重癥肌無(wú)力相關(guān)抗體及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

1、及御惦2018-03-29 10:29:48中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生2018年5期雷國(guó)華劉建軍李尊波摘要重癥肌無(wú)力是抗體介導(dǎo)、累及神經(jīng)肌肉接頭的獲得性自身免疫性疾病，除了常見(jiàn)的乙酰 膽堿受體抗體及肌肉特異性酪氨酸激酶抗體外，重癥肌無(wú)力還存在其他臨床少見(jiàn)抗體；通過(guò)對(duì)重癥肌 無(wú)力中出現(xiàn)的多種相關(guān)抗體及檢測(cè)方法分析，提高對(duì)該疾病的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。關(guān)鍵詞重癥肌無(wú)力；連接素抗體；蘭尼堿受體抗體；放射免疫法；熒光細(xì)胞染色方法中圖分類(lèi)號(hào)r746.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼a 文章編1673-9701 (2018) 05-0165-04abstract myasthenia gravis is an antibody-mediated

2、acquired autoimmune disease, which in volves in n euromuscular juncti ons. in additi on to comm on acetylcholi ne receptor an tibodies and muscle-specific tyrosine kinase antibodies, there are other clinically rare antibodies of myasthenia gravis. through the analysis of a variety of myasthenia grav

3、is related antibodies and detection methods, further understanding of the disease is improved.key words myasthenia gravis； catenin antibody； raney-base receptor antibody； radioimm un oassay： fluoresce nt cell staining重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis, mg)主要是由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody, achr-ab)介

4、導(dǎo)、累及神經(jīng)肌肉接頭的獲得性自身免疫性疾病。全身型mg患者中約 80%可檢測(cè)出achr-ab,僅有不足10%的mg患者肌肉特異性酪氨酸激酶抗體(musclespecific tyrosine kinase, musk)陽(yáng)性，但是，仍有小部分mg患者血清achr-ab和muskab均呈陰性, 這部分mg被稱(chēng)之為血清雙陰性重癥肌無(wú)力2。隨著檢測(cè)方法的不斷提高，血清雙陰性mg患者中 發(fā)現(xiàn)了多種mg相關(guān)抗體，現(xiàn)主要對(duì)mg臨床少見(jiàn)抗體及檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)，提高對(duì)該疾病的進(jìn)一 步認(rèn)識(shí)。1 mg相關(guān)抗體1.1常見(jiàn)抗體20世紀(jì)70年代lindstrom等在85%mg患者的血清屮檢測(cè)到achr-ab,從而確立了

5、mg在 b細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中的地位。2001年hoch w等4在70%achr-ab陰性mg患者的血 清中發(fā)現(xiàn)了 muskab。achr-ab主要w lgg1和lgg3亞類(lèi)，其通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的突觸后膜損傷，受 體胞吞以及achr阻滯作用產(chǎn)生嚴(yán)重的achr損失5, muskab為lgg4亞類(lèi)，其不激活補(bǔ)充，主 要是與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 4 (low-density lipoprotein receptor-related protein 4, lrp4)相 互作用，從而抑制蛋白依賴(lài)性的achr聚簇6。lrp4又被稱(chēng)為多表皮生長(zhǎng)因子樣域7 (multiple epidermal gro

6、wth factor-like domains 7, megf7) , 20門(mén)年，higuchi o 等7首次在 dsn-mg 患 者血清中檢測(cè)出了 lrp4ab, lrp4ab屬于igg,過(guò)去一直認(rèn)為lrp4與脂質(zhì)代謝、肢體發(fā)育等有 關(guān)8。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其通過(guò)抑制神經(jīng)元釋放的agrin與胞外lrp4的結(jié)合，使得agrin-lrp4-musk 信號(hào)傳導(dǎo)通路破壞而致病9。然而，mg發(fā)病中，achr-ab ®害突觸后膜，psmr-ab通過(guò)抑制突觸 前膜慢k+通道，使得突觸前膜的動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，導(dǎo)致乙酰膽堿袈泡遷移及釋放改變，從而影響 肌纖維興奮收縮的發(fā)生，瑕終導(dǎo)致信號(hào)釋放階段的障礙。

