細(xì)胞工程植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交

1、第十三章 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交2021-11-30 1960年，英國植物生理學(xué)家年，英國植物生理學(xué)家Cocking首次獲得煙首次獲得煙草葉片原生質(zhì)體，酶解細(xì)胞壁法。草葉片原生質(zhì)體，酶解細(xì)胞壁法。 1971年，年，Nagata 和和 Takebe首次從煙草葉肉組織首次從煙草葉肉組織的原生質(zhì)體中誘導(dǎo)出再生植株。的原生質(zhì)體中誘導(dǎo)出再生植株。 種間或?qū)匍g甚至科間完成了原生質(zhì)體融合，并種間或?qū)匍g甚至科間完成了原生質(zhì)體融合，并再生為體細(xì)胞雜種（再生為體細(xì)胞雜種（somatic hybrid）植株。植株。2021-11-302021-11-30conventional crossing proced

2、ures can be realized by protoplast fusion The Tomatoffel - a product ofintergeneric hybridization 2021-11-30原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) Protoplast culture 主要目的主要目的：實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣物種的體細(xì)胞雜交。外源染：實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣物種的體細(xì)胞雜交。外源染色體、色體、DNA或細(xì)胞器導(dǎo)入，創(chuàng)造遠(yuǎn)緣新種?；蚣?xì)胞器導(dǎo)入，創(chuàng)造遠(yuǎn)緣新種。 流程流程：原生質(zhì)體分離：原生質(zhì)體分離 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) 體細(xì)胞體細(xì)胞雜交雜交 雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞 產(chǎn)生愈傷組織產(chǎn)生愈傷組織再生植株。再生植株。 2021-

3、11-30原生質(zhì)體：指植物細(xì)胞脫去細(xì)胞壁的、裸露的、有原生質(zhì)體：指植物細(xì)胞脫去細(xì)胞壁的、裸露的、有生活力的原生質(zhì)團(tuán)。生活力的原生質(zhì)團(tuán)。原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) ：指將植物細(xì)胞游離成原生質(zhì)體，在：指將植物細(xì)胞游離成原生質(zhì)體，在適宜的培養(yǎng)條件下，依據(jù)細(xì)胞的全能性使其再生細(xì)適宜的培養(yǎng)條件下，依據(jù)細(xì)胞的全能性使其再生細(xì)胞壁，進(jìn)行細(xì)胞的分裂分化，并發(fā)育成完整植株的胞壁，進(jìn)行細(xì)胞的分裂分化，并發(fā)育成完整植株的過程過程。 第一節(jié)第一節(jié) 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的概念及意義體細(xì)胞雜交的概念及意義 2021-11-30原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：1 1單細(xì)胞無性系的建立單細(xì)胞無

4、性系的建立 2 2遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體。遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體。3 3多種基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)體系。多種基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)體系。4 4體細(xì)胞雜種的形成。體細(xì)胞雜種的形成。 2021-11-30體細(xì)胞雜交的概念體細(xì)胞雜交的概念 又稱又稱原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合（protoplast fusion） 指在人工控制條件下，不經(jīng)過有性過程，兩種體指在人工控制條件下，不經(jīng)過有性過程，兩種體細(xì)胞原生質(zhì)體相互融合產(chǎn)生雜種的方法。細(xì)胞原生質(zhì)體相互融合產(chǎn)生雜種的方法。 由融合細(xì)胞培養(yǎng)成的植株為由融合細(xì)胞培養(yǎng)成的植株為體細(xì)胞雜種體細(xì)胞雜種。2021-11-30原生質(zhì)體自發(fā)融合和誘發(fā)融合原生質(zhì)體自發(fā)融合和誘發(fā)融合 當(dāng)細(xì)胞壁被溶解后

5、，胞間連絲發(fā)生膨大，相當(dāng)細(xì)胞壁被溶解后，胞間連絲發(fā)生膨大，相鄰細(xì)胞原生質(zhì)和細(xì)胞器通過膨大的胞間連絲鄰細(xì)胞原生質(zhì)和細(xì)胞器通過膨大的胞間連絲融合形成同核體，實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體的自發(fā)融合。融合形成同核體，實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體的自發(fā)融合。僅限于同一物種內(nèi)。僅限于同一物種內(nèi)。2021-11-30第二節(jié)第二節(jié) 植物原生質(zhì)體分離植物原生質(zhì)體分離細(xì)胞壁主要成分：纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)細(xì)胞壁主要成分：纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)等。和少量蛋白質(zhì)等。原生質(zhì)體分離方法：原生質(zhì)體分離方法： 機(jī)械分離法機(jī)械分離法 酶解分離法酶解分離法2021-11-30一、原生質(zhì)體分離一、原生質(zhì)體分離- -機(jī)械分離法機(jī)械分離法 方法：方法

