生物化學11第十一章 DNA的生物合成

1、幻燈片1第十一章 DNA的生物合成 (復制)(DNA Biosynthesis，Replication) 復制是指以親代DNA為模板合成子鏈DNA的過程。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+親代DNA 復制叉子代DNA 幻燈片2第一節(jié) 復制基本規(guī)律與體系(Basic Rules and System of DNA Replication )一、復制的基本規(guī)律復

2、制的方式半保留復制固定起始點雙向復制半不連續(xù)復制復制的高保真性基本規(guī)律(一)半保留復制1.概念 DNA合成時，以親代DNA解開的兩股單鏈為模板，按堿基配對規(guī)律，合成子代DNA的過程。子代DNA，一股單鏈來源于親代，另一股單鏈為新合成。子代和親代的DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制?；脽羝?2.半保留復制的實驗依據(jù)和意義(1)密度梯度實驗 梯度離心結果含重氮-DNA的細菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第二代 實驗結果支持半保留復制的設想。幻燈片4(2)子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式 全保留式 (混合式) 半保留式(3)半保留復制的意義按半保留復制方式，子代DNA與

3、親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定性的分子基礎，但不是絕對的?；脽羝?(二)固定起始點 復制是從具有特異堿基序列的復制起始點開始。原核生物(一個起始點)，真核生物(多個起始點)。(三)雙向復制1.原核生物復制時，DNA從起始點向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。 復制中的放射自顯影示意圖oriterA B Cl 環(huán)狀雙鏈DNA及l(fā) 復制起始點l B. 復制中的兩個復制叉l C. 復制接近終止點幻燈片62.真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復制子。復制子是獨立完成

4、復制的功能單位。 53oriorioriori535533553復制子3幻燈片7(四)復制的半不連續(xù)性 領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的半不連續(xù)性。3¢5¢3¢5¢解鏈方向3´5´3´3´5´ 順解鏈方向生成的子鏈，復制為連續(xù)進行，稱為領頭鏈。領頭鏈(leading strand)隨從鏈(lagging strand) 另一股鏈復制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，稱為隨從鏈。 復制中不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 幻燈片8(五)復制的高保真性1.DN

5、A-pol的核酸外切酶活性和及時校讀DNA-pol外切活性聚合活性AGA:CGB:5/3/5/3/無活性A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。幻燈片92.復制保真性的堿基選擇a) DNA聚合酶靠其大分子結構協(xié)調(diào)非共價(氫鍵)與共價鍵(磷酸二酯鍵) 的有序形成。b) 嘌呤的化學結構能形成順式和反式構型，與相應的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應處于反式構型。 NN9R-PNHHNN6反式NN9P-RNHHNN6順式3.DNA復制保真性依賴三種機制 a) 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律。b) 聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能。c

6、) 復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能?；脽羝?0二、DNA復制的體系 (一) 底物(substrate) dATP, dGTP, dCTP, dTTP。(二) 模板(template) 解開成單鏈的DNA母鏈。(三) 引物(primer) 提供3¢-OH末端使dNTP可以依次聚合的RNA(DNA)片斷。(四) 酶和蛋白因子1.DNA聚合酶 全稱為依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)，簡稱DNA-pol?；脽羝?1(1)活性：5¢®3¢ 的聚合活性；3¢ ® 5¢外切酶活

7、性能辨認錯配的堿基對，并將其水解； 5¢ ® 3¢外切酶活性能切除突變的 DNA片段。5´ A G C T T C A G G A T A ® 3´ | | | | | | | | | | |3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´?幻燈片12(2)原核生物的DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 大腸桿菌E.coli中的三種DNA聚合酶分類DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III分子量(KD)109120900聚合速率(核苷酸/分)1 00060 00

8、05 3聚合酶活性+3 5外切酶活性+5 3外切酶活性+生物學功能切除引物延長岡崎片段DNA損傷修復延長子鏈校讀作用校讀作用DNA損傷修復幻燈片13DNA-pol(109kD) 功能:對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。N 端C 端DNA-pol 木瓜蛋白酶小片段大片段/Klenow 片段 DNA聚合酶活性 ， 3¢ ® 5¢ 核酸外切酶活性5¢ ® 3¢核酸外切酶活性Klenow片段是實驗室合成DNA的常用工具酶。 幻燈片14DNA-pol (120kD) DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。它參

9、與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。 DNA-pol (250kD) 功能：是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。 幻燈片15(3)真核生物的DNA聚合酶填補引物空隙，切除修復，重組延長子鏈的主要酶，解螺旋酶活性線粒體DNA復制起始引發(fā)，引物酶活性功能+-3¢5¢高高高？中5¢3¢聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）DNA-pol填補引物空隙，切除修復，重組延長子鏈的主要酶，解螺旋酶活性線粒體DNA復制起始引發(fā)，引物酶活性+-3¢5¢外切酶活性高高高？中5¢3¢聚合活性25.512.514.04.