7、1.2檸檬酸提取物相關(guān)抗體(cae-ab)和連接素抗體(titin-ab)60年代初人們利用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)在mg患者血清中含有與骨骼肌橫紋肌切片交叉著色的一 種自身抗體，其后證明了胸腺的肌樣細(xì)胞與該抗體反應(yīng)10。檸檬酸提取物相關(guān)抗體(citric acid extract antibody, cae-ab),存在于胸腺、骨胳肌及心肌。1981年，aarli ja等x在胸腺瘤mg患者的 血清樣品發(fā)現(xiàn)能與mg患者產(chǎn)生反應(yīng)的骨骼肌檸椽酸提取物抗原成分為titin蛋白，該蛋白又稱(chēng)連接 素，是骨骼肌和心肌中除粗細(xì)肌原纖維之外的第3種結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白長(zhǎng)約1 pm,由27000個(gè)氨基 酸組成。titin蛋

8、口特殊的排列方式可增強(qiáng)肌節(jié)的穩(wěn)定性、靜止張力。隨后，gautel m等口2證實(shí)titin 蛋白的主要免疫原性區(qū)域被稱(chēng)為titin-30,位于a/i帶交界區(qū)，另一個(gè)免疫原性區(qū)域位于n1和n2z 間。近年來(lái)，連接素抗體(titin antibody, titin-ab)被認(rèn)為是mgt患者血清中重要的自身抗體之一。 mg與胸腺功能紊亂之間存在和互關(guān)系，約75%mg患者存在不同程度的胸腺異常13o cae-ab多 見(jiàn)于mgt,黃載慧等口4利用elisa方法檢測(cè)cea-ab及titin-ab兩種抗體診斷mgt,結(jié)果顯示對(duì) 于診斷同一病理類(lèi)型mgt敏感性及同一種osserman分型抗體陽(yáng)性檢出率無(wú)明顯差異

9、。武茜等口5 研究發(fā)現(xiàn)cae-ab對(duì)mgt發(fā)病具有顯著相關(guān)性，前縱隔腫瘤患者術(shù)前檢測(cè)cae-ab結(jié)合ct檢查， 可提高診斷胸腺疾病的敏感性。1.3二氫毗喘受體抗體(dhprab)與蘭尼堿受體抗體(ryrab)二氫毗陀受體(dihydropyridine receptor, dhpr)是細(xì)胞膜上的l型電壓門(mén)控鈣離了通道和電 壓感受器，骨骼肌、心肌中含量較高。marutat等16研究了 mg患者與興奮收縮(excitation-contraction coupling, e-c)偶聯(lián)有關(guān)的自身抗體，在37%的胸腺瘤mg患者屮檢測(cè)到 dhpr-abo蘭尼堿受體(ryanodine receptor,

10、 ryr)是位于肌質(zhì)網(wǎng)中的鈣通道蛋白，因能和一種植 物堿ryanodine結(jié)合而命名，其有骨骼肌(ryr1)和心肌(ryr2 )兩種形式,mg患者的ryr-ab 與兩者均可反應(yīng)。ryr是由4個(gè)同源亞基組成四聚體，是-種含有5035個(gè)氨基酸，分子量為565 kda 的蛋口質(zhì)，ryr主要在橫紋肌組織中表達(dá)，上皮組織和神經(jīng)元中也可出現(xiàn)。肌膜去極化電位通過(guò)t 管到達(dá)肌質(zhì)網(wǎng)的終端池，誘導(dǎo)ryr的構(gòu)象變化，使鈣內(nèi)流，從而觸發(fā)骨骼肌細(xì)胞收縮17。ryr-ab 可減弱這種作用，可能是由于胸腺的部分ryr與之產(chǎn)生反應(yīng)從而使t細(xì)胞致敏，進(jìn)一步刺激b細(xì)胞 產(chǎn)生ryr-ab,骨骼肌不能有效收縮而導(dǎo)致肌無(wú)力。有研究顯示

