酵母菌混合培養(yǎng)物對木質(zhì)纖維素稀酸水解液原位脫毒乙醇發(fā)酵

1、酵母菌混合培養(yǎng)物對木質(zhì)纖維素稀酸水解液原位脫毒乙醇發(fā)酵酵母菌混合培養(yǎng)物對木質(zhì)纖維素稀酸水解液原位脫毒乙醇發(fā)酵摘要：為降低抑制劑對乙醇發(fā)酵影響，同時能夠有效代謝木糖提高乙 醇產(chǎn)率，進行了樹干畢赤酵母與高耐毒酵母共發(fā)酵未脫毒木質(zhì)纖維素稀酸 水解液研究。本實驗室分離的釀酒酵母y5和東方伊薩酵母y4均能在發(fā)酵 過程中代謝稀酸水解液中的糠醛和5輕甲基糠醛，通過y5和樹干畢赤酵 母以及y4和樹干畢赤酵母兩組混合菌種的發(fā)酵比較表明：y5和樹干畢赤 酵母混合培養(yǎng)物在含糠醛和5 疑甲基糠醛合成培養(yǎng)基和未脫毒稀酸水解液 的乙醇產(chǎn)率分別為0.46g/g和0.44g/g,達到了理論產(chǎn)率的91.2%和87.5%。 實驗

2、表明樹干畢赤酵母與y5混合培養(yǎng)物原位脫毒木質(zhì)纖維素稀酸水解液 是一種有效的方法。關(guān)鍵詞：木糖；糠醛和5輕甲基糠醛；樹干畢赤酵母；未脫毒水解液 乙醇發(fā)酵；混合菌0引言在以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇的研究開發(fā)領(lǐng)域中，稀酸水解是一種 有效且經(jīng)濟的處理方法之一。但稀酸水解法存在的主要問題是水解產(chǎn) 物中存在微生物發(fā)酵抑制劑，如糠醛，5-hmf（ 5-甕甲基糠醛），甲酸、乙 酸、和苯系化合物，主耍抑制劑糠醛、5-hmf的含量對菌體生長具有不同 程度影響。為了降低毒性，發(fā)酵之前對水解液進行如堿中和處理、overliming法處理3、活性炭吸附、離子交換樹脂吸附4等脫毒方法會增加成本口 使發(fā)酵過程復雜化，利用能

3、降解某些毒性物質(zhì)的菌種作為發(fā)酵菌種是降低 抑制作用簡單有效方法。據(jù)報道，只有少數(shù)酵母菌能夠耐受水解液中的 抑制劑，例如 saccharomyces cerevisiae tmb 3400 , s.cerevisiae tmb 3006 和coniochaeta ligniaria nrrl30616能夠?qū)⒖啡?- hmf轉(zhuǎn)變成低毒性物質(zhì) 發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇。但是這些菌大多不能代謝木糖產(chǎn)乙醇7。樹干畢赤 酵母能夠發(fā)酵木糖且有高的乙醇產(chǎn)率，而lohmeier - vogel等人研究 發(fā)現(xiàn)畢赤酵母對糠醛、疑甲基糠醛和乙酸等抑制因子比較敏感。因此， 利用樹干畢赤酵母和耐毒酵母混合發(fā)酵水解液是一種可行的

4、方法?；旌暇糜谀咎呛推咸烟腔旌咸前l(fā)酵和脫毒水解液有過報道,nan fu等人用 zymomonas mobilis和pachysolen tannophilus混合菌發(fā)酵木糖和葡萄糖混 合糖/旦是沒有研究抑制劑對發(fā)酵的影響10,錢名宇采用混合菌發(fā)酵稀酸 水解液，水解液在發(fā)酵之前己經(jīng)過煮沸脫毒處理llo用一種菌進行水解液發(fā)酵也有過報道，keikhosro karimi等發(fā)現(xiàn) mucor indicus菌能夠利用葡萄糖和木糖并且耐受抑制劑，但是在水解液批 式發(fā)酵中菌體生長完全抑制，補料批式發(fā)酵中，木糖只有部分利用12 o frank k等人用pichia stipitis cbs 6054發(fā)酵玉米

