量子點為載體轉(zhuǎn)染survivinsiRNA至人舌鱗癌Tca8113細胞探究

1、量子點為載體轉(zhuǎn)染survivinsirna至人舌鱗癌tca8113細胞探究摘要目的 靶向survivin基因的sirna通過量子 點為載體轉(zhuǎn)染至人舌鱗癌tca8113細胞中，研究其對 survivin基因表達的影響，為量子點在腫瘤的基因治療方 面提供實驗依據(jù)。方法survivin sirna通過量子點轉(zhuǎn)染至 人舌鱗癌tca8113細胞中，同時設(shè)立lipofecttamine 2000 脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染載體的對照組以及未轉(zhuǎn)染的空白組，采用實時 定量rt-pcr檢測各組tca8113細胞中survivin mrna表達 的改變情況。結(jié)果 實驗組用50 pmolqd轉(zhuǎn)染100 pmol survivin

2、 sirna 入 tca8113 細胞 48 h 后，檢測到 survivin sirna mrna表達量相對于空白組下降64%, qd與sirna的使 用比例為 1 ： 2；對照組中用 100 pmol lipofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 100 pmol survivin sirna 入 tca8113 細胞 48h 后，檢測到survivin sirna mrna表達量相對于空白組下降 90%, qd與sirna的使用比例為1 ： 1。結(jié)論量子點為載體 轉(zhuǎn)染survivin sirna能夠有效的抑制tca8113細胞survivin mrna的表達，量子點有望作為rna干擾技

3、術(shù)的新型載體。關(guān)鍵詞量子點；舌鱗癌tca8113細胞;sirna中圖分類號r19 文獻標識碼a 文章編號1674-0742 (2013) 08 (b) -0001-04人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展大多是由于基因的改變致細胞凋 亡的異常引起的。人體常見的口腔腫瘤細胞中，survivin基 因的水平一般都會升高，它會抑制細胞凋亡。細胞凋亡與增 殖一樣，是一個高度可調(diào)節(jié)性的生物化學過程。rna干擾(rna interference, rnai)成為目前的熱點研究之一，它是多種 生物體內(nèi)由雙鏈 rna (double stranded rna, dsrna)分子 介導的基因阻抑現(xiàn)象，通過導入外源或內(nèi)源的dsr

4、na,細胞 內(nèi)加工后產(chǎn)生sirna (小分子干擾rna片段)可以特異性阻 滯基因的表達，使內(nèi)源性mrna發(fā)生特異性降解，從而引起 轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, ptgs)o量子點(quantum dot, qd)是一種直徑在1loonm的 半導體納米顆粒，而粒徑在210nm的量子點可通過內(nèi)吞作 用進入細胞。qd具有特殊的光學特性，單一種類的qd能按 照尺寸變化產(chǎn)生發(fā)光波長不同、顏色分明的熒光，并且這種 熒光的強度和穩(wěn)定性都大大優(yōu)于有機熒光染料，可以讓研究 人員更長時間地觀察細胞或組織；此外，qd具有良好的生物 相容性，對細胞的毒性低。

5、2010年1月一2012年9月在該 研究中，利用量子點作為非病毒的基因轉(zhuǎn)染載體，對口腔鱗 癌tca8113細胞中高表達的凋亡抑制基因survivin的sirna 進行修飾并轉(zhuǎn)染至人舌鱗癌tca8113細胞中，達到有效抑制 survivin基因的表達至腫瘤細胞凋亡的目的。以期望對口 腔鱗癌細胞中高表達的凋亡抑制基因survivin基因沉默提 供理論和實踐依據(jù)，探索出一種安全，低毒，高效并可進行 動態(tài)觀測的sirna轉(zhuǎn)運載體。1材料1. 1轉(zhuǎn)染所需設(shè)備試劑(1) 人舌鱗癌tca8113細胞(2) survivin sirna： 20nmol 凍干粉(3) 量子點(qd605)：表面帶正電荷的水溶性

6、量子點, 4 mol/l(4) lipofectamine 2000 脂質(zhì)體(5) opti-mem i 培養(yǎng)基(6) 熒光顯微鏡：olympus, 1x511.2實時定量rt-pcr所需主要試劑及設(shè)備1.2. 1主要試劑trizol rna提取試劑；氯仿； 異丙醇；無水乙醇；sybr green pcr master mix； 焦碳酸二乙酯(depc)； ©tbe電泳緩沖液：tris堿54 g, 硼酸 27. 5 g, 0. 5 mol/edta (ph： &0) 20 ml,加雙蒸水 600 ml,劇烈攪拌至溶解，加水至1000 ml定溶，即為5xtbe, 用時加雙蒸水稀

