關(guān)于HPLC的基礎(chǔ)知識(shí)(中文)教材

1、液相色譜液相色譜（LC）高效液相色譜高效液相色譜（HPLC）分析分離手段分析分離手段色譜色譜廣義概念廣義概念高效液相色譜高效液相色譜（HPLC）高效液相色譜高效液相色譜（HPLC）凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜（GPC）離離 子子 色色 譜譜（IC）廣義概念廣義概念狹義概念、反相色譜狹義概念、反相色譜高效液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)高效液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)（HPLC Basic）HPLC基礎(chǔ)基礎(chǔ)1High Performance Liquid Chromatography或者或者High Pressure Liquid Chromatography 的略稱的略稱高效、高壓液相色譜高效、高壓液相色譜何為液相色譜？何為

2、液相色譜？使用使用色譜柱色譜柱進(jìn)行進(jìn)行液體液體/態(tài)樣品態(tài)樣品分析分離的手段。分析分離的手段。基礎(chǔ)基礎(chǔ)2 Chromatography一詞中一詞中Chromato的英文意思為的英文意思為色。色。 Chromatography 分析技術(shù)分析技術(shù) Chromatograph 分析儀器分析儀器 Chromatogram 色譜圖、圖譜色譜圖、圖譜基礎(chǔ)基礎(chǔ)3HPLC儀器的構(gòu)成儀器的構(gòu)成檢測(cè)器檢測(cè)器泵泵脫氣裝置脫氣裝置柱溫箱柱溫箱進(jìn)樣器進(jìn)樣器電信號(hào)電信號(hào)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本組成基本組成 脫氣裝置脫氣裝置將洗脫液中氧氣等其它氣體將洗脫液中氧氣等其它氣體除去的裝置。除去的裝置。真空腔內(nèi)裝有特氟綸（聚四真

3、空腔內(nèi)裝有特氟綸（聚四氟乙烯）管，以特氟綸管作氟乙烯）管，以特氟綸管作為膜將氣體除去。為膜將氣體除去。常用的脫氣方式有常用的脫氣方式有:吹氦脫吹氦脫氣法、低壓脫氣法、超聲波氣法、低壓脫氣法、超聲波脫氣法。脫氣法。真空泵真空泵真空腔真空腔基本組成基本組成 脫氣裝置脫氣裝置洗脫液進(jìn)入高壓泵前應(yīng)充分脫氣，目的是：洗脫液進(jìn)入高壓泵前應(yīng)充分脫氣，目的是：1、氣泡留在泵中影響泵的正常工作，使洗脫液的、氣泡留在泵中影響泵的正常工作，使洗脫液的壓力不穩(wěn)，造成基線的噪音增加；壓力不穩(wěn)，造成基線的噪音增加；2、洗脫液中的氧能破壞樣品，降低檢測(cè)器的靈敏、洗脫液中的氧能破壞樣品，降低檢測(cè)器的靈敏度；度；3、當(dāng)洗脫液流

4、出色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)，由于洗脫、當(dāng)洗脫液流出色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)，由于洗脫液壓力下降，產(chǎn)生氣泡，影響檢測(cè)器正常工作。液壓力下降，產(chǎn)生氣泡，影響檢測(cè)器正常工作。基本組成基本組成 泵泵往進(jìn)樣器往進(jìn)樣器系統(tǒng)中的送液裝置系統(tǒng)中的送液裝置泵的重要之處：泵的重要之處： 可以在高壓下使用可以在高壓下使用 壓力的變動(dòng)小壓力的變動(dòng)小 以恒定的流速將洗脫液壓以恒定的流速將洗脫液壓送至色譜柱送至色譜柱綜上所述，對(duì)泵的精度要求綜上所述，對(duì)泵的精度要求是非常高的。是非常高的。泵的構(gòu)造泵的構(gòu)造放大放大柱塞向右運(yùn)動(dòng)時(shí)，上面的球柱塞向右運(yùn)動(dòng)時(shí)，上面的球形單向閥會(huì)向下運(yùn)動(dòng)；下面形單向閥會(huì)向下運(yùn)動(dòng)；下面的球形單向閥會(huì)向上運(yùn)動(dòng)。的球

5、形單向閥會(huì)向上運(yùn)動(dòng)。當(dāng)柱塞向左運(yùn)動(dòng)時(shí)，球形單當(dāng)柱塞向左運(yùn)動(dòng)時(shí)，球形單向閥的運(yùn)動(dòng)方向相反。向閥的運(yùn)動(dòng)方向相反。球形單向閥球形單向閥柱塞密封圈柱塞密封圈柱塞泵柱塞柱塞泵柱塞泵的工作原理泵的工作原理球形單向閥的內(nèi)部構(gòu)造球形單向閥的內(nèi)部構(gòu)造CartridgeSpacerCheck Valve GuideSheet PackingSheet Packing排出側(cè)排出側(cè)吸入側(cè)吸入側(cè)基本組成基本組成123654將分析對(duì)象將分析對(duì)象/樣品導(dǎo)入樣品導(dǎo)入色譜柱的裝置。色譜柱的裝置。最近，可以完成自動(dòng)進(jìn)樣最近，可以完成自動(dòng)進(jìn)樣的自動(dòng)進(jìn)樣器的自動(dòng)進(jìn)樣器/裝置已成為裝置已成為主流。主流。 進(jìn)樣器進(jìn)樣器泵泵色譜柱色譜柱進(jìn)