5、秸稈水解液，因該水解液的 糠醛量低于0.8g/l13,樹干畢赤酵母的生長沒有受到太大影響。但是將混合菌用于未脫毒水解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇未見報道。s. cerevisiae y5 和issatchenkia orientalis y4是兩株分離的酵母菌'均能夠降解糠醛和疑甲基 糠醛，本研究將y5和y4分別與pichia stipitis cbs 6054混合,在含有和水解 液相同含量糠醛、釋甲基糠醛的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，尋找既能利用木糖 和葡萄糖產(chǎn)乙醇，又能耐受抑制劑的一種組合,將這種最優(yōu)組合用于未脫毒 稀酸水解液發(fā)酵。1 材料與方法1. 1菌種樹干畢赤酵母cbs6054 (pichia.

6、stipitis cbs6054)由首都師范大學微 牛物學系保藏，該菌種能夠同時代謝木糖和葡萄糖，釀酒酵母y5 ( s. cerevisiae)和東方伊薩酵母y4 ( i. orientalis)從糠醛廠分離篩選，y5 和y4均能夠代謝葡萄糖且具有高抑制劑耐受性。1. 2培養(yǎng)基(g/l)1. 2. 1增殖培養(yǎng)基：葡萄糖20,酵母膏10,蛋白月東20,ph5.05.51. 2. 2發(fā)酵培養(yǎng)基a：葡萄糖24,木糖13,酵母膏10,蛋白月東20,糠醛1.37, 5-hmf0.47, ph5.0b：葡萄糖24,木糖13,酵母膏10,蛋白月東20,ph5.0c：葡萄糖24,酵母膏10,蛋白腺20,糠醛1

7、.37, 5-hmf0.47,ph5.0d：葡萄糖24,酵母膏10,蛋白20, ph5.0e：木糖込 酵母膏10,蛋白腺20,糠醛1.37,5-hmf0.47zph5.0f：木糖13,酵母膏10,蛋白h東20,ph5.01. 3木質(zhì)纖維素稀酸水解液本研究所用木質(zhì)纖維素稀酸水解液由華東理工大學化學工程系提供, 滅菌后，測定其主要成分(g/l)：葡萄糖15.4,木糖66糠醛1.37, 5-hmf0.47,乙酸 10 等，發(fā)酵前向培養(yǎng)基中加入10 g/l酵母膏,20 "l蛋口腺，用ca (oh) 2調(diào) 節(jié) ph5.0o1. 4酵母接種物制備將斜面保藏的菌種接種于100ml增殖培養(yǎng)基中，30

8、 °c、150rpm樹干 畢赤酵母cbs6054培養(yǎng)12h, y5和y4培養(yǎng)14h。經(jīng)測定樹干畢赤酵母 cbs6054、y5 和 y4 的細胞干重分別為 3.0g/l、3.3g/l 和 2.7g/l01. 5 發(fā)酵1. 5. 1單菌發(fā)酵增殖培養(yǎng)的樹干畢赤酵母cbs6054、y5和y4菌液分別取5ml分別接 種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基a、c、d、e、f中,c和d、e和f形成對照。 30 °c、80rpm發(fā)酵，定時取樣，測定測定乙醇產(chǎn)量、殘?zhí)橇?、糠醛量?5hmf量。1. 5. 2混合菌發(fā)酵5ml樹干畢赤酵母cbs6054菌液和5ml y5菌液混合分別接種于100ml 發(fā)酵培養(yǎng)基

9、a、b中，5ml樹干畢赤酵母cbs6054菌液和5ml y4菌液混合 分別接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基a、b中，a和b形成對照。30 °c、80rpm 發(fā)酵，定時取樣，測定乙醇產(chǎn)量、殘?zhí)橇?、糠醛量?-hmf量。1. 5. 3未脫毒稀酸水解液發(fā)酵5ml樹干畢赤酵母cbs6054菌液和5ml y5菌液混合接種于100ml未經(jīng) 任何脫毒處理的稀酸水解液中，30 °c、80rpm發(fā)酵，定時取樣，測定乙 醇產(chǎn)量、殘?zhí)橇?、糠醛量?-hmf量。1. 6分析方法1. 6. 1糖濃度測定樣品經(jīng)0.12 u m微型過濾器過濾，用高效液相色譜儀(high-liquidchromatograph

