生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)biochemical experiment實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí) 容容 量量 瓶瓶液體的量取液體的量取液體的傾倒液體的傾倒滴管的使用滴管的使用試紙的使用試紙的使用一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液的配制一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液的配制濾紙的折疊濾紙的折疊物質(zhì)分離與提純過濾物質(zhì)分離與提純過濾萃取與分液萃取與分液實(shí)驗(yàn)內(nèi)容安排實(shí)驗(yàn)內(nèi)容安排共共3636學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)1 1、緒論生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)規(guī)則及常用儀器使用入門（、緒論生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)規(guī)則及常用儀器使用入門（2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)） 2 2、實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)一 紙層析分離鑒定氨基酸紙層析分離鑒定氨基酸 （6 6學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)） 3 3、實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)二 血清蛋白醋酸纖維素

2、薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 （4 4學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)） 4 4、實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) （2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)） 5 5、實(shí)驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng)蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng) （3 3學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)） 6 6、實(shí)驗(yàn)五、實(shí)驗(yàn)五 凝膠過濾法除蛋白質(zhì)中的離子凝膠過濾法除蛋白質(zhì)中的離子 （4 4學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)） 7 7、實(shí)驗(yàn)六、實(shí)驗(yàn)六 酵母酵母rnarna的提取和鑒定的提取和鑒定 (4(4學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)) ) 8 8、實(shí)驗(yàn)七、實(shí)驗(yàn)七 血糖含量的測(cè)定血糖含量的測(cè)定 （4 4學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）9 9、實(shí)驗(yàn)八、實(shí)驗(yàn)八 脂肪酸的脂肪酸的-氧化氧化 （5 5學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）1010、實(shí)驗(yàn)報(bào)告講解及考核、

3、實(shí)驗(yàn)報(bào)告講解及考核 （2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）1實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膌掌握蛋白質(zhì)、酶、核酸、糖等重要物質(zhì)的分離、掌握蛋白質(zhì)、酶、核酸、糖等重要物質(zhì)的分離、純化和測(cè)定技術(shù)的原理及方法；純化和測(cè)定技術(shù)的原理及方法；l掌握生物化學(xué)的基本知識(shí)、基本理論及基本實(shí)掌握生物化學(xué)的基本知識(shí)、基本理論及基本實(shí)驗(yàn)技能驗(yàn)技能；l培養(yǎng)分析和解決問題能力以及嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的科學(xué)培養(yǎng)分析和解決問題能力以及嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的科學(xué)作風(fēng)、創(chuàng)新能力等綜合素質(zhì)。作風(fēng)、創(chuàng)新能力等綜合素質(zhì)。 緒論緒論2 通過生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該做到通過生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該做到l學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本思路，掌握各個(gè)實(shí)學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本思路，掌握各個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本原理，學(xué)會(huì)嚴(yán)密地組織自

4、己的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)的基本原理，學(xué)會(huì)嚴(yán)密地組織自己的實(shí)驗(yàn)，合理地安排實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。合理地安排實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。l訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)的動(dòng)手能力，學(xué)會(huì)熟練地使用各種訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)的動(dòng)手能力，學(xué)會(huì)熟練地使用各種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器。l學(xué)會(huì)準(zhǔn)確翔實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，學(xué)會(huì)準(zhǔn)確翔實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作能力，能夠整齊清潔地提高實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作能力，能夠整齊清潔地進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)。l掌握生物化學(xué)的各種基本實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技掌握生物化學(xué)的各種基本實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，尤其是各種電泳技術(shù)和層析枝術(shù)術(shù)，尤其是各種電泳技術(shù)和層析枝術(shù)，為今，為今后參加科研工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。后參加科研