11、18骨骼肌中dhpr和ryr的信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)為雙向的，兩者z間機(jī)械和化學(xué)的雙向偶聯(lián)機(jī)制是ec的基礎(chǔ)。除神經(jīng)肌肉的傳導(dǎo)異常，mg-與肌 肉的興奮收縮偶聯(lián)受損相關(guān)，dhpr-ab是伴胸腺瘤的mg的又一個(gè)新標(biāo)志，可能與肌肉的興奮收縮 耦聯(lián)有關(guān)。1.4電壓門(mén)控性鉀通道抗體(kvab)kv抗體常見(jiàn)的有kvl.1、kvl.2或kvl.6,而抗kvl.4抗體主耍存在于骨骼肌、心肌及腦中。suzuki s等19在2005年利用兔耳肌細(xì)胞提取物作為抗原來(lái)源，s35標(biāo)記的橫紋肌肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)kvl.4抗 體，924例mg患者中發(fā)現(xiàn)8例(男1例，女7例)發(fā)展為炎癥性肌病，但存在非肌炎特異的自身抗 體，其屮3例患者發(fā)現(xiàn)抗

12、kvl.4抗體。mg相關(guān)的炎癥性肌病的臨床和免疫學(xué)特征與多發(fā)性肌炎不同， 首先，心肌受累和胸腺瘤在多發(fā)性肌炎中并不常見(jiàn)20。其次，mg患者相關(guān)的炎癥性肌病的白身抗 體與多發(fā)性肌炎患者中的肌炎特異性自身抗不同21o kvl.4抗體陽(yáng)性的mg患者易發(fā)生延髓型肌無(wú) 力、胸腺瘤及心肌炎。口前關(guān)于kvl.4抗體的mg的報(bào)道較少，其在mg發(fā)病機(jī)制屮的作用尚需進(jìn)一 步探討。1.5其他更少見(jiàn)抗體mg還可出現(xiàn)膠原蛋 xiii抗體、聚蛋白抗體、dhprab、抗補(bǔ)體c5ab、hsp70-65ab、ifn 抗體22等臨床少見(jiàn)抗體。值得注意的是：ifn抗體在mg伴胸腺瘤患者外周血中水平較高，ifn 具有抗腫瘤作用，并且

13、具有多生物學(xué)效應(yīng)，主耍由白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子23o 膠原蛋白是稱(chēng)為macits (具有間斷的三螺旋的膜相關(guān)的膠原蛋白)的膠原亞組的成員，由短的胞質(zhì) 結(jié)構(gòu)域、單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和大部分的膠原胞外域組成24o膠原蛋口是神經(jīng)肌肉接頭成熟所需的跨膜 蛋白。瑕近的研究表明膠原蛋白位于神經(jīng)肌肉接頭的功能區(qū)，結(jié)合乙酰膽堿酯酶相關(guān)膠原蛋白 (coiq),并有助于神經(jīng)肌肉接頭的乙酰旭堿酯酶的分布形式。因此，我們推測(cè)膠原蛋白自身抗體 的致病機(jī)制可能是阻礙膠原蛋白和其他突觸基底層組分之間的相互作用，并使神經(jīng)肌肉接頭突觸不穩(wěn) 定25。2檢測(cè)方法2.1 放射免疫法(radioimmunoprecipiati

14、on assay： ria)ria又叫做競(jìng)爭(zhēng)性飽和法，抗原和抗體由放射性物質(zhì)標(biāo)記，隨之結(jié)合待檢樣本，形成抗原抗體 復(fù)合物進(jìn)行測(cè)定。以往的放射免疫測(cè)定方法關(guān)鍵在于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特并性抗體，竟?fàn)庪p方為放射性標(biāo)記的 抗原與待檢樣本中未標(biāo)記的抗原；另一種方法是在前者的基礎(chǔ)上擴(kuò)展，關(guān)鍵在于放射性物質(zhì)標(biāo)記足量 抗體，結(jié)合待檢抗原，利用固相免疫吸附載體的原理的一種非競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法。ria優(yōu)勢(shì)在于特 異性強(qiáng)、靈敏度高、町一次完成大量樣本的檢測(cè)、血清的消耗量少。國(guó)外研究多采用敏感度和特異度 均高的ria檢測(cè)achr-ab的滴度26,尤其是類(lèi)似mg癥狀的初步篩選吋，ria應(yīng)用更廣泛。2.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enz