10、y hplc, waters 2690)測定樣品中葡萄糖和木糖的含量。測定 條件：氨柱(200 x4. 6mm),柱溫40°c, waters410視差測器，流動相已 水二85： 15,進樣量 20 hl.1. 6. 2乙醇含量測定樣品經(jīng)0.12 u m微型過濾器過濾，用sp-3420氣相色譜測定乙醇含量。測定條件:柱溫80 °c,注射室溫度150 °c,檢測器溫度50 °c,進樣量0.5 u l o1. 6. 3糠醛量和5-hmf含量測定樣品經(jīng)0.12 u m微型過濾器過濾，用sp-3420氣相色譜測定乙醇含量。測定條件:柱溫120°c,注射

11、室溫度200 °c,檢測器溫度50 °c,進樣量0.5 p l o 1.6. 4發(fā)酵液中混合菌相對比例測定在顯微鏡下混合菌的形態(tài)大小很容易分辨，通過血細胞計數(shù)板測定發(fā) 酵液中混合菌的相對比例。1. 7計算方法高效液相色譜和氣相色譜的計算方法均采用樣品峰面積與標準峰面積相比較獲得。乙醇含量的計算方法：x = (s1 xc)/s2 xloo %式中,x 樣品中乙醇含量,g/l;sl 樣品峰面積;c 標準溶液濃度g/l; s2 標準溶液峰面積?？啡┖?-hmf含量計算方法同乙醇含量。乙醇生成率計算公式:x = cl/( c2 x0.51)xl00%式中,x 乙醇生成率;cl 測得

12、的乙醇含量;c2 消耗糖的量g/l2結(jié)果與討論2. 1單菌發(fā)酵2.1.1 y5、y4和樹干畢赤酵母cbs6054的單糖發(fā)酵從圖1、圖2和圖3可以看出，純葡萄糖培養(yǎng)基中，無抑制劑存在時，y5和y4比樹干畢赤酵母利用葡萄糖的速度快，y5和y4發(fā)酵12 h,將 葡萄糖用完，樹干畢赤酵母需要24 h,發(fā)酵培養(yǎng)基中的糠醛和5輕甲基糠 醛，使樹干畢赤酵母葡萄糖利用時間延遲到36 h,但對y5和y4沒有明 顯影響。純木糖培養(yǎng)基中，無抑制劑存在時，樹干畢赤酵母80 rpm發(fā)酵72 h 將木糖用完，木糖濃度11.4g/l,乙醇產(chǎn)率5.3g/l (圖4),而y5和y4不 能利用木糖。當加入1.37g/l糠醛和0.

13、47g/l 5-羥甲基糠醛時，樹干畢赤酵 母生長受到抑制。從以上結(jié)果得出：y5和y4具有很高的耐毒性，并且高效利用葡萄糖 產(chǎn)乙醇，但是不能代謝木糖，樹干畢赤酵母既可以代謝葡萄糖又可以代謝 木糖產(chǎn)乙醇，耐毒性不高。圖1 y5葡萄糖發(fā)酵(“ + ”表示加入1.37g/l糠醛和0.47g/l5輕甲基 糠醛)figi glucose fermentation of y5(<< + , addingl.37g/l furfural and 0.47g/l 5-hmf)圖2 y4葡萄糖發(fā)酵fig2 glucose fermentation of y4圖3樹干畢赤酵母cbs6054葡萄糖發(fā)酵fi

14、g3 glucose fermentation of pichia stipitis cbs6054圖4樹干畢赤酵母cbs6054木糖發(fā)酵fig4 xylose fermentation of pichia stipitis cbs60542.1.2 y5、y4和樹干畢赤酵母cbs6054葡萄糖和木糖混合發(fā)酵對樹干畢赤酵母進行混合糖發(fā)酵(圖5),糠醛和拜甲基，樹t畢赤酵母出 現(xiàn)72 h延滯期，葡萄糖96h代謝完，木糖沒有利用完全，乙醇產(chǎn)量為15.8g/l, 為理論產(chǎn)量的88%.對y5和y4進行混合糖發(fā)酵(圖6圖7), y5和y4只能利 用葡萄糖，不能利用木糖，乙醇產(chǎn)量分別為12.8g/l和9.

