探討兔脂肪源性干細(xì)胞在顱骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用

1、探討兔脂肪源性干細(xì)胞在顱骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用摘要： 目的 :探討脂肪源性干細(xì)胞作為骨組織工程的種子細(xì)胞在修復(fù)兔顱骨缺損中的應(yīng)用前景 .方法 :提取兔脂肪源性干細(xì)胞， 成骨誘導(dǎo)并檢測(cè)， 將成骨誘導(dǎo)前后的脂肪源性干細(xì)胞種植到自制松質(zhì)骨支架上，將細(xì)胞支架復(fù)合物和單純支架材料分別移植至兔顱骨缺損部位.結(jié)果 :與未誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合支架、單純支架以及空白處理對(duì)比， 成骨誘導(dǎo)后的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合支架修復(fù)骨缺損面積最大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 關(guān)鍵詞：脂肪源性干細(xì)胞；異種松質(zhì)骨；支架材料；骨代用品；生物醫(yī)學(xué)工程；成骨誘導(dǎo)；種子細(xì)胞0 引言如何獲得充足的種子細(xì)胞是長(zhǎng)期以來(lái)限制組織工程研究的瓶頸， 骨髓基

2、質(zhì)干細(xì)胞盡管已被廣泛應(yīng)用于組織工程研究，但由于其干細(xì)胞含量過(guò)低、 骨髓抽取量有限以及對(duì)患者造成的創(chuàng)傷等，使其廣泛應(yīng)用到受限. 20XX 年 Zuk 等 1從脂肪組織中成功提取了干細(xì)胞，并成功誘導(dǎo)其向骨、軟骨、脂肪、心肌等多個(gè)方向誘導(dǎo)分化 .我們將成骨誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞（cells ，ADSCs）與異種松質(zhì)骨支架復(fù)合，移植至兔顱骨缺損部位，以探討成骨誘導(dǎo)脂肪源性干細(xì)胞修復(fù)骨缺損的應(yīng)用前景.1 材料和方法材料新西蘭大白兔12 只， 4 mo 齡，體質(zhì)量 kg （第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）； Dolbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基（ DMEM），胎牛血清（ FBS），地塞米松，抗壞血酸， 甘

3、油磷酸鈉（美國(guó)Sigma 公司）；堿性磷酸酶（ ALP）活性測(cè)定試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司），牛股骨，甲醇，氯仿，300 g/L H2O2等（市售） .方法的分離培養(yǎng) 1將新西蘭大白兔按mL/kg 速眠新麻醉，取頸部后正中3 cm 切口，無(wú)菌切取肩胛上脂肪組織約2 mL. 清除切取組織中肉眼可見的小血管，去除外包膜和明顯的結(jié)締組織，沖洗3 遍以洗去紅細(xì)胞的污染.切碎成糊狀，加入2 g/L 型膠原酶5 mL，在37水浴攪拌消化40 min，過(guò)濾，加入兩倍體積 DMEM培養(yǎng)液（含 100 mL/L FBS, 1 ×105U/L 青霉素 , 1 ×105 U/L 鏈霉素 )

4、 ，1000 r/min ，離心 10 min ，傾去上層脂肪及上清，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞 , 接種至 25 cm2 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) , 種植密度× 104/cm2. 在 37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) ,3 d后換液，觀察原代細(xì)胞的生長(zhǎng) . 細(xì)胞融合達(dá) 90%時(shí)用 g/L 胰蛋白酶消化傳代 . 的成骨誘導(dǎo)在第 1 次換液時(shí)將部分細(xì)胞改為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液 ( 基礎(chǔ)培養(yǎng)液加 10 nmol/L 地塞米松， 10 mmol/L 甘油磷酸鈉， 50 mg/L 抗壞血酸 1)培養(yǎng) .細(xì)胞融合達(dá) 90%時(shí)用 g/L胰蛋白酶消化傳代 .活性測(cè)定將第 2 代 ADSCs以 5×103/ 孔的密度接種于96 孔板