6、：利器或機(jī)械磨損利器或機(jī)械磨損等，使等，使細(xì)胞壁破損細(xì)胞壁破損，促使，促使原生質(zhì)體釋放。原生質(zhì)體釋放。 將材料置于高滲糖溶液中預(yù)處理，使其發(fā)生質(zhì)壁將材料置于高滲糖溶液中預(yù)處理，使其發(fā)生質(zhì)壁分離，然后用利刀切割或機(jī)械磨損組織，傷口處分離，然后用利刀切割或機(jī)械磨損組織，傷口處可以釋放出完整的原生質(zhì)體?？梢葬尫懦鐾暾脑|(zhì)體。 只能獲得只能獲得少量原生質(zhì)體少量原生質(zhì)體，完整的原生質(zhì)體更少。，完整的原生質(zhì)體更少。 2021-11-30一、原生質(zhì)體分離一、原生質(zhì)體分離- -酶解分離法酶解分離法 可獲得大量原生質(zhì)體。不必發(fā)生質(zhì)壁分離，對活細(xì)胞可獲得大量原生質(zhì)體。不必發(fā)生質(zhì)壁分離，對活細(xì)胞的傷害較輕。的傷

7、害較輕。 常用酶類：常用酶類： 纖維素酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶纖維素酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶。崩潰酶。 果膠酶類，包括果膠酶果膠酶類，包括果膠酶、離析酶離析酶。 蝸牛酶蝸牛酶 胼胝質(zhì)酶胼胝質(zhì)酶主要用于花粉母細(xì)胞和四主要用于花粉母細(xì)胞和四分孢子原生質(zhì)體分離分孢子原生質(zhì)體分離2021-11-30原生質(zhì)體原生質(zhì)體2021-11-30二、原生質(zhì)體的純化二、原生質(zhì)體的純化酶液處理后的混合液酶液處理后的混合液： 完整的未損傷原生質(zhì)體完整的未損傷原生質(zhì)體 亞細(xì)胞碎屑（葉綠體和微管等）亞細(xì)胞碎屑（葉綠體和微管等） 未消化細(xì)胞未消化細(xì)胞 破碎或損傷原生質(zhì)體等破碎或損傷原生質(zhì)體等清除這些雜質(zhì)的

8、過程為原生質(zhì)體純化。清除這些雜質(zhì)的過程為原生質(zhì)體純化。純化方法：沉降法純化方法：沉降法 漂浮法漂浮法 不連續(xù)梯度法不連續(xù)梯度法2021-11-30沉降法沉降法 方法：比重小的等滲溶液中，對酶解物先過濾，方法：比重小的等滲溶液中，對酶解物先過濾，再低速離心，使完整的原生質(zhì)體沉降于管底。再低速離心，使完整的原生質(zhì)體沉降于管底。 滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇。滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇。 篩網(wǎng)過濾：除去大的組織碎片和殘?jiān)?，孔徑篩網(wǎng)過濾：除去大的組織碎片和殘?jiān)?，孔?4169m，依原生質(zhì)體大小來定。依原生質(zhì)體大小來定。 離心：離心：9004500r/min。2021-11-30漂浮法漂浮法方法：比重大的等滲溶液，使

9、原生質(zhì)體漂浮在液方法：比重大的等滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在液體表層。體表層。滲透壓調(diào)節(jié)劑：蔗糖。滲透壓調(diào)節(jié)劑：蔗糖。優(yōu)點(diǎn)：不易受損，成本低。優(yōu)點(diǎn)：不易受損，成本低。不足：對離心力要求比較嚴(yán)格，掌握不好，原生不足：對離心力要求比較嚴(yán)格，掌握不好，原生質(zhì)體不易漂浮。質(zhì)體不易漂浮。2021-11-30不連續(xù)梯度法不連續(xù)梯度法采用兩種比重不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通采用兩種比重不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過離心使原生質(zhì)體與破損細(xì)胞分別處于不同液過離心使原生質(zhì)體與破損細(xì)胞分別處于不同液相中，從而純化原生質(zhì)體的方法。相中，從而純化原生質(zhì)體的方法。2021-11-30葉肉原生質(zhì)體分離純化葉肉原生質(zhì)體分離純化2