6、樣環(huán)進(jìn)樣環(huán)基本組成基本組成 柱溫箱柱溫箱使色譜柱保持一定溫度的裝置。使色譜柱保持一定溫度的裝置。柱壓是色譜柱工作中的一個(gè)重要指標(biāo)。當(dāng)使用粘柱壓是色譜柱工作中的一個(gè)重要指標(biāo)。當(dāng)使用粘度較高的洗脫液時(shí)，通過(guò)提高柱溫可以降低洗脫度較高的洗脫液時(shí)，通過(guò)提高柱溫可以降低洗脫液的粘度。另外，使用柱溫箱可以避免由于室溫液的粘度。另外，使用柱溫箱可以避免由于室溫改變而導(dǎo)致柱分離時(shí)間改變的情況發(fā)生。改變而導(dǎo)致柱分離時(shí)間改變的情況發(fā)生。可以說(shuō)，柱溫箱是高效液相色譜分析裝置中的不可以說(shuō)，柱溫箱是高效液相色譜分析裝置中的不可缺的部件?？扇钡牟考??；窘M成基本組成檢測(cè)器檢測(cè)器系統(tǒng)中檢測(cè)樣品經(jīng)柱分離出的各組分的裝置。系統(tǒng)

7、中檢測(cè)樣品經(jīng)柱分離出的各組分的裝置。根據(jù)樣品、感度等性質(zhì)的不同，檢測(cè)器可分為：根據(jù)樣品、感度等性質(zhì)的不同，檢測(cè)器可分為：1. 紫外可見光檢測(cè)器紫外可見光檢測(cè)器（UV-8020）2. 示差檢測(cè)器示差檢測(cè)器（RI-8020、RI-8021）3. 電導(dǎo)率檢測(cè)器電導(dǎo)率檢測(cè)器（CM-8020）4. 電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器（EC-8020） 其他還有熒光檢測(cè)器、光散射檢測(cè)器等多種檢測(cè)器。其他還有熒光檢測(cè)器、光散射檢測(cè)器等多種檢測(cè)器。紫外可見光檢測(cè)器紫外可見光檢測(cè)器石英杯石英杯原理與分光光度計(jì)相同原理與分光光度計(jì)相同OUT（ （ABU）log 透過(guò)光透過(guò)光吸收光吸收光Ref（透過(guò)光）（透過(guò)光）Sam（吸收

8、光）（吸收光）通常表示為：通常表示為：1ABU/1V或或Record Lens/10V光光吸収光吸収光透過(guò)光透過(guò)光UV檢測(cè)池檢測(cè)池示差檢測(cè)器示差檢測(cè)器RefSamRefSam受光部受光部利用各檢測(cè)池中溶劑折射率利用各檢測(cè)池中溶劑折射率差異的檢測(cè)器。差異的檢測(cè)器?？梢宰R(shí)別溶劑組成上的些微可以識(shí)別溶劑組成上的些微區(qū)別。（顯示為色譜峰的差區(qū)別。（顯示為色譜峰的差異）異）檢測(cè)兩者折射率之差檢測(cè)兩者折射率之差通常表示為：通常表示為：25610-6RIU/1V或或Record Lens/10V基本組成基本組成數(shù)據(jù)處理裝置數(shù)據(jù)處理裝置根據(jù)檢測(cè)器檢測(cè)出的電信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算根據(jù)檢測(cè)器檢測(cè)出的電信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算/

9、處理的裝置。處理的裝置。過(guò)去使用描筆式記錄儀進(jìn)行色譜譜圖的確認(rèn)?，F(xiàn)過(guò)去使用描筆式記錄儀進(jìn)行色譜譜圖的確認(rèn)?，F(xiàn)在大都使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集、處理分析等在大都使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集、處理分析等工作了。工作了。分析結(jié)果舉例分析結(jié)果舉例Column: TSKgel ODS-100V (4.6mmI.D. x 15cmL)Eluent: 0.1% TFA in (H2O/CH3CN=99/1)Flow rate: 1.0mL/minDetector: UV (270nm)Injection vol.: 5LColumn temp.: 251: L-ascorbic acid2: nicotinami

10、de3: nicotinic acid 4: thiamine 5: pyridoxal 6: pyridoxine123456基本組成基本組成 色譜柱色譜柱FLOW進(jìn)樣一側(cè)進(jìn)樣一側(cè)往檢測(cè)器往檢測(cè)器色譜柱是樣品中不同組分色譜柱是樣品中不同組分得以分離的場(chǎng)所。得以分離的場(chǎng)所。色譜柱中填充有硅膠類或聚合色譜柱中填充有硅膠類或聚合物樹脂類的分離介質(zhì)。物樹脂類的分離介質(zhì)。根據(jù)填充的分離介質(zhì)的不同，根據(jù)填充的分離介質(zhì)的不同，色譜柱可分為反相、正相、離色譜柱可分為反相、正相、離子、離子交換、子、離子交換、分子尺寸排阻、分子尺寸排阻、親合等多種分離模式。親合等多種分離模式。分離原理分離原理 色譜柱色譜柱將目

