 2、富集培養(yǎng)基：、富集培養(yǎng)基：馬鈴薯馬鈴薯2020% %，葡萄糖，葡萄糖2%2%，自然，自然p pH H，121121滅菌滅菌30min30min；3 3、斜面保存培養(yǎng)基（、斜面保存培養(yǎng)基（20%20% PDAPDA）：）：馬鈴薯馬鈴薯20%20%，葡萄糖，葡萄糖2%2%，瓊脂，瓊脂1.8%1.8%，自然，自然p pH H，121121滅菌滅菌30min30min；4 4、液體種子培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基(YEPD)9(YEPD)

34、9：葡萄糖葡萄糖2%2%，酵母，酵母膏膏1%1%，蛋白胨，蛋白胨1%1%，自然，自然p pH H，121121滅菌滅菌2 20min0min；5 5、液體發(fā)酵培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基(YEPD)9(YEPD)9：葡萄糖葡萄糖4 4% %，酵母，酵母膏膏1 1% %，蛋白胨，蛋白胨1 1% %，p pH H 6.06.0 ，121121滅菌滅菌2 20min0min；6 6、鑒定用培養(yǎng)基、鑒定用培養(yǎng)基1010：5%5%麥芽汁培養(yǎng)基，麥芽汁培養(yǎng)基，12.5%12.5%豆芽汁培養(yǎng)基，尿素液體培養(yǎng)基，無碳培養(yǎng)基，豆芽汁培養(yǎng)基，尿素液體培養(yǎng)基，無碳培養(yǎng)基，無氮培養(yǎng)基，尿素液體培養(yǎng)基，無氮培養(yǎng)基，尿素液體培

35、養(yǎng)基，GorodkowaGorodkowa培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，馬鈴薯塊培養(yǎng)基馬鈴薯塊培養(yǎng)基。紅酵母的鑒定紅酵母的鑒定參照參照BarenttJAYeastscharacteristicsandidentifaction1717有選擇性地對(duì)篩選所得有選擇性地對(duì)篩選所得酵母菌進(jìn)行酵母菌進(jìn)行形態(tài)特征形態(tài)特征（細(xì)胞形態(tài)、群體培養(yǎng)特征、子囊孢子的形成、假（細(xì)胞形態(tài)、群體培養(yǎng)特征、子囊孢子的形成、假菌絲的形成和形態(tài)、擲孢子的菌絲的形成和形態(tài)、擲孢子的形成）形成）生理生理生化特性（糖類發(fā)酵特性、碳源同化特性、氮源同化特生化特性（糖類發(fā)酵特性、碳源同化特性、氮源同化特性、耐高滲特性、脲酶試驗(yàn)特性、重氮基藍(lán)性、耐高滲

36、特性、脲酶試驗(yàn)特性、重氮基藍(lán)B B鹽顯色特性）鹽顯色特性）鑒定。鑒定。分離結(jié)果分離結(jié)果紅酵母屬分布廣泛，但也具有酵母對(duì)生境的一般要求，即喜酸、紅酵母屬分布廣泛，但也具有酵母對(duì)生境的一般要求，即喜酸、喜甜，有一定碳源和氮源的環(huán)境喜甜，有一定碳源和氮源的環(huán)境19-2019-20。因此，在篩選時(shí)生境主。因此，在篩選時(shí)生境主要集中在水池邊、公共浴室、空氣、果園土壤、汽車修理廠土要集中在水池邊、公共浴室、空氣、果園土壤、汽車修理廠土壤、醪糟、葡萄汁中壤、醪糟、葡萄汁中21-2221-22。通過初步分離，從水池邊、公共浴。通過初步分離，從水池邊、公共浴室、空氣中共得到室、空氣中共得到1515株紅色菌株，其

37、色澤分布于粉紅、橙紅之株紅色菌株，其色澤分布于粉紅、橙紅之間，根據(jù)對(duì)菌落和菌體的形態(tài)特征觀察以及鏡檢，結(jié)果表明分間，根據(jù)對(duì)菌落和菌體的形態(tài)特征觀察以及鏡檢，結(jié)果表明分離得到的菌株均為酵母菌，分別編號(hào)為離得到的菌株均為酵母菌，分別編號(hào)為1-11-1，1-21-2，2-12-1，2-22-2，3-13-1，3-23-2，3-33-3，4-14-1，4-24-2，5 5，6-16-1，6-26-2，6-36-3，6-46-4，6-56-5。形態(tài)特征形態(tài)特征將紅將紅酵母在酵母在麥芽汁液體培養(yǎng)基上生長麥芽汁液體培養(yǎng)基上生長3d3d后制片在后制片在1010100100顯顯微鏡下觀察（圖微鏡下觀察（圖1 1