10、021-11-302021-11-30純化后的葉肉原生質(zhì)體純化后的葉肉原生質(zhì)體2021-11-30三、原生質(zhì)體活力測定三、原生質(zhì)體活力測定原生質(zhì)體活力關(guān)系到細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂和分化原生質(zhì)體活力關(guān)系到細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂和分化以及再生植株的形成，反映了原生質(zhì)體分離和純化以及再生植株的形成，反映了原生質(zhì)體分離和純化技術(shù)的成敗。技術(shù)的成敗。2021-11-30四、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素四、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素 原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的首要條件是獲得大量、完原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的首要條件是獲得大量、完整、有活力的原生質(zhì)體。整、有活力的原生質(zhì)體。 影響因素主要有：供試材料、酶的種類和組合影響因素主

11、要有：供試材料、酶的種類和組合及酶解時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑、質(zhì)膜穩(wěn)定劑、及酶解時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑、質(zhì)膜穩(wěn)定劑、pH值、光照和溫度等。值、光照和溫度等。2021-11-30（一）供試材料（一）供試材料1.1. 自然生長材料的幼嫩葉片。自然生長材料的幼嫩葉片。 2.2. 無菌實(shí)生苗子葉和下胚軸。無菌實(shí)生苗子葉和下胚軸。3.3. 外植體來源的愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。外植體來源的愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。 4.4. 花粉細(xì)胞花粉細(xì)胞2021-11-30（二）酶的種類、組合和酶解時(shí)間（二）酶的種類、組合和酶解時(shí)間 草本植物：草本植物：23種酶混合液。纖維素酶為種酶混合液。纖維素酶為0.5%3%，果膠酶為，

12、果膠酶為0.1%1%。 木本植物木本植物 ：纖維素酶同草本，果膠酶更多。：纖維素酶同草本，果膠酶更多。 成熟花粉粒和四分體小孢子：除纖維素酶類和果成熟花粉粒和四分體小孢子：除纖維素酶類和果膠酶類外，尚需降解胼胝質(zhì)層的蝸牛酶和胼胝質(zhì)膠酶類外，尚需降解胼胝質(zhì)層的蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶，濃度為酶，濃度為0.5%2%。 2021-11-30( (三三) ) 滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑 常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和鹽類常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和鹽類等。等。 不同物種原生質(zhì)體分離時(shí)，所需的滲透壓穩(wěn)定不同物種原生質(zhì)體分離時(shí)，所需的滲透壓穩(wěn)定劑也不同。劑也不同。 原生質(zhì)體在輕微高滲溶液中比在等滲溶液

13、中更原生質(zhì)體在輕微高滲溶液中比在等滲溶液中更為穩(wěn)定。為穩(wěn)定。 較高水平的滲透劑可以阻止原生質(zhì)體的破裂和較高水平的滲透劑可以阻止原生質(zhì)體的破裂和出芽，但同時(shí)也可能會抑制原生質(zhì)體的分裂。出芽，但同時(shí)也可能會抑制原生質(zhì)體的分裂。 2021-11-30（四）質(zhì)膜穩(wěn)定劑（四）質(zhì)膜穩(wěn)定劑常用：常用： 葡聚糖硫酸鉀（葡聚糖硫酸鉀（0.2%0.3%） MES2-（N-嗎啉）嗎啉）-乙烷磺酸乙烷磺酸 氯化鈣（氯化鈣（0.11.0 M） 磷酸二氫鉀等。磷酸二氫鉀等。2021-11-30（五）（五）pH值值 酶的活性與酶的活性與pH值有關(guān)。值有關(guān)。 低低pH值（值（4.5）：酶活力強(qiáng)，原生質(zhì)體分離速度）：酶活力強(qiáng)，