10、016.5分子量（kD）DNA-pol參與損傷與修復生物學幻燈片162.其他酶與蛋白因子(1)解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，打開氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。(2)引物酶(primase) 復制起始時催化生成RNA引物的酶。(3)單鏈DNA結合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整。 穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈DNA結合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)運送和協(xié)同DnaBDnaC(dnaC)解開DNA雙鏈解螺旋酶DnaB(dnaB)辨認起始點DnaA(dnaA)蛋

11、白因子通用名功能幻燈片17(4)DNA拓撲異構酶(DNA topoisomerase) 指理順DNA鏈，改變超螺旋狀態(tài)的酶，分為I型和II型。 拓撲異構酶 切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。 拓撲異構酶 切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能連接斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。10 8 局部解鏈后幻燈片18(5)DNA連接酶(DNA ligase) 連接DNA鏈3¢-OH末端和相鄰DNA鏈5¢-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。3HO

12、5335DNA連接酶ATPADP535幻燈片19第二節(jié) DNA復制的過程(The Process of DNA Replication)一、原核生物的DNA生物合成 (一)復制的起始DNA解開成單鏈，提供模板。需要解決兩個問題合成引物，提供3¢-OH末端?；脽羝?01. DNA解鏈的起始點 GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 1 13 17 29 32 44 ···TGTGGATTA-ACACAT

13、ATT-TTTGGATAA-ACACCTATT58 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復序列 反向重復序列5¢3¢5¢3¢E.coli復制起始點 oriC幻燈片212. 引發(fā)體和引物 Dna B、 Dna C3¢ Dna A引物酶5¢3¢DNA拓撲異構酶SSB5¢含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。 幻燈片223¢引物酶3' HO5'引物5¢3¢5¢引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。 幻燈

14、片23(二)復制的延長復制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5' 3'DNA-pol5'3'OH 3'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP幻燈片241.領頭鏈的延長領頭鏈的合成領頭鏈沿著5/ 3/方向可以連續(xù)的延長?；脽羝?52.隨從鏈的延長幻燈片26復制簡圖幻燈片27復 制 延 長 動 畫幻燈片28(三)復制的終止 1.原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處匯合。 ori terSV40500oriter

15、E.coli8232幻燈片292.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接5¢5¢5¢RNA酶OHP5¢DNA-pol dNTP5¢5¢PATP ADP+Pi5¢5¢DNA連接酶幻燈片30二、真核生物的DNA生物合成 真核生物 DNA 復制在細胞周期的S期進行，也可分為起始、延長和終止三個階段，每個階段的基本過程與原核生物DNA復制相似，但存在不少差異。 哺乳動物的細胞周期DNA合成期G1G2SM幻燈片31(一)復制的起始 1.真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同步起動。

16、2.復制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復制因子(replication factor, RF)。 3.增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在復制起始和延長中起關鍵作用。 幻燈片32(二)復制的延長 真核生物的聚合酶催化子鏈的延長，并有校正功能。引物和岡崎片段 (約200bp) 都比較短。 3¢5¢5¢3¢領頭鏈3¢5¢3¢5¢親代DNA隨從鏈引物核小體幻燈片33(三)復制的終止1.染色體DNA呈線狀，復制

17、在末端停止。2.復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。3.染色體兩端DNA子鏈上復制的RNA引物，去除后留下空隙。5¢3¢3¢5¢5¢3¢3¢5¢+5¢3¢3¢3¢3¢5¢5¢幻燈片34(四)端粒與端粒酶1. 端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構。2. 結構特點由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構成。末端序列是多重復富含G、C的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG3.功能維持染色體的穩(wěn)定性。維持DNA復制的完整性。端粒

18、酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associatedprotein 1, hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 4. 端粒酶(telomerase)幻燈片355.端粒酶催化作用的爬行模型 真核DNA復制后，兩個5末端的引物被切除，缺口無法填補，故DNA將面臨多次復制而逐漸縮短的問題。 幻燈片36第三節(jié) DNA損傷與修復(DNA Damage and Repair)突變(Mutation)是指DNA分子中堿基序列的改變，又稱為DNA損傷

19、(DNA damage)。突變是進化、分化的分子基礎突變導致基因型改變突變導致死亡突變是某些疾病的發(fā)病基礎意義幻燈片37一、引發(fā)突變的因素(一)自發(fā)因素復制過程中發(fā)生的突變，可發(fā)生10-16頻率的突變。 (二)誘發(fā)因素1.物理因素 紫外線(ultra violet, UV)、各種輻射PRRNNHOOCH3NNHOOCH3PRRNNHOOCH3NNHOOCH3UV嘧啶二聚體幻燈片382. 化學因素常見的化學誘變劑化合物類別作用點分子改變堿基類似物如：5-FUA ®5-FU ®G-A -T -G -C -羥胺類（NH2OH）T ®C-T -A -C -G -亞硝酸鹽（

20、NO2）C ®U-G -C -A -T -烷化劑如：氮芥類G ®mGG ®mGDNA缺失G3. 生物因素如逆轉(zhuǎn)錄病毒等?；脽羝?9錯配缺失 插入 重排框移(三)突變的類型1.錯配 (mismatch)DNA分子上的堿基錯配稱點突變(point mutation)。(1) 轉(zhuǎn)換:發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替 另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 (2) 顛換:發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧 啶或嘧啶變嘌呤。2.重排(rearrangement)DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。 幻燈片403.缺失(deletion)、插入(insertion)和框移(frame-shift)