15、ymelinked immunosorbent assay, elisa)elisa法其本質(zhì)是一種特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，優(yōu)勢(shì)在于該方法利用高度特異性抗原抗體結(jié)合， 可以有效消除樣本的本底和對(duì)位量干擾，得到更高的靈敏度。目前，elisa法可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，減少 了系統(tǒng)及隨機(jī)誤差，因此廣泛應(yīng)用于mg抗體檢測(cè)屮。但是，該法易受多方面因素的干擾：代謝物, 測(cè)定易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，干擾牛物利用度；抗體的形成，對(duì)蛋白的定量測(cè)定產(chǎn)牛影響；基質(zhì)特異性, 蛋白的反應(yīng)性易改變。因此，國(guó)內(nèi)外多推薦利用特并度和靈敏度均高的ria檢測(cè)抗體及其滴度。2.3 熒光細(xì)胞染色方法(cell-based assays, cba)cba原

16、理在丁通過(guò)編碼蛋口的互補(bǔ)dna (cdna)轉(zhuǎn)染活的人胚胎腎(hek)細(xì)胞，同時(shí)與細(xì) 胞內(nèi)錨定蛋白rapsyn共同表達(dá)，從而使得achr在hek細(xì)胞表面上表達(dá)。測(cè)定achr-ab時(shí)，可用 achr亞基的cdnas以及rapsyn 強(qiáng)的綠色熒光蛋片轉(zhuǎn)染hek細(xì)胞。測(cè)定lrp4ab吋，用lrp 的cdnas轉(zhuǎn)染hek細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞表而表達(dá)。cba的優(yōu)勢(shì)在于可檢測(cè)生物膜環(huán)境中的achr結(jié)合 的抗體，這些抗體具有天然構(gòu)象狀態(tài)和適當(dāng)?shù)奶腔?，與神經(jīng)肌肉接頭處的抗體類(lèi)似。因此， cba可提髙血清陰性mg患者的抗體檢測(cè)的陽(yáng)性率。cba高敏感性很可能是由于其檢測(cè)到的抗體通 過(guò)二價(jià)結(jié)合使細(xì)胞表面上的achr

17、簇交聯(lián)作用，從而增加了 cba檢測(cè)抗體的敏感性。但是cba的 劣勢(shì)在于，它盂使用活細(xì)胞，需組織培養(yǎng)設(shè)備，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，目前主要應(yīng)用于專(zhuān)門(mén)的研究中心27。2.4 時(shí)間分辨熒光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay, trfia)mg患者+ achr-ab可通過(guò)放射免疫沉淀測(cè)定，為研究一種非放射性免疫測(cè)定法，人們建立了 一種瀾系元素的高靈敏度檢測(cè)，可標(biāo)記多種化合物。trfia使用eu3+-a-ctx而不是1251-a-butx標(biāo) 記的抗原28o其優(yōu)勢(shì)在于用于標(biāo)記抗原的試劑是比125 l-a-butx更穩(wěn)定，克服了酶不穩(wěn)定性及ria 中放射性同位素的污染問(wèn)題，但

18、是，要求專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。mg是臨床少見(jiàn)疾病，同其他自身免疫疾病一樣，其發(fā)病的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，自身抗體與mg 的發(fā)病機(jī)制密不可分，己發(fā)現(xiàn)mg相關(guān)抗體十余種，是否還存在與mg相關(guān)的抗體仍在探索，冃前 存在許多問(wèn)題需進(jìn)一步解決，如自身抗體之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是如何啟動(dòng)和調(diào)節(jié)自身免疫應(yīng)答等，隨著對(duì) 于mg的深入研究將會(huì)有更新的進(jìn)展；國(guó)內(nèi)外多推薦利用特異度和靈敏度均高的ria檢測(cè)抗體及其 滴度，提高檢測(cè)抗體的準(zhǔn)確性以及擴(kuò)展檢測(cè)方法，從而更好地去認(rèn)識(shí)mg這一疾病。參考文獻(xiàn)1 carr as, cardwell cr, me carron po, et al. a systematic

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