14、原生質(zhì)體分離速度快，但原生質(zhì)體活力差?？?，但原生質(zhì)體活力差。 pH值偏高：酶活力差，原生質(zhì)體分離速度慢，完值偏高：酶活力差，原生質(zhì)體分離速度慢，完整原生質(zhì)體數(shù)目較多。整原生質(zhì)體數(shù)目較多。2021-11-30（六）光照和溫度（六）光照和溫度 酶的活力與溫度也有關(guān)系。酶的活力與溫度也有關(guān)系。 酶的最適溫度是酶的最適溫度是4050。 分離原生質(zhì)體溫度：分離原生質(zhì)體溫度：2530。 分離原生質(zhì)體的過程要在黑暗條件下進(jìn)行：脫分離原生質(zhì)體的過程要在黑暗條件下進(jìn)行：脫壁的原生質(zhì)體對光非常敏感。壁的原生質(zhì)體對光非常敏感。2021-11-30第三節(jié)第三節(jié) 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 過程：一般情況下，原生

15、質(zhì)體在適宜的過程：一般情況下，原生質(zhì)體在適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件下經(jīng)培養(yǎng)下經(jīng)培養(yǎng)24d可再生細(xì)胞壁，并很可再生細(xì)胞壁，并很快進(jìn)行細(xì)胞分裂，快進(jìn)行細(xì)胞分裂，3060d出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)，以后細(xì)胞繼續(xù)分裂增殖，幾個月后形成愈團(tuán)，以后細(xì)胞繼續(xù)分裂增殖，幾個月后形成愈傷組織或胚狀體，最后形成完整的小植株。傷組織或胚狀體，最后形成完整的小植株。2021-11-30一、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法一、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法 類似于單細(xì)胞培養(yǎng)。類似于單細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)方法有三種培養(yǎng)方法有三種: : 液體淺層培養(yǎng)法液體淺層培養(yǎng)法 固體平板培養(yǎng)法固體平板培養(yǎng)法 雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法2021-11-

16、302021-11-30雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法 液體液體- -固體雙層培養(yǎng)法：固體雙層培養(yǎng)法：將原生質(zhì)體懸液涂布在固體瓊脂培養(yǎng)基表面。將原生質(zhì)體懸液涂布在固體瓊脂培養(yǎng)基表面。 固體固體- -固體雙層培養(yǎng)法：固體雙層培養(yǎng)法：將原生質(zhì)體懸液與瓊脂混合，涂布在固體瓊脂將原生質(zhì)體懸液與瓊脂混合，涂布在固體瓊脂培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)基表面。2021-11-30液體淺層培養(yǎng)法液體淺層培養(yǎng)法 方法：將原生質(zhì)體懸液于培養(yǎng)皿中淺層靜止培方法：將原生質(zhì)體懸液于培養(yǎng)皿中淺層靜止培養(yǎng)。養(yǎng)。 特點(diǎn)：每天輕輕晃動兩三次，加強(qiáng)通氣。特點(diǎn)：每天輕輕晃動兩三次，加強(qiáng)通氣。 當(dāng)原生質(zhì)體經(jīng)細(xì)胞壁再生，并形成細(xì)胞團(tuán)后，當(dāng)原生質(zhì)體經(jīng)細(xì)胞壁再生

17、，并形成細(xì)胞團(tuán)后，應(yīng)立即轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以利分化形成應(yīng)立即轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以利分化形成植株。植株。2021-11-30二、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素二、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體活力原生質(zhì)體活力原生質(zhì)體起始密度原生質(zhì)體起始密度滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)條件：光照和溫度培養(yǎng)條件：光照和溫度植物材料和基因型植物材料和基因型2021-11-30原生質(zhì)體起始密度原生質(zhì)體起始密度 常用：常用：104105個個/ml。 濃度較高：由不同的原生質(zhì)體形成的細(xì)胞團(tuán)彼濃度較高：由不同的原生質(zhì)體形成的細(xì)胞團(tuán)彼此交錯生長在一起，形成嵌合體組織。此交錯生長在一起，形成嵌合體組織。 濃度