15、8g/lo圖5樹干畢赤酵母cbs6054混合糖發(fā)酵(+ ) ( “ + ”表示加入1.37g/l糠醛和0.47g/l 5輕甲基糠醛)fig5 fermentation of glucose/xylose mixtures using p.stipitis cbs6054("+addingl37g/lfurfural and 0.47g/l 5-hmf)圖6 y5混合糖發(fā)酵(+)fig6 fermentation of glucose/xylose mixtures usingy5(+)圖7 y4混合糖發(fā)酵(+)fig7 fermentation of glucose/xylose m

16、ixtures using y4(+)2.2混合菌混合糖發(fā)酵水解液成分復雜，糠醛和5-hmf是主要抑制劑，向發(fā)酵培養(yǎng)基加入和 水解液中等量的糠醛和5-hmf,進一步篩選出能夠用于未脫毒水解液發(fā)酵 的混合菌。圖8看出，y5和樹干畢赤酵母混合發(fā)酵，木糖在144 h全部用完，發(fā) 酵培養(yǎng)基的糠醛和5-hmf 12 h全部降解完。發(fā)酵oh, 12h和144h,發(fā)酵液 中兩種菌的相對比例分別為2:3, 2:1和1:4,乙醇產(chǎn)量為16.6g/l,乙醇產(chǎn) 率0.46g /g,達到理論產(chǎn)率的91.2%,圖8和圖9比較可以得出，y5生長 降解抑制劑，解除了樹t畢赤酵母生長因抑制劑存在而出現(xiàn)的延滯期，同 時發(fā)酵液中

17、兩種菌的比例說明y5和樹干畢赤酵母不存在很強的競爭，使 樹干畢赤酵母生長良好并能將木糖利用完。圖10看出，y4將糠醛和5-hmf12h全部降解，綜合圖10和圖可 以得出，木糖幾乎沒被利用，說明y4在發(fā)酵液中是優(yōu)勢菌，將樹干畢赤 酵母排擠，從而木糖幾乎沒有減少。圖8和圖10比較，y5和樹干畢赤酵母混合發(fā)酵效果較好，既可以降 解糠醛和5-hmf,又可以代謝木糖提高乙醇產(chǎn)量，同時解除了樹干畢赤酵 母生長因高濃度抑制劑存在而出現(xiàn)的延滯期。圖8樹干畢赤酵母cbs6054和y5混合菌混合糖發(fā)酵(+)fig8 fermentation of glucose/xylose mixtures using p.s

18、tipitis cbs6054 and y5 (+)圖9樹干畢赤酵母cbs6054和y5混合菌混合糖發(fā)酵fig9 fermentation of glucose/xylose mixtures using p.stipitis cbs6054 and y5圖10樹干畢赤酵母cbs6054和y4混合菌混合糖發(fā)酵(+)figlo fermentation of glucose/xylose mixtures using p.stipitis cbs6054 and y4(+)圖n樹干畢赤酵母cbs6054和y4混合菌混合糖發(fā)酵figll fermentation of glucose/xylose

19、 mixtures using p.stipitis cbs6054 and y42. 3未脫毒稀酸水解液發(fā)酵將y5和樹干畢赤酵母混合培養(yǎng)物進一步用于未脫毒稀酸水解液發(fā)酵, 圖12結(jié)果表明80rpm發(fā)酵，葡萄糖16 h用完，糠醛和5-hmf在葡萄糖用 完之前已降解,168h木糖用完。最大乙醇產(chǎn)量9.6g/l,乙醇產(chǎn)率0.44g /g , 達到理論值的87.5%,發(fā)酵oh, 16h和168h,發(fā)酵液中兩種菌的相對比例 分別為2:3, 2:1和l:7o圖12 y5和樹干畢赤酵cbs6054混合菌未脫毒稀酸水解液發(fā)酵figl2 ferme ntation of non detoxified hydr