5、工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 3.1 3.1 實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)記錄u實(shí)驗(yàn)前寫好實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告實(shí)驗(yàn)前寫好實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告( (鋼筆和園珠筆鋼筆和園珠筆) )。 u實(shí)驗(yàn)中應(yīng)及時(shí)準(zhǔn)確地記錄實(shí)驗(yàn)中應(yīng)及時(shí)準(zhǔn)確地記錄( (專用紙，事先在記錄紙上專用紙，事先在記錄紙上設(shè)計(jì)好各種記錄格式和表格）所觀察到的現(xiàn)象和測(cè)設(shè)計(jì)好各種記錄格式和表格）所觀察到的現(xiàn)象和測(cè)量的數(shù)據(jù)。量的數(shù)據(jù)。u實(shí)驗(yàn)記錄要注意有效數(shù)字，實(shí)驗(yàn)記錄要注意有效數(shù)字，如吸光度值應(yīng)為如吸光度值應(yīng)為“0.050”0.050”，而不能記成，而不能記成“0.05”0.05”。每個(gè)結(jié)果都要盡。每個(gè)結(jié)果都要盡可能重復(fù)觀測(cè)二次以上，即使觀測(cè)的數(shù)據(jù)相同或偏可能重復(fù)觀測(cè)二次以上，即使觀測(cè)

6、的數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應(yīng)如實(shí)記錄，不得涂改。差很大，也都應(yīng)如實(shí)記錄，不得涂改。u實(shí)驗(yàn)中要詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件，如使用的儀器型號(hào)、實(shí)驗(yàn)中要詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件，如使用的儀器型號(hào)、編號(hào)、生產(chǎn)廠等；生物材料的來源、試劑的規(guī)格、編號(hào)、生產(chǎn)廠等；生物材料的來源、試劑的規(guī)格、試劑的濃度等。試劑的濃度等。 3 3 實(shí)驗(yàn)記錄與實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)記錄與實(shí)驗(yàn)報(bào)告3 3 實(shí)驗(yàn)記錄與實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)記錄與實(shí)驗(yàn)報(bào)告3.2 3.2 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式應(yīng)為：實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式應(yīng)為： 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?；?shí)驗(yàn)?zāi)康模?實(shí)驗(yàn)原理；實(shí)驗(yàn)原理； 儀器、材料和試劑；儀器、材料和試劑； 實(shí)驗(yàn)步驟；實(shí)驗(yàn)步驟； 結(jié)果討論（含數(shù)理據(jù)處）；結(jié)果討論（含數(shù)理據(jù)處

7、）； 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng); ; (7) (7) 思考題思考題 注意：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論要充分，盡可能多查閱一些有注意：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論要充分，盡可能多查閱一些有關(guān)的文獻(xiàn)和教科書，充分運(yùn)用己學(xué)過的知識(shí)和生物化關(guān)的文獻(xiàn)和教科書，充分運(yùn)用己學(xué)過的知識(shí)和生物化學(xué)原理，進(jìn)行深入的探討，勇于提出自己獨(dú)到的分析學(xué)原理，進(jìn)行深入的探討，勇于提出自己獨(dú)到的分析和見解，并歡迎對(duì)實(shí)驗(yàn)提出改進(jìn)意見。和見解，并歡迎對(duì)實(shí)驗(yàn)提出改進(jìn)意見。 4 實(shí)驗(yàn)成績?cè)u(píng)分方法實(shí)驗(yàn)成績?cè)u(píng)分方法n實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)情況（實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)情況（10%10%） n實(shí)驗(yàn)操作情況（實(shí)驗(yàn)操作情況（20%20%） n實(shí)驗(yàn)報(bào)告情況（實(shí)驗(yàn)報(bào)告情況（70%70%） 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)理論

8、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)理論層析技術(shù)l1903年，俄國科學(xué)家m.c.jber首創(chuàng)了一種從綠葉中分離多種不同顏色色素成分的方法，命名為色譜法(chromatography)，由于翻譯和習(xí)慣的原因又常稱為層析法。l80多年來，層析法不斷發(fā)展，形式多種多樣。50年代開始，相繼出現(xiàn)了分配層析、離于交換層析、凝膠層析、親和層析、吸附層析等。l幾乎每一種層析法都已發(fā)展成為一門獨(dú)立的生化高技術(shù)，在生化領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。一、層析技術(shù)一、層析技術(shù)一、層析技術(shù)一、層析技術(shù)l1、層析技術(shù)原理l2、層析技術(shù)分類l3、常用層析技術(shù)原理1、層析技術(shù)原理、層析技術(shù)原理l層析原理：是一種物理的分離方法，利用混合物中各組分的物理