18、低于濃度低于103個個/ml：細(xì)胞壁再生后，僅分裂細(xì)胞壁再生后，僅分裂12次，就無法繼續(xù)分裂。次，就無法繼續(xù)分裂。2021-11-30滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體是在高滲透壓中生長，再生出細(xì)胞壁，形原生質(zhì)體是在高滲透壓中生長，再生出細(xì)胞壁，形成細(xì)胞團(tuán)后，應(yīng)逐漸降低滲透壓，最后轉(zhuǎn)至不含滲成細(xì)胞團(tuán)后，應(yīng)逐漸降低滲透壓，最后轉(zhuǎn)至不含滲透壓劑的新鮮培養(yǎng)基中，才能很好地分化。透壓劑的新鮮培養(yǎng)基中，才能很好地分化。 2021-11-30培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng)常用：原生質(zhì)體培養(yǎng)常用：MS、B5、NT、N6、MT或它們的衍生培養(yǎng)基?；蛩鼈兊难苌囵B(yǎng)基。 無機(jī)鹽濃度要低，適當(dāng)提高無機(jī)鹽濃度要低，

19、適當(dāng)提高Ca2+、Mg2+含量而含量而降低降低NO3-含量，有助于提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，含量，有助于提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞分裂。促進(jìn)細(xì)胞分裂。2021-11-30培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件光照：光照： 培養(yǎng)初期需要黑暗或微弱的散射光。培養(yǎng)初期需要黑暗或微弱的散射光。 誘導(dǎo)器官發(fā)生時(shí)，則須強(qiáng)光照。誘導(dǎo)器官發(fā)生時(shí)，則須強(qiáng)光照。溫度：溫度： 一般為一般為2430，但不同物種間差異比較大。，但不同物種間差異比較大。2021-11-30三、原生質(zhì)體再生過程三、原生質(zhì)體再生過程1、細(xì)胞壁再生、細(xì)胞壁再生2、細(xì)胞分裂和愈傷組織或胚狀體形成、細(xì)胞分裂和愈傷組織或胚狀體形成3、植株再生、植株再生2021-11-3

20、0細(xì)胞壁再生的過程細(xì)胞壁再生的過程 過程：先是質(zhì)膜合成細(xì)胞壁主要成分微纖維，過程：先是質(zhì)膜合成細(xì)胞壁主要成分微纖維，然后在質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用，生成多片層的然后在質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用，生成多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜和片層結(jié)構(gòu)之間、或在膜上結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜和片層結(jié)構(gòu)之間、或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團(tuán)，最產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團(tuán)，最后形成完整細(xì)胞壁。后形成完整細(xì)胞壁。 再生壁的成分不同于其來源細(xì)胞：主要成分為再生壁的成分不同于其來源細(xì)胞：主要成分為非纖維素多糖，即葡萄糖占非纖維素多糖，即葡萄糖占65%，纖維素只占，纖維素只占5%。2021-11-30檢測新壁合成的方法檢測

21、新壁合成的方法 主要有：熒光增白劑法和電鏡技術(shù)。主要有：熒光增白劑法和電鏡技術(shù)。 熒光增白劑是專一性地與細(xì)胞壁纖維素的熒光增白劑是專一性地與細(xì)胞壁纖維素的-葡萄葡萄糖苷鍵特異地結(jié)合，因而可以用來檢測細(xì)胞壁糖苷鍵特異地結(jié)合，因而可以用來檢測細(xì)胞壁的再生從而確定原生質(zhì)體活力。的再生從而確定原生質(zhì)體活力。 有活力的原生質(zhì)體經(jīng)染色后，可在細(xì)胞質(zhì)膜的有活力的原生質(zhì)體經(jīng)染色后，可在細(xì)胞質(zhì)膜的周圍觀察到熒光環(huán)。周圍觀察到熒光環(huán)。2021-11-302021-11-302 2、細(xì)胞分裂和愈傷組織或胚狀體形成、細(xì)胞分裂和愈傷組織或胚狀體形成 原生質(zhì)體細(xì)胞壁的存在是進(jìn)行規(guī)則有絲分裂的原生質(zhì)體細(xì)胞壁的存在是進(jìn)行規(guī)則