20、olysate with co-culture of y5 and pichia stipitis cbs6054frank k.等研究了轉(zhuǎn)速對樹干畢赤酵母cbs6054水解液發(fā)酵的影響，當 轉(zhuǎn)速為100 rpm時發(fā)酵時間96 h,轉(zhuǎn)速為150rpm時發(fā)酵時間縮短為48 h13,但是轉(zhuǎn)速提高使更多糖用于菌體生長而轉(zhuǎn)變成乙醇的量降低，因此 為了提高乙醇產(chǎn)量，本實驗采用轉(zhuǎn)速80 rpm,木糖利用時間會相應延長, 但乙醇產(chǎn)率較高。當發(fā)酵培養(yǎng)基中無抑制劑時，y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌發(fā)酵 144h將木糖代謝完全，比樹干畢赤酵母單獨代謝木糖時間長,可能是y5在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙醇和乙酸等代謝

21、產(chǎn)物對樹干畢赤酵母有反饋抑制，具 體原因有待于進一步研究。當發(fā)酵培養(yǎng)基屮有1.37g/l糠醛和047g/l5輕甲基糠醛時，樹干畢赤 酵母沒有將木糖代謝完全。y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌同樣144h 將木糖代謝完全，這說明y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌發(fā)酵未脫毒 水解液具有可行性。發(fā)酵oh, 16h和168h,水解液中兩種菌的相對比例分別為2:3, 2:1和 1:7,發(fā)酵開始葡萄糖利用階段y5生長速度很快，一旦葡萄糖利用完全， y5停止生長，畢赤酵母開始利用木糖產(chǎn)乙醇，在水解液中兩種菌最后的比 例為1:7,說明它們的兼容性很好。y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌發(fā)酵未脫毒水

22、解液，木糖代謝時間 延長，乙醇產(chǎn)率為0.44g/g ,低于合成培養(yǎng)基的乙醇產(chǎn)率，可能由于水解液 中還含有乙酸和酚類等毒性物質(zhì)，對菌體生長和發(fā)酵具有抑制作用。今后我們可以通過對混合菌固定化或 采用補料批式發(fā)酵等方法做進一步研究，縮短水解液發(fā)酵時間，降低其它 毒性物質(zhì)如乙酸和酚類的抑制作用。3結(jié)論綜合以上實驗結(jié)果，我們可以得出以下結(jié)論：(1) 兩株分離的酵母y4和y5能夠耐受和降解糠醛和5疑甲基糠醛并且 在12h將葡萄糖用完但是不能利用木糖，而樹干畢赤酵母80rpm72h代謝 完木糖產(chǎn)乙醇但是對抑制劑耐受度不高，綜合這三種菌的優(yōu)點，采用了混 合菌發(fā)酵。(2) 混合糖發(fā)酵培養(yǎng)中加入和水解液中相同量糠

23、醛和5疑甲基糠醛，y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合發(fā)酵效果較好，能夠代謝完木糖產(chǎn)乙醇，同 時將1.37g/l糠醛和047g/l5疑甲基糠醛降解完,發(fā)酵oh, 12h和144h, 發(fā)酵液中兩種菌的相對比例分別為2:3, 2:1和1:4,乙醇產(chǎn)量為16.6g/l , 乙醇產(chǎn)率為0.46g/g達到理論值的91.2%。y4和樹干畢赤酵母cbs6054混 合發(fā)酵雖然可以將1.37g/l糠醛和0.47g/l5疑甲基糠醛降解完，但是木糖 沒有利用。所以y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合是最優(yōu)組合。(3) y5和樹干畢赤酵母cbs6054共發(fā)酵未脫毒木質(zhì)纖維素稀酸水解液， 木糖用完，糠醛和5梵甲基糠醛降