11、的物將目的物/組分進(jìn)行有效分離組分進(jìn)行有效分離的最為重要的部件的最為重要的部件所謂色譜柱，即通常指在一根不銹鋼的柱管內(nèi)，所謂色譜柱，即通常指在一根不銹鋼的柱管內(nèi)，填充有粒徑極其微小的粉末（膠體填充有粒徑極其微小的粉末（膠體/凝膠）而成。凝膠）而成。分離原理分離原理HPLC色譜柱填料色譜柱填料色譜柱中填充有如左圖色譜柱中填充有如左圖所示的填料。所示的填料。稱之為稱之為GEL（凝膠體）（凝膠體）填料粒徑大小為：填料粒徑大小為：幾幾十微米（幾幾十微米（m）分離原理分離原理填料表面有很多凹凸不平的小孔填料表面有很多凹凸不平的小孔（幾（幾nm幾百幾百nm ）。）。這些小孔的孔徑大小、填料表面這些小孔的孔

12、徑大小、填料表面的表面積大小均是非常重要的參的表面積大小均是非常重要的參數(shù)。數(shù)。通常，色譜柱中填料形狀為圓球通常，色譜柱中填料形狀為圓球形。形。分離原理分離原理北新地日本料理日本料理四川料理四川料理卡拉卡拉OK桑拿洗浴桑拿洗浴利用上圖簡(jiǎn)單說(shuō)明色譜的分離原理：如圖所示，在餐飲休閑娛樂(lè)一條街利用上圖簡(jiǎn)單說(shuō)明色譜的分離原理：如圖所示，在餐飲休閑娛樂(lè)一條街的入口處，有三位男士的入口處，有三位男士A、B、C經(jīng)過(guò)。經(jīng)過(guò)。A不喜歡喝酒也不喜歡唱歌等休閑活動(dòng)、不喜歡喝酒也不喜歡唱歌等休閑活動(dòng)、B盡管不太愛喝酒卻非常喜歡唱盡管不太愛喝酒卻非常喜歡唱歌、歌、C既喜歡喝酒也喜歡唱歌洗浴等?？梢灶A(yù)測(cè)，最初從這條街走出

13、的應(yīng)既喜歡喝酒也喜歡唱歌洗浴等?？梢灶A(yù)測(cè)，最初從這條街走出的應(yīng)該是該是A，然后是，然后是B，最后才是，最后才是C。分離原理分離原理 整理如下整理如下餐飲休閑娛樂(lè)內(nèi)容餐飲休閑娛樂(lè)內(nèi)容 分離的要素分離的要素經(jīng)過(guò)的男士經(jīng)過(guò)的男士A、B、C 需要分離的組分需要分離的組分街道街道 柱材柱材當(dāng)分離要素發(fā)生變化（如：增設(shè)游戲廳）、或當(dāng)分離要素發(fā)生變化（如：增設(shè)游戲廳）、或經(jīng)過(guò)客人的心情發(fā)生變化時(shí)，經(jīng)過(guò)客人的心情發(fā)生變化時(shí)，A、B、C三位男三位男士的行動(dòng)可能會(huì)發(fā)生改變。士的行動(dòng)可能會(huì)發(fā)生改變。柱內(nèi)的填料柱內(nèi)的填料柱內(nèi)樣品柱內(nèi)樣品分配色譜分配色譜砂糖砂糖汽油汽油流動(dòng)方向流動(dòng)方向固定相（油）固定相（油）流動(dòng)相流動(dòng)

14、相（水）（水）離子交換色譜離子交換色譜陽(yáng)離子樣品陽(yáng)離子樣品陰離子樣品陰離子樣品流動(dòng)方向流動(dòng)方向固定相固定相流動(dòng)相流動(dòng)相+分子尺寸排阻色譜分子尺寸排阻色譜ABCABC123時(shí)間方向時(shí)間方向色譜柱的種類色譜柱的種類1. 反相反相/逆相色譜：逆相色譜：RPC(Reversed-phase chromatography)2. 正相正相/順相色譜：順相色譜：NPC(Normal phase chromatography)3. 離子交換色譜：離子交換色譜：IEC(Ion-exchange chromatography)4. 離子色譜：離子色譜：IC(Ion chromatography)色譜柱的種類色譜柱的種類5. 疏水色譜：疏水色譜：HIC(Hydrophobic interaction chromatography)6. 親合色譜：親合色譜：AFC(Affinity chromatography)7. 分子尺寸排阻色譜：分子尺寸排阻色譜：SEC(Size exclusion chromatography)色譜的基本用語(yǔ)色譜的基本用語(yǔ)Inj保留時(shí)間保留時(shí)間(RT)峰頂峰頂基線基線峰高（峰高（H） 半峰寬半峰寬色譜峰色譜峰 色譜的基本用語(yǔ)色