38、），可見細(xì)胞呈卵圓形，并進(jìn)行出芽生殖。），可見細(xì)胞呈卵圓形，并進(jìn)行出芽生殖。細(xì)胞長約：細(xì)胞長約：6 6m m9 9m m，寬約：，寬約：3 3m m5 5m m，此時(shí)細(xì)胞正，此時(shí)細(xì)胞正由卵圓形轉(zhuǎn)變?yōu)槔L型，并出現(xiàn)成簇、成鏈由卵圓形轉(zhuǎn)變?yōu)槔L型，并出現(xiàn)成簇、成鏈現(xiàn)象?，F(xiàn)象。培養(yǎng)培養(yǎng)3d3d后的麥芽汁液體培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁，有浮膜、沉淀物后的麥芽汁液體培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁，有浮膜、沉淀物形成，與液面相接觸的試管壁上出現(xiàn)橙紅色的形成，與液面相接觸的試管壁上出現(xiàn)橙紅色的環(huán)。環(huán)。在在麥芽汁固體培養(yǎng)上生長的菌落呈橙紅色，菌落粘稠、濕麥芽汁固體培養(yǎng)上生長的菌落呈橙紅色，菌落粘稠、濕潤，表面平坦光滑、無褶皺、邊緣潤，表

39、面平坦光滑、無褶皺、邊緣整齊。整齊。菌落菌落起初圓潤，起初圓潤，5d5d后逐漸變干燥，并產(chǎn)生后逐漸變干燥，并產(chǎn)生皺褶。皺褶。將將其保存于其保存于4 4，菌落顏色變淺，稀薄、邊緣不整齊。麥芽，菌落顏色變淺，稀薄、邊緣不整齊。麥芽汁固體平板上正置培養(yǎng)汁固體平板上正置培養(yǎng)7d7d的紅酵母的紅酵母3-23-2，其皿蓋上無鏡像形，其皿蓋上無鏡像形成，不成，不擲孢子。擲孢子。該該菌株不能形成子囊孢子，在玉米粉瓊脂上生長不產(chǎn)生假菌株不能形成子囊孢子，在玉米粉瓊脂上生長不產(chǎn)生假菌絲。菌絲。這些這些都符合紅酵母屬的形態(tài)特征。都符合紅酵母屬的形態(tài)特征。第六節(jié)第六節(jié) 極端環(huán)境微生物的分離篩選極端環(huán)境微生物的分離篩選

40、一、極端環(huán)境微生物的采樣、分離篩選一、極端環(huán)境微生物的采樣、分離篩選（一）（一） 極端環(huán)境微生物選育主要流程極端環(huán)境微生物選育主要流程樣品采集樣品采集富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)分離純化分離純化菌種鑒定菌種鑒定菌種改良菌種改良接種實(shí)驗(yàn)接種實(shí)驗(yàn)效果明顯菌效果明顯菌效果不明顯菌效果不明顯菌工業(yè)生產(chǎn)工業(yè)生產(chǎn)菌種保藏菌種保藏繼續(xù)馴化繼續(xù)馴化提取宏基因組提取宏基因組建立宏基因組文庫建立宏基因組文庫分析宏基因組文庫分析宏基因組文庫利用利用PCRPCR或雜交篩選特定功能基因或雜交篩選特定功能基因篩選表達(dá)特定表型的基因篩選表達(dá)特定表型的基因隨機(jī)測序分析微生物生態(tài)隨機(jī)測序分析微生物生態(tài)（二）（二） 采集樣品采集樣品（三）采

41、集樣品的方法（三）采集樣品的方法（四）樣品的富集培養(yǎng)（四）樣品的富集培養(yǎng)（五）菌株分離（五）菌株分離1 1、嗜熱好氧菌培養(yǎng)基、嗜熱好氧菌培養(yǎng)基2 2、嗜熱厭氧菌培養(yǎng)基、嗜熱厭氧菌培養(yǎng)基嗜熱菌與普通菌分離培養(yǎng)有什么不同？嗜熱菌與普通菌分離培養(yǎng)有什么不同？1 1、在固體平板分離培養(yǎng)時(shí)，由于水分的蒸發(fā)，而使平板培養(yǎng)、在固體平板分離培養(yǎng)時(shí)，由于水分的蒸發(fā)，而使平板培養(yǎng)容易發(fā)生皺裂。容易發(fā)生皺裂。2 2、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，置于、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，置于6060培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速高于培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速高于180rpm180rpm以上，以上，蒸發(fā)和通氧均不會(huì)造成影響，而高于蒸發(fā)和通氧均不會(huì)造成影響，而高于7070時(shí)，蒸發(fā)成為

42、突出問時(shí)，蒸發(fā)成為突出問題。題。二、極端微生物酶分子生物學(xué)研究二、極端微生物酶分子生物學(xué)研究1 1、極端酶基因的克隆、極端酶基因的克隆2 2、極端酶基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、極端酶基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建研究極端微生物多樣性及其應(yīng)用的意義：研究極端微生物多樣性及其應(yīng)用的意義：1 1、極端環(huán)境微生物的基因是構(gòu)建遺傳工程菌的資源寶庫。、極端環(huán)境微生物的基因是構(gòu)建遺傳工程菌的資源寶庫。2 2、極端環(huán)境微生物的生態(tài)、結(jié)構(gòu)、分類、代謝、遺傳等、極端環(huán)境微生物的生態(tài)、結(jié)構(gòu)、分類、代謝、遺傳等均有別于普通微生物，使得極端環(huán)境微生物的活性物質(zhì)均有別于普通微生物，使得極端環(huán)境微生物的活性物質(zhì)具有普通微生物活性物質(zhì)所不具備的特性。具有普通微生物活性物質(zhì)所不具備的特性。3 3、為生物進(jìn)化、生命起源的研究提供新的材料。、為生物進(jìn)化、生命起源的研究提供新的材料。