生物化學(xué)11第十一章 DNA的生物合成

1、幻燈片1第十一章 DNA的生物合成 (復(fù)制)(DNA Biosynthesis，Replication) 復(fù)制是指以親代DNA為模板合成子鏈DNA的過程。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+親代DNA 復(fù)制叉子代DNA 幻燈片2第一節(jié) 復(fù)制基本規(guī)律與體系(Basic Rules and System of DNA Replication )一、復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)

2、制的方式半保留復(fù)制固定起始點(diǎn)雙向復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的高保真性基本規(guī)律(一)半保留復(fù)制1.概念 DNA合成時，以親代DNA解開的兩股單鏈為模板，按堿基配對規(guī)律，合成子代DNA的過程。子代DNA，一股單鏈來源于親代，另一股單鏈為新合成。子代和親代的DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制?；脽羝?2.半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和意義(1)密度梯度實(shí)驗(yàn) 梯度離心結(jié)果含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第二代 實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。幻燈片4(2)子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式 全保留式 (混合式) 半保留式(3)半保留復(fù)制的意義按半保留復(fù)制方式，子代DNA與

3、親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的?；脽羝?(二)固定起始點(diǎn) 復(fù)制是從具有特異堿基序列的復(fù)制起始點(diǎn)開始。原核生物(一個起始點(diǎn))，真核生物(多個起始點(diǎn))。(三)雙向復(fù)制1.原核生物復(fù)制時，DNA從起始點(diǎn)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。 復(fù)制中的放射自顯影示意圖oriterA B Cl 環(huán)狀雙鏈DNA及l(fā) 復(fù)制起始點(diǎn)l B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉l C. 復(fù)制接近終止點(diǎn)幻燈片62.真核生物每個染色體有多個起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個復(fù)制子。復(fù)制子是獨(dú)立完成

4、復(fù)制的功能單位。 53oriorioriori535533553復(fù)制子3幻燈片7(四)復(fù)制的半不連續(xù)性 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。3¢5¢3¢5¢解鏈方向3´5´3´3´5´ 順解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制為連續(xù)進(jìn)行，稱為領(lǐng)頭鏈。領(lǐng)頭鏈(leading strand)隨從鏈(lagging strand) 另一股鏈復(fù)制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，稱為隨從鏈。 復(fù)制中不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 幻燈片8(五)復(fù)制的高保真性1.DN

5、A-pol的核酸外切酶活性和及時校讀DNA-pol外切活性聚合活性AGA:CGB:5/3/5/3/無活性A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。幻燈片92.復(fù)制保真性的堿基選擇a) DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(氫鍵)與共價鍵(磷酸二酯鍵) 的有序形成。b) 嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。 NN9R-PNHHNN6反式NN9P-RNHHNN6順式3.DNA復(fù)制保真性依賴三種機(jī)制 a) 遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律。b) 聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能。c

6、) 復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能?；脽羝?0二、DNA復(fù)制的體系 (一) 底物(substrate) dATP, dGTP, dCTP, dTTP。(二) 模板(template) 解開成單鏈的DNA母鏈。(三) 引物(primer) 提供3¢-OH末端使dNTP可以依次聚合的RNA(DNA)片斷。(四) 酶和蛋白因子1.DNA聚合酶 全稱為依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)，簡稱DNA-pol?；脽羝?1(1)活性：5¢®3¢ 的聚合活性；3¢ ® 5¢外切酶活

7、性能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解； 5¢ ® 3¢外切酶活性能切除突變的 DNA片段。5´ A G C T T C A G G A T A ® 3´ | | | | | | | | | | |3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´?幻燈片12(2)原核生物的DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 大腸桿菌E.coli中的三種DNA聚合酶分類DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III分子量(KD)109120900聚合速率(核苷酸/分)1 00060 00

8、05 3聚合酶活性+3 5外切酶活性+5 3外切酶活性+生物學(xué)功能切除引物延長岡崎片段DNA損傷修復(fù)延長子鏈校讀作用校讀作用DNA損傷修復(fù)幻燈片13DNA-pol(109kD) 功能:對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。N 端C 端DNA-pol 木瓜蛋白酶小片段大片段/Klenow 片段 DNA聚合酶活性 ， 3¢ ® 5¢ 核酸外切酶活性5¢ ® 3¢核酸外切酶活性Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA的常用工具酶。 幻燈片14DNA-pol (120kD) DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。它參

9、與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 DNA-pol (250kD) 功能：是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。 幻燈片15(3)真核生物的DNA聚合酶填補(bǔ)引物空隙，切除修復(fù)，重組延長子鏈的主要酶，解螺旋酶活性線粒體DNA復(fù)制起始引發(fā)，引物酶活性功能+-3¢5¢高高高？中5¢3¢聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）DNA-pol填補(bǔ)引物空隙，切除修復(fù)，重組延長子鏈的主要酶，解螺旋酶活性線粒體DNA復(fù)制起始引發(fā)，引物酶活性+-3¢5¢外切酶活性高高高？中5¢3¢聚合活性25.512.514.04.