5、中 , 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo) 0，3，6，9，12，15 d 后,PBS 漂洗 , 加入 50 L 細(xì)胞裂解液 4過(guò)夜 , ALP 活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)ALP活性 .茜素紅染色取成骨誘導(dǎo)1 wk 的細(xì)胞爬片培養(yǎng) 1 wk,PBS 沖洗 3 遍， 950mL/L 乙醇固定 10 min ，蒸餾水沖洗 3 次， 1 g/L 茜素紅于 37染色 30 min ，蒸餾水沖洗，干燥，封片 .松質(zhì)骨支架的制備取市售牛股骨，將股骨頭松質(zhì)骨加工成直徑10 mm，厚 2 mm的骨片 .將骨片置入 11的甲醇氯仿 100 mL中脫脂 24 h ，12 h 換液1 次，蒸餾水沖洗 .將脫脂后的骨片置入300 mL/L

6、H2O2100 mL中脫蛋白 48 h，每 12 h 換液 1 次.蒸餾水沖洗 .將脫脂、脫蛋白后的骨片置入mol/L的 HCL中脫鈣 5 min，蒸餾水沖洗 .將脫脂、脫蛋白、脫鈣后的松質(zhì)骨片低溫晾干，密封包裝， Co60滅菌備用 .種植細(xì)胞前將成品松質(zhì)骨無(wú)菌條件下PBS液中浸泡 7 d ，分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液中浸泡3 d.細(xì)胞的種植及檢測(cè)將ADSCs和成骨誘導(dǎo) 15 d 的 ADSCs用 g/L胰蛋白酶消化，離心，分別用基礎(chǔ)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液懸浮, 調(diào)整細(xì)胞密度至1×1010/L.將基礎(chǔ)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液中浸泡的松質(zhì)骨支架轉(zhuǎn)移至24 孔培養(yǎng)板中，分別種植上述細(xì)胞懸浮液 1

7、00 L，置 37培養(yǎng)箱內(nèi) 6 h 使細(xì)胞貼壁，然后分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液及誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng) . 將復(fù)合后培養(yǎng) 5 d 的細(xì)胞 支架復(fù)合物固定，干燥，噴金，掃描電鏡觀察 . 復(fù)合培養(yǎng) 7 d 后手術(shù)植入顱骨缺損部位 .動(dòng)物分組及處理將 12 只大白兔按 mL/kg 速眠新麻醉， 取雙側(cè)顱骨直徑 10 mm鉆孔，24 孔分為 4 組，每組 6 孔. 支架 +成骨誘導(dǎo) ADSCs（A 組）； 支架 +ADSCs（B 組）； 單純支架（ C 組）； 對(duì)照組（ D組） . A ，B 組植入上述成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合異種松質(zhì)骨支架， 所用細(xì)胞均為自體細(xì)胞；C組植入單純的松質(zhì)骨支架， 為前述松質(zhì)骨

8、成品 PBS液中浸泡 7 d，9 g/L NaCl溶液中浸泡 3 d 后植入； D 組不做處理 . 術(shù)前術(shù)后肌注慶大霉素， 2 萬(wàn) U/kg. 術(shù)后 14 wk用過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死動(dòng)物，取材， X 線攝片，計(jì)算成骨面積， HE 染色行組織學(xué)分析 .統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示 , 應(yīng)用 SPSS醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行檢驗(yàn) . P）. 支架 +成骨誘導(dǎo) ADSCs組的成骨面積大于其余 3 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<，表 2），其余各組間成骨面積無(wú)顯著性差異 . 表 2 兔顱骨缺損修復(fù)的定量分析組織學(xué)分析 HE染色可見各組均有不同程度的新骨形成，尤以支架 +成骨誘導(dǎo) ADSCs