9、化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相為固定相，另一相流過此相稱作流動(dòng)相，并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。l可分離物質(zhì)：糖類、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸。2、層析技術(shù)分類、層析技術(shù)分類名稱名稱操作方式操作方式固定相固定相流動(dòng)相流動(dòng)相分離依據(jù)分離依據(jù)分配層析分配層析紙層析紙層析薄層層析薄層層析液體液體液體液體溶解度溶解度離子交換層析離子交換層析離子交換柱層析離子交換柱層析固體固體液體液體帶電性帶電性靜電引力靜電引力吸附層析吸附層析吸附薄層層析吸附薄層層析氣體吸附層析氣體吸附層析固體固體固體固體液體液體氣體氣體吸附力吸附力親合層析親合層析酶與底物酶與底物抗原與抗體抗原與

10、抗體固體固體液體液體配體專一性配體專一性凝膠層析凝膠層析 凝膠過濾凝膠過濾固體固體液體液體分子大小分子大小3、常用的層析原理、常用的層析原理l（1）分配層析紙層析l原理：溶質(zhì)在互不相溶的兩相中溶解度不同，在終點(diǎn)時(shí)達(dá)到一種平衡，其比值為一個(gè)常數(shù)，即分配系數(shù)（）。l 固定相內(nèi)溶質(zhì)的濃度 流動(dòng)相內(nèi)溶質(zhì)的濃度 固定相：濾紙上吸附的水 流動(dòng)相：有機(jī)溶劑（正丁醇） =128646432643216484816 8324832 8 4204040 20 4 2123040 30 12 2紙層析紙層析l紙層析是最簡單的液一液相分配層析。l濾紙是紙層析的支持物。當(dāng)支持物被水飽和時(shí)，大部分水分子被濾紙的纖維素牢牢

11、吸附，因此，紙及其飽和水為層析的固定相，與固定相不相混溶的有機(jī)溶劑為層析的流動(dòng)相。l對(duì)某些特定化合物，在特定的展層系統(tǒng)，一定的溫度條件下，rf是個(gè)常數(shù)。（2）離子交換層析）離子交換層析l原理：將能與周圍介質(zhì)進(jìn)行離子交換的不穩(wěn)定離子固定于惰性基質(zhì)上，從而分離介質(zhì)中的組分。l常用的惰性基質(zhì)：人工合成樹脂（單體：苯乙烯、交聯(lián)劑：二乙烯苯）l陽離子交換劑：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l陰離子交換劑：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l可交換離子：陽離子：na+、h+ 陰離子：cl-、oh-示意圖（交換樹脂表面）示意圖（交換樹脂表面）示意圖（離子交換過程示意圖（離子交換過程）電離基團(tuán)（磺酸根）可交換離子（鈉離子）

12、交換離子不交換離子示意圖示意圖水分子b物質(zhì)a物質(zhì)（3）吸附層析）吸附層析l原理：當(dāng)氣體或液體中某組分的分子在運(yùn)動(dòng)中碰到一個(gè)固體表面原理：當(dāng)氣體或液體中某組分的分子在運(yùn)動(dòng)中碰到一個(gè)固體表面時(shí)，分子會(huì)貼在固體表面上并停留一定時(shí)間然后才離開，此為吸時(shí)，分子會(huì)貼在固體表面上并停留一定時(shí)間然后才離開，此為吸附現(xiàn)象。附現(xiàn)象。l吸附現(xiàn)象形成的原因：吸附現(xiàn)象形成的原因：吸附作用可能由幾種作用力形成，包括被吸附作用可能由幾種作用力形成，包括被吸附物與吸附劑之間相反電荷基團(tuán)與基團(tuán)之間的靜電引力吸附物與吸附劑之間相反電荷基團(tuán)與基團(tuán)之間的靜電引力( (形成離形成離子鍵子鍵) )、氫鍵及范德華引力等。、氫鍵及范德華引力