24、解完，發(fā)酵oh, 16h和168h,發(fā)酵液中 兩種菌的相對比例分別為2:3, 2:1和1:7,乙醇產(chǎn)量為9.6g/l ,乙醇產(chǎn)率 為0.44g/g達到理論值的87.5%o因此y5和樹干畢赤酵母cbs6054混合菌 發(fā)酵未脫毒稀酸水解液是一種可行的方法。今后應該摸索更好的發(fā)酵條件, 相信可以達到更好的實驗效果。參考文獻1 tania i. georgieva , birgitte k. ahring.evaluation of continuous ethanol fermentation of diluteacid corn stover hydrolysate using thermophi

25、lican aerobic bacterium thermoa naerobacter bg1l1j. appl microbiol biotechnol ,2007),77:61-68.2 薛環(huán)，蒲歡，孫春寶纖維素稀酸水解產(chǎn)物中發(fā)酵抑制物的去除方法j纖維素科學技術(shù),2004,12( 3):48- 53.3 sola nge ines mussatto，ines con ceicao roberto. alter natives for detoxificati on of dilute2acid ligno cellulose hydrolyzates for use in fermenta

26、tive processes : a reviewj .bioresource technology, 2004,93 :l-10.4 nigam j n. waterhyacinth(eichhornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to motor fuel ethanol by xylose-fermenting yeast j biotechnology, 2002 ,97 :107 116.5 palmqvist e, hahn hagerdal b, szengyel zetal. simultaneous detoxific

27、ation and enzyme production of hemicellulose hydrolysates obtained after steam pretreatment j.enzmicrobtechnol j997,20:286 293.6 b?rbel hahnh?gerdal, kaisa karhumaa ,cesar fonseca 用tai.towards industrialpentose-fermenting yeast strainsjappl microbiolbiotechnol ,2007,74:937-9537 nancy n. nichols, bru

28、ce s. dienr ,gema m. guisaoo, eta i.bioabatement to remove inhibitors from biomass-derived sugar hydrolysates j.applied biochemistry a ndbiotechnologyvol, 2005,121-124/379-390.8 du preez jc, prior ba. a quantitative screening of some xylose fermenting yeast isolatesj.biotechnol lett ,1985,7:241-2489

29、 lohmeiervogel,e.m,sopher;etal.lntracellular acidification as mechanism for the inhibition by acid hydrolysis-derived inhibitors of xylose fermentatio n by yeasts .journal of in dustrial microbiologybiotechnology,1998,20:75-80.10 nan fu , paul peiris.co-fermentation of a mixture of glucose and xylos

30、e to ethanolby zymomonas mobilis and pachysolen tannophilusj. world j microbiol biotechnol (2008) 24:1091-1097.11 錢名宇，張晶，李學鳳，等木質(zhì)纖維素稀酸水解液游離細胞乙醇發(fā) 酵j 太陽能學報,2006,27(4):340-344.12 keikhosro karimi, tomas brandberg,lars edebozetal.fed-batch cultivation of mucor indicus in dilute-acid lignocellulosic hydro

31、lyzate for ethanol production.j.biotechnology letters, 2005,27:1395-1400.13 frank k. agbogbo z kevin s. wenger .production of ethanol from corn stover hemicellulose hydrolyzate using pichia stipitisj. j ind microbiol biotechnol ,2007,34:723-727co-fermentation of nondetoxified dilute-acidhydrolysate

32、for ethanol production by pichia stipitis and hightoxic tolerance saccharomyces abstract: in order to reduce negative effect of inhibitory compounds in ethanol production and utilize xylose efficiently to increase ethanol yield ,co-fermentation of nondetox訐ied dilute-acid hydrolyzsate by pichia stip

33、itis and saccharomyces with high toxic tolera nee was con ducted. two n ewly isolated strai ns in our lab, saccharomyces cerevisiae y5 and issatchenkia orientalis y4, which can metabolize furfural and 5hydroxymethyl furfural were combined with p.stipitis cbs6054 respectively the results indicated y5

34、 and p.stipitis cbs6054 is the optimum co-culture ,and the ethanol yield in synthetic medium with furfural and 5 hydroxymethyl furfural and in non detox 訐 ied dilute-acid hydrolyzsate were 0. 47g/g and 0. 44g/g respectively, corresp on ding to 92. 2 % and 87.5% of theoretical ethanol yield. these results dem on strate that co-fermen