10、016.5分子量（kD）DNA-pol參與損傷與修復(fù)生物學(xué)幻燈片162.其他酶與蛋白因子(1)解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，打開氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。(2)引物酶(primase) 復(fù)制起始時催化生成RNA引物的酶。(3)單鏈DNA結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。 穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)運(yùn)送和協(xié)同DnaBDnaC(dnaC)解開DNA雙鏈解螺旋酶DnaB(dnaB)辨認(rèn)起始點(diǎn)DnaA(dnaA)蛋

11、白因子通用名功能幻燈片17(4)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA topoisomerase) 指理順DNA鏈，改變超螺旋狀態(tài)的酶，分為I型和II型。 拓?fù)洚悩?gòu)酶 切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。 拓?fù)洚悩?gòu)酶 切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。10 8 局部解鏈后幻燈片18(5)DNA連接酶(DNA ligase) 連接DNA鏈3¢-OH末端和相鄰DNA鏈5¢-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。3HO

12、5335DNA連接酶ATPADP535幻燈片19第二節(jié) DNA復(fù)制的過程(The Process of DNA Replication)一、原核生物的DNA生物合成 (一)復(fù)制的起始DNA解開成單鏈，提供模板。需要解決兩個問題合成引物，提供3¢-OH末端?；脽羝?01. DNA解鏈的起始點(diǎn) GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 1 13 17 29 32 44 ···TGTGGATTA-ACACAT

13、ATT-TTTGGATAA-ACACCTATT58 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列5¢3¢5¢3¢E.coli復(fù)制起始點(diǎn) oriC幻燈片212. 引發(fā)體和引物 Dna B、 Dna C3¢ Dna A引物酶5¢3¢DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB5¢含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。 幻燈片223¢引物酶3' HO5'引物5¢3¢5¢引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。 幻燈

14、片23(二)復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5' 3'DNA-pol5'3'OH 3'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP幻燈片241.領(lǐng)頭鏈的延長領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈沿著5/ 3/方向可以連續(xù)的延長。幻燈片252.隨從鏈的延長幻燈片26復(fù)制簡圖幻燈片27復(fù) 制 延 長 動 畫幻燈片28(三)復(fù)制的終止 1.原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。 ori terSV40500oriter

15、E.coli8232幻燈片292.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接5¢5¢5¢RNA酶OHP5¢DNA-pol dNTP5¢5¢PATP ADP+Pi5¢5¢DNA連接酶幻燈片30二、真核生物的DNA生物合成 真核生物 DNA 復(fù)制在細(xì)胞周期的S期進(jìn)行，也可分為起始、延長和終止三個階段，每個階段的基本過程與原核生物DNA復(fù)制相似，但存在不少差異。 哺乳動物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM幻燈片31(一)復(fù)制的起始 1.真核生物每個染色體有多個起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動。

16、2.復(fù)制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replication factor, RF)。 3.增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。 幻燈片32(二)復(fù)制的延長 真核生物的聚合酶催化子鏈的延長，并有校正功能。引物和岡崎片段 (約200bp) 都比較短。 3¢5¢5¢3¢領(lǐng)頭鏈3¢5¢3¢5¢親代DNA隨從鏈引物核小體幻燈片33(三)復(fù)制的終止1.染色體DNA呈線狀，復(fù)制

17、在末端停止。2.復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。3.染色體兩端DNA子鏈上復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。5¢3¢3¢5¢5¢3¢3¢5¢+5¢3¢3¢3¢3¢5¢5¢幻燈片34(四)端粒與端粒酶1. 端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。2. 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。末端序列是多重復(fù)富含G、C的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG3.功能維持染色體的穩(wěn)定性。維持DNA復(fù)制的完整性。端粒

18、酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associatedprotein 1, hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 4. 端粒酶(telomerase)幻燈片355.端粒酶催化作用的爬行模型 真核DNA復(fù)制后，兩個5末端的引物被切除，缺口無法填補(bǔ)，故DNA將面臨多次復(fù)制而逐漸縮短的問題。 幻燈片36第三節(jié) DNA損傷與修復(fù)(DNA Damage and Repair)突變(Mutation)是指DNA分子中堿基序列的改變，又稱為DNA損傷

19、(DNA damage)。突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)突變導(dǎo)致基因型改變突變導(dǎo)致死亡突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)意義幻燈片37一、引發(fā)突變的因素(一)自發(fā)因素復(fù)制過程中發(fā)生的突變，可發(fā)生10-16頻率的突變。 (二)誘發(fā)因素1.物理因素 紫外線(ultra violet, UV)、各種輻射PRRNNHOOCH3NNHOOCH3PRRNNHOOCH3NNHOOCH3UV嘧啶二聚體幻燈片382. 化學(xué)因素常見的化學(xué)誘變劑化合物類別作用點(diǎn)分子改變堿基類似物如：5-FUA ®5-FU ®G-A -T -G -C -羥胺類（NH2OH）T ®C-T -A -C -G -亞硝酸鹽（

20、NO2）C ®U-G -C -A -T -烷化劑如：氮芥類G ®mGG ®mGDNA缺失G3. 生物因素如逆轉(zhuǎn)錄病毒等。幻燈片39錯配缺失 插入 重排框移(三)突變的類型1.錯配 (mismatch)DNA分子上的堿基錯配稱點(diǎn)突變(point mutation)。(1) 轉(zhuǎn)換:發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替 另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 (2) 顛換:發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧 啶或嘧啶變嘌呤。2.重排(rearrangement)DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。 幻燈片403.缺失(deletion)、插入(insertion)和框移(frame-shift)