13、等。l在不同條件在不同條件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能幾種力同下，占主要地位的作用力可能不同，也可能幾種力同時(shí)起作用時(shí)起作用l吸附劑：氧化鋁、活性炭、硅膠；纖維素、淀粉、聚酰胺；滑石、吸附劑：氧化鋁、活性炭、硅膠；纖維素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。陶土、粘土。吸附層析示意圖吸附層析示意圖 吸附劑易吸附分子不易吸附分子（4）親和層析）親和層析l原理：利用分子間具有專一親和力而設(shè)計(jì)的層析利用分子間具有專一親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。技術(shù)。l專一親和力分子對(duì)：酶與底物、特異性抗原與酶與底物、特異性抗原與抗體、抗體、dna和和rna、激素和其受體、激素和其受體l載體：使親和物固相化的水不

14、溶性化合物。如：使親和物固相化的水不溶性化合物。如：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚苯乙纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。烯、乙烯、多孔玻璃。（5）凝膠過濾凝膠過濾l原理：被分離物質(zhì)因分子大小不同，在凝膠中向下移動(dòng)的被分離物質(zhì)因分子大小不同，在凝膠中向下移動(dòng)的速度不同。速度不同。l物質(zhì)進(jìn)入凝膠柱之后有兩種運(yùn)動(dòng)方式：垂直向下移動(dòng)和無定向物質(zhì)進(jìn)入凝膠柱之后有兩種運(yùn)動(dòng)方式：垂直向下移動(dòng)和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)直徑大無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，只能分的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)直徑大無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，只能分布于顆粒間隙中向下移動(dòng)快，而小分子物質(zhì)可擴(kuò)散到凝膠顆粒布于顆粒間隙中

15、向下移動(dòng)快，而小分子物質(zhì)可擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)，因此向下移動(dòng)慢。內(nèi)，因此向下移動(dòng)慢。l凝膠物質(zhì)：馬鈴薯淀粉凝膠、瓊脂、瓊脂糖凝膠、聚丙烯馬鈴薯淀粉凝膠、瓊脂、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠。酰胺凝膠、葡聚糖凝膠。電 泳 技 術(shù)一一.電泳的概念電泳的概念二二.電泳技術(shù)分類電泳技術(shù)分類三三.電泳技術(shù)基本原理電泳技術(shù)基本原理四四.幾種常見電泳方法的比較幾種常見電泳方法的比較五五.聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳原理一.電泳的概念l帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。二.電泳技術(shù)分類淀 粉 凝 膠 電 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳瓊 脂 糖 凝 膠 電

16、泳凝 膠 支 持 物 區(qū) 帶 電 泳紙 電 泳醋 酸 纖 維 薄 膜 電 泳 薄 層 電 泳非 凝 膠 支 持 物 電 泳用 支 持 物 區(qū) 帶 電 泳顯 微 電 泳等 電 聚 焦 電 泳等 速 電 泳不 用 支 持 物 電 泳是 否 用 支 持 物三.電泳技術(shù)基本原理1.基本原理基本原理 不同的帶電顆粒在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度，主要與其所不同的帶電顆粒在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度，主要與其所帶凈電荷量，分子量及分子形狀有關(guān)。帶凈電荷量，分子量及分子形狀有關(guān)。 ph pi 分子帶負(fù)電荷分子帶負(fù)電荷, ,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)在電場(chǎng)中向正極移動(dòng); ; ph 蛋蛋 glyglylm mcl clcl clmm蛋蛋

17、蛋蛋m m glygly glyglyl凝膠中凝膠中clcl為快離子，為快離子， glygly為慢離子，為慢離子，蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。蛋白質(zhì)樣品被夾在中間。 緩沖液緩沖液樣品樣品濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠緩沖液成分及ph的不連續(xù)性導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品濃縮效應(yīng)示意圖l快離子l慢離子l蛋白質(zhì)樣品 le：每厘米的電壓降每厘米的電壓降 e ei( i(電流強(qiáng)度電流強(qiáng)度)/ )/( (電導(dǎo)率電導(dǎo)率) )le e與電泳速度成正比與電泳速度成正比l電泳開始后，由于快離子泳動(dòng)電泳開始后，由于快離子泳動(dòng)率最大，在快離子后面形成一率最大，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位