7、釋成0. 5xtbe；核酸染料。1. 2. 2主要設(shè)備 高速冷離心機：heraeus, megafuge 1.0r；定量 pcr 儀：abi prism 7500*sequence detection system；電熱恒溫鼓風干燥箱：heraeus, ut6；eppendof 管、tip頭等均用0. 1%的depc水浸泡過夜，用無菌蒸憎水 沖洗后，高壓滅活depc活性，371烤箱烘干備用；電熱 恒溫水浴鍋：grant, 0ls200 ；凝膠成像分析系統(tǒng)： tanonl600；電泳儀：tanon, dyy-6x型；純水制備系統(tǒng): millipore；醫(yī)用微波爐：galanzo2方法2. 1 t

8、ca8113細胞的培養(yǎng)細胞傳代培養(yǎng)到34代時用于實驗。2. 2量子點介導survivin sirna轉(zhuǎn)染tca8113細胞（1）當內(nèi)皮細胞貼壁，達到80%90%融合后，于轉(zhuǎn)染 前1 d,以4x105細胞/孔接種于6孔板，于含血清、不含 抗生素的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時，細胞融合率達到60% 70%o細胞隨機分為三組：實驗組（量子點組）、對照組（lipofectamine 2000脂質(zhì)體），空白組（未轉(zhuǎn)染組）。（2）溶液 1 的配制：實驗組：237. 5 l0pti-memi+12. 5l qd每孔（總體積250 l）,室溫孵育5 min；對照組：245l opt i-mem 1+5 l l

9、ipof ectamine 2000 每孔（總體積 250 l）, 室溫孵育5 min；（3）溶液2的配制：245 l 0pti-mem1+5 l sirna 每孔（總體積 250 l）o（4）將溶液1輕輕地與溶液2混合，室溫下孵育20 mine 同時，將6孔板的細胞用無血清且不含抗生素的培養(yǎng)基漂洗 2 遍，加入 1. 5 ml opt i-mem io(5) 將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，輕輕 搖動培養(yǎng)板混勻。置37°c, 5% c02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56 h后 更換含血清不含抗生素的生長培養(yǎng)基，置37°c, 5% c02養(yǎng) 箱中繼續(xù)培養(yǎng)。(6) 轉(zhuǎn)染24 h后在熒光

10、顯微鏡藍光下觀察各組細胞轉(zhuǎn) 染情況并拍照，同時計算轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染率二(每100個細胞 中表達熒光的細胞/100) x100%2. 3定量rt-pcr檢測轉(zhuǎn)染后48h的tca8113細胞中 survivin mrna 表達(1) 細胞總rna的提取(2) 去基因組使用rnase-free的dnase (promega),按以下體系配置 反應液，37 °c消化30 min, 65 °c滅活10 min。(3) 總rna純度和完整性檢測 純度檢測：取1 ul rna樣品60倍稀釋，在 biophotometer plus艾本德核酸蛋白測定儀上測定0d值， 0d260/0d280的比

11、值1.8,說明制備的rna較純，無蛋白質(zhì) 污染。 總rna完整性檢測：取rna樣品1 ul, 1%瓊脂糖凝 膠電泳80vx20min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察總rna的5s rrna, 18 s rrna和28 s rrna條帶，三條條帶完整的話即可證明 總rna抽提比較完整。4討論激光共聚焦顯微鏡證實了量子點為載體可以成功轉(zhuǎn)染 survivin sirna至tca8113細胞（圖2）以及量子點的使用 范圍在安全范圍內(nèi)，接下來本實驗通過實時定量rt-pcr技 術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后tca8113細胞內(nèi)survivin mrna表達量下降的 百分比，本實驗設(shè)立lipofectamine2000脂質(zhì)體這一經(jīng)典轉(zhuǎn)

12、染載體作為對照組。實驗組用50 pmolqd轉(zhuǎn)染100 pmol survivin sirna 入 tca8113 細胞 48h 后，檢測到 survivin sirna mrna表達量相對于空白組下降64%, qd與sirna的使 用比例為1 ： 2 （圖1 ）；對照組中用100 pmol lipofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 100 pmol survivin sirna 入 tca8113 細胞 48h 后，檢測到 survivin sirna mrna 表達 量相對于空白組下降90%, qd與sirna的使用比例為1 ： 1 （常規(guī)比例）。因此，本實驗qd的用量為經(jīng)典轉(zhuǎn)染載體

13、 lipofectamine2000脂質(zhì)體參考使用量的一半，對靶細胞 survivin基因的沉默率超過lipofectamine2000脂質(zhì)體的一 半，這些結(jié)果表明，量子點在可觀察性和沉默率方面都表現(xiàn) 了良好的特性。survivin基因是凋亡抑制蛋白基因家族的一個新成 員，鑒于該蛋白在腫瘤細胞凋亡和增殖中的重要作用，自發(fā) 現(xiàn)以來已經(jīng)成為人類基因組中眾多腫瘤特異基因的代表之 一，其蛋白因其特殊生物學功能被認為是針對腫瘤治療的一 個強有力的靶分子。survivin的主要生物學功能就是抗凋 亡，它是目前已知作用最強的凋亡抑制蛋白。rna 干擾(rna interference, rnai),如今已成