22、有絲分裂的前提。前提。 再生細(xì)胞并不一定都能進(jìn)行細(xì)胞有絲分裂。再生細(xì)胞并不一定都能進(jìn)行細(xì)胞有絲分裂。 原生質(zhì)體植板率（分裂頻率）變化很大，從原生質(zhì)體植板率（分裂頻率）變化很大，從0.1%到到80%。2021-11-302021-11-30葉肉原生質(zhì)體愈傷組織葉肉原生質(zhì)體愈傷組織2021-11-30原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中會發(fā)生有絲分裂不正常的現(xiàn)象會發(fā)生有絲分裂不正常的現(xiàn)象原因：原因： 核分裂和胞質(zhì)分裂的不平衡所致。核分裂和胞質(zhì)分裂的不平衡所致。 高濃度的酶處理損傷了質(zhì)膜，影響質(zhì)膜形成細(xì)高濃度的酶處理損傷了質(zhì)膜，影響質(zhì)膜形成細(xì)胞壁的正常功能。胞壁的正常功能。 細(xì)胞質(zhì)系統(tǒng)尤其是高爾基體

23、的功能不正常。細(xì)胞質(zhì)系統(tǒng)尤其是高爾基體的功能不正常。2021-11-303 3、植株再生、植株再生原生質(zhì)體培養(yǎng)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，可形成不定芽和不定根或形成胚狀體結(jié)基中，可形成不定芽和不定根或形成胚狀體結(jié)構(gòu)后直接發(fā)育成植株。構(gòu)后直接發(fā)育成植株。2021-11-302021-11-30馬鈴薯原生質(zhì)體再生植株馬鈴薯原生質(zhì)體再生植株2021-11-30四、原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中的遺傳變異四、原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中的遺傳變異 適應(yīng)性變異適應(yīng)性變異 為非遺傳變異，會隨著環(huán)境條件的改變喪失其變?yōu)榉沁z傳變異，會隨著環(huán)境條件的改變喪失其變異特征。異特征。 遺傳性變

24、異遺傳性變異 能穩(wěn)定傳遞給后代，涉及到染色體和基因變異，能穩(wěn)定傳遞給后代，涉及到染色體和基因變異，影響著生物性狀的表達(dá)。影響著生物性狀的表達(dá)。 2021-11-30第四節(jié)第四節(jié) 植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交2021-11-30（一）化學(xué)融合（一）化學(xué)融合 化學(xué)融合劑：化學(xué)融合劑： NaNO3 高高PH-高濃度鈣離子高濃度鈣離子 聚乙二醇聚乙二醇 溶菌酶溶菌酶 明膠明膠 抗體抗體 植物凝集素（伴刀豆球蛋白植物凝集素（伴刀豆球蛋白A） 聚乙烯醇等。聚乙烯醇等。2021-11-301 1 NaNONaNO3 3 融合法融合法 原理：鈉離子能中和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷，使原理：鈉離子能中和原生質(zhì)體表面的

25、負(fù)電荷，使凝聚的原生質(zhì)體的質(zhì)膜緊密接觸，促進(jìn)細(xì)胞融合。凝聚的原生質(zhì)體的質(zhì)膜緊密接觸，促進(jìn)細(xì)胞融合。 融合率為融合率為0.1%4%。2021-11-302高高pH-高濃度鈣離子融合法高濃度鈣離子融合法 原理：鈣離子濃度決定著細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和可原理：鈣離子濃度決定著細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和可塑性，促使原生質(zhì)體膜的結(jié)合，而高塑性，促使原生質(zhì)體膜的結(jié)合，而高pH又能改又能改變質(zhì)膜的表面電荷，從而有利于細(xì)胞融合。變質(zhì)膜的表面電荷，從而有利于細(xì)胞融合。 融合率為融合率為10%左右。左右。 鈣離子濃度和鈣離子濃度和pH值范圍因植物種類的不同而不值范圍因植物種類的不同而不同。同。2021-11-30高高pH-高濃度鈣離子融合方法（煙草）高濃度鈣離子融合方法（煙草）a.兩親本原生質(zhì)體混合（兩親本原生質(zhì)體混合（1：1）；）；b.離心使原生質(zhì)體沉集在一起；離心使原生質(zhì)體沉集在一起；c.去上清液，加入去上清液，加入2ml融合液（融合液（50mmol/LCaCl2H2O +400mmol/L甘露醇，甘露醇，pH10.5）；）；d.離心使原生質(zhì)體沉積，于離心使原生質(zhì)體沉積，于37中水浴中水浴30min；e.用清洗介質(zhì)（甘露醇，用清洗介質(zhì)（甘露醇，CaCl2H2O