18、梯度，使蛋白質(zhì)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。品被進(jìn)一步濃縮。電位梯度的不連續(xù)性le：每厘米的電壓降每厘米的電壓降 e ei( i(電流強(qiáng)度電流強(qiáng)度)/ )/( (電導(dǎo)率電導(dǎo)率) )le e與電泳速度成正比與電泳速度成正比l電泳開始后，由于快離子泳動(dòng)電泳開始后，由于快離子泳動(dòng)率最大，在快離子后面形成一率最大，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)個(gè)離子濃度低的低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)生較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣和慢離子加速移動(dòng)，蛋白質(zhì)樣品被進(jìn)一步濃縮。品被進(jìn)一步濃縮。電位梯度的不連續(xù)性a.

19、 樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括理包括：l緩沖液成分及緩沖液成分及phph的不連續(xù)性的不連續(xù)性l電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性 緩沖液緩沖液濃縮膠濃縮膠樣品樣品分離膠分離膠a. 樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括理包括：l凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)效應(yīng)(緩沖液緩沖液ph8.3)ph8.3) 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。度變慢，堆積濃縮。 緩沖

20、液緩沖液樣品樣品濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠a. 樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括理包括：l凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)效應(yīng)(緩沖液緩沖液ph8.3)ph8.3) 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。度變慢，堆積濃縮。 緩沖液緩沖液樣品樣品濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠a. 樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括理包括：l凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠

21、有一個(gè)堆積濃縮樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)效應(yīng)(緩沖液緩沖液ph8.3)ph8.3) 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃縮。度變慢，堆積濃縮。 緩沖液緩沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠a. 樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括理包括：l凝膠層的不連續(xù)性：凝膠層的不連續(xù)性： 樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮樣品進(jìn)入濃縮膠有一個(gè)堆積濃縮效應(yīng)效應(yīng)(緩沖液緩沖液ph8.3)ph8.3) 蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)從“”極向極向“”極移極移動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速動(dòng)，從濃縮膠進(jìn)入分離膠，速度變慢，堆積濃

22、縮。度變慢，堆積濃縮。 緩沖液緩沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠b.電荷效應(yīng)l蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后 phph增大增大(ph 8.9)(ph 8.9)，glygly解離度增解離度增大，不存在快、慢離子之分，大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場(chǎng)強(qiáng)度和蛋白質(zhì)樣品在均一電場(chǎng)強(qiáng)度和phph條件下泳動(dòng)。條件下泳動(dòng)。l由于各種蛋白質(zhì)由于各種蛋白質(zhì)pi不同，所載不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的 有有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。 緩沖液緩沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠c.分子篩效應(yīng)l分離膠的孔徑小，各分子分離膠的孔徑小，各分子由于

23、大小和形狀不同，所由于大小和形狀不同，所受阻力不同，表現(xiàn)出不同受阻力不同，表現(xiàn)出不同的的 泳動(dòng)速度，即分子篩作泳動(dòng)速度，即分子篩作用。分子量小，形狀為球用。分子量小，形狀為球形的泳動(dòng)速度最快。形的泳動(dòng)速度最快。 緩沖液緩沖液濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 氨基酸的分離與鑒定氨基酸的分離與鑒定 濾紙層析法濾紙層析法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1.通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法操作方法2.2.掌握氨基酸紙上層層析法的操作技術(shù)（點(diǎn)樣、平掌握氨基酸紙上層層析法的操作技術(shù)（點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定）衡、展層、顯色、鑒定） .二、實(shí)驗(yàn)原理1.1.