14、為分 子生物學領(lǐng)域最熱門的研究課題之一。rna干擾是指在生物 體內(nèi)，通過外源性或內(nèi)源性雙鏈rna引發(fā)的序列特異性基因 沉默，在此過程中長雙鏈rna被dicer識別加工后，成為只 具有2125 nt長度的短雙鏈rna即sirna, sirna是rnai 過程中的效應分子，與某些核蛋白酶形成一個復合體 (risg), risg再通過sirna的反義鏈識別具同源序列的 mrna并使其降解,從而導致特定基因基因沉默1,由于rnai 具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得 功能喪失或降低突變，因此rnai可以作為一種強有力的研 究工具，用于功能基因組和基因治療的研究。2002年12月 20

15、 h, si rna & rnai被science雜志評為年度十大科技 成就之首，nature雜志亦將si rna評為年度重大科技成果 之一。盡管rnai技術(shù)飛速發(fā)展，但在機制研究和應用方面還 存在著許多問題。在應用研究領(lǐng)域，最主要的問題還是轉(zhuǎn)運 系統(tǒng)的選擇。目前轉(zhuǎn)運sirna至細胞內(nèi)主要通過病毒或非病 毒載體，對于病毒載體，如慢病毒，腺伴隨病毒等，雖然高 效，但是安全性和毒性限制了它的發(fā)展2-3；對于非病毒 載體，他們的低效率是限制他們使用的主要因素4。有學 者研究5,有機熒光修飾sirna后轉(zhuǎn)運，通過熒光顯微鏡 進行動態(tài)觀察，但是，510 s熒光信號就喪失了一半多。 最重要的是，長

16、時間同時追蹤和監(jiān)測多種sirna的轉(zhuǎn)運，觀 察基因沉默是一件非常困難的事。因此，發(fā)現(xiàn)一種安全，低 毒，高效和自我追蹤和監(jiān)測多種sirna的轉(zhuǎn)運載體非常迫切。近年來，隨著納米技術(shù)，生物技術(shù)與材料技術(shù)的飛速發(fā) 展，量子點（qd）作為生物分子的熒光檢測，特別是為多種 分子同時實時動態(tài)檢測提供了可能。量子點表現(xiàn)出獨特的光 學特征，目前研究證實：量子點的發(fā)光特性具有以下特點 6-11：量子點的激發(fā)光波的范圍寬且連續(xù)分布，而發(fā)射 波長的范圍窄且對稱分布，斯托克斯（stokes）位移大，不 同量子點或同一材料不同粒徑的量子點在同一光源下發(fā)射 出不同的顏色的光，即發(fā)射光譜不出現(xiàn)交疊，或只有很少交 疊，這使得不

17、同粒徑量子點標記的各類分子容易區(qū)分，識別。 量子點的發(fā)光特征具有嚴格的量子點尺寸效應，通過改變量 子點粒徑大?。◤?.87 nn）可獲得從紫外到近紅外范圍 或從藍色到紅色波長范圍內(nèi)任意點的光譜，這些光學特征十 分適合修飾多種sirna后轉(zhuǎn)運，同時觀察基因沉默的情況。量子點熒光產(chǎn)率髙，發(fā)光強度強，光化學穩(wěn)定性好，不易 被光解或漂白，它的發(fā)光強度是目前用的有機熒光強20倍, 光化學穩(wěn)定性則提高了 100倍以上。這可對sirna轉(zhuǎn)運后基 因沉默長時間觀察。綜上所述，量子點因其特殊的光學特性不僅可對sirna轉(zhuǎn)染過程進行實時動態(tài)觀察，并且能夠有效 的抑制tca8113細胞survivin mrna的表

18、達，因此量子點有 望作為rna干擾技術(shù)的新型載體。參考文獻1 hunots , flavellra. apoptosis : death of a nonopolyj. science, 2001, 292 (5518)：865-866.2 hannon gj, rossi jj. unlocking the potential of the human genome with rna interferencejnalure, 2004, 43 (7006)： 371-378.3 clay m. the silent treatmentj. nature, 2004, 431 (7008)：

19、599.4 thomas m, lu jj, ge q, zhang cc, et al. full deacylation of polyethylenimine dramatically boosts its gene delivery efficiency and specificity to mouse lung j. proc nat acad sci usa, 2005, 102(16)： 5679-5684.5 dahan m, levi s, luccardini c. et al. diffusion dynamics of glycine receptors reveale

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