9、組新骨形成最為顯著 .支架 +成骨誘導(dǎo) ADSCs組，支架 +ADSCs組和單純支架組均可見支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成， 支架吸收、新骨形成均以支架 +成骨誘導(dǎo) ADSCs組最為顯著（圖 3）.3 討論ADSCs是一種新的干細(xì)胞，能夠向骨、軟骨、心肌細(xì)胞等多個(gè)方向分化 1. ADSCs可經(jīng)抽脂術(shù)獲得， 安全性較高， 不良反應(yīng)少，患者容易接受， ASCs 在體外增殖和誘導(dǎo)時(shí)對(duì)血清的要求較低 2-5 .在抗壞血酸、地塞米松、 磷酸甘油鈉的誘導(dǎo)下， ADSCs的 ALP的表達(dá)增多，誘導(dǎo) 2 wk 后，茜素紅染色陽(yáng)性，提示有鈣結(jié)節(jié)的形成，而非誘導(dǎo)組茜素紅染色為陰性，提示 ADSCs向成骨

10、方向的分化 . 20XX年 Lee 等 6將 ADSCs 應(yīng)用于體內(nèi)成骨研究，將成骨誘導(dǎo)后的 ADSCs復(fù)合多孔 PLA材料埋植于大鼠皮下， 8 wk 后有骨組織生成 . 將成骨誘導(dǎo)的 ADSCs與可吸收材料相復(fù)合，有望用于修復(fù)骨缺損 . Alejandro 等 3將成骨誘導(dǎo)后的 ADSCs用于修復(fù)大鼠腭骨缺損，12 wk 后，在缺損部位發(fā)現(xiàn)了新生的骨組織 . Stefan 等 7將 ADSCs與自體松質(zhì)骨顆粒和纖維蛋白膠相混合， 成功用于修復(fù)一 7 歲女孩大面積顱骨缺損， 盡管還不能確定這其中 ADSCs起了多大的作用，但這一臨床病例確實(shí)令關(guān)注 ADSCs 的人們大受鼓舞 .異種骨來(lái)源廣泛，

11、 沒有傳播疾病的潛在危險(xiǎn)性， 且因骨組織結(jié)構(gòu)在不同種屬動(dòng)物間存在高度同源性，其骨小梁、小梁間隙、空隙率、骨內(nèi)管腔系統(tǒng)及骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)有利于組織細(xì)胞粘附、 生長(zhǎng)，并為細(xì)胞外基質(zhì)的分泌提供寬大的內(nèi)部空間及表面積，加之其無(wú)機(jī)成分主要是羥基磷灰石， 與人骨成分相同， 因此，異種骨結(jié)構(gòu)植入體內(nèi)后易被宿主組織細(xì)胞接近而發(fā)生爬行替代及生物降解，應(yīng)當(dāng)是較理想的載體材料 8-10 .我們將自制脫鈣、去抗原后的異種松質(zhì)骨用于骨組織工程的支架材料，將其與 ADSCs相復(fù)合，用于修復(fù)骨缺損 . 結(jié)果表明，脫鈣、去抗原后的異種松質(zhì)骨具有良好的生物相容性， 成骨誘導(dǎo)前后的 ADSCs均能在其表面良好生長(zhǎng)， 植入體內(nèi)后

12、，能夠被逐步吸收 . 脫鈣、去抗原后的異種松質(zhì)骨可用作骨組織工程的支架 .我們所用細(xì)胞為自體細(xì)胞， 最大程度減小了因機(jī)體免疫力的不同而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的影響 . 植入體內(nèi) 12 wk 后，取材 X 線攝片結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)后的ADSCs復(fù)合異種松質(zhì)骨支架后能夠更好地修復(fù)骨缺損，而未誘導(dǎo)的支架 +ADSCs、單純支架、對(duì)照組 3 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 . HE 染色結(jié)果顯示支架 +成骨誘導(dǎo)ADSCs組，支架 +ADSCs組和單純支架組均可見支架材料不同程度被吸收， 沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成，但均以支架 +成骨誘導(dǎo) ADSCs組最為顯著 . 成骨誘導(dǎo)后的 ADSCs促進(jìn)了骨缺損的修復(fù) .

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