24、是分配層析的一種。在紙上水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定是分配層析的一種。在紙上水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。當(dāng)有機(jī)相沿紙流動(dòng)經(jīng)過層析點(diǎn)時(shí)，層析點(diǎn)上溶質(zhì)就在水相和相。當(dāng)有機(jī)相沿紙流動(dòng)經(jīng)過層析點(diǎn)時(shí)，層析點(diǎn)上溶質(zhì)就在水相和有機(jī)相之間進(jìn)行分配，溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動(dòng)速率有機(jī)相之間進(jìn)行分配，溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開。也不同，因而可以彼此分開。2.2.氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)。氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)。3.3.物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用r rf f值來表示的。在一定的值來表示的。在一定的條件下某種物質(zhì)的

25、條件下某種物質(zhì)的r rf f值是常數(shù)。值是常數(shù)。 r rf f 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離4 4. r. rf f值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、p ph h層析濾紙的質(zhì)層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。量和層析溫度等因素有關(guān)。5.5.上層層析、下層層析、單向?qū)游?、雙向?qū)游?。上層層析、下層層析、單向?qū)游觥㈦p向?qū)游?。三、儀器、材料和試劑實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器1 1層析缸、培養(yǎng)皿、小燒杯、長頸漏斗層析缸、培養(yǎng)皿、小燒杯、長頸漏斗2 2毛細(xì)管、吹風(fēng)機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱毛細(xì)管、吹風(fēng)機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱3 3層

26、析濾紙、手套層析濾紙、手套 、透明膠帶或針線、透明膠帶或針線實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料和試劑1 1氨基酸溶液分別配制氨基酸溶液分別配制0.5%0.5%的的lyslys、alualu、ileile、metmet溶液及它們的溶液及它們的混合液（各組份濃度均為混合液（各組份濃度均為0.5%0.5%）。）。2 2顯色劑顯色劑0.1%0.1%水合茚三酮丙酮溶液。水合茚三酮丙酮溶液。3 3擴(kuò)展劑（展層劑）擴(kuò)展劑（展層劑）酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇:80%:80%甲酸甲酸: :水水15:3:215:3:2（體積比），平衡溶劑（體積比），平衡溶劑與擴(kuò)展劑相同。每組配制與擴(kuò)展劑相同。每組配制30ml30m

27、l堿溶劑系統(tǒng)：正丁醇?jí)A溶劑系統(tǒng)：正丁醇:12%:12%氨水氨水:95%:95%乙醇乙醇13:3:313:3:3（體積比），平（體積比），平衡溶劑為衡溶劑為12%12%氨水。氨水。 四、操作步驟與方法 溶劑前沿層析點(diǎn)原點(diǎn)溶劑前沿亮苯丙纈脯賴l1 1將盛有擴(kuò)展劑將盛有擴(kuò)展劑10ml10ml的小燒杯和培養(yǎng)皿置于密閉的層析缸中。的小燒杯和培養(yǎng)皿置于密閉的層析缸中。l2 2戴手套取層析濾紙一張作標(biāo)記。戴手套取層析濾紙一張作標(biāo)記。l3 3。點(diǎn)樣：干后重復(fù)點(diǎn)一次，直徑最大不超過。點(diǎn)樣：干后重復(fù)點(diǎn)一次，直徑最大不超過3mm3mm?？p成筒狀，兩邊不能?？p成筒狀，兩邊不能接觸。點(diǎn)樣面朝外，點(diǎn)樣端朝下，蓋上層析缸蓋

28、，平衡約接觸。點(diǎn)樣面朝外，點(diǎn)樣端朝下，蓋上層析缸蓋，平衡約2020 3030分鐘。分鐘。l4.4.展層用長頸漏斗，擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線展層用長頸漏斗，擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm1cm。上沿約。上沿約1 1厘米時(shí)，厘米時(shí)，取出濾紙，用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿界線，干燥。取出濾紙，用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿界線，干燥。l5 5顯色用顯色用0.1%0.1%茚三酮丙酮溶液均勻浸透，烘箱（茚三酮丙酮溶液均勻浸透，烘箱（6565）5 5分鐘或用熱分鐘或用熱風(fēng)吹干。脯氨酸、羥脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有風(fēng)吹干。脯氨酸、羥脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有氨基酸及一切蛋氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮產(chǎn)生蘭紫色物質(zhì)。白質(zhì)都能和茚

29、三酮產(chǎn)生蘭紫色物質(zhì)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論六、注意事項(xiàng)1 1切勿用手直接接觸濾紙和顯色劑。切勿用手直接接觸濾紙和顯色劑。2. 2. 點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。3 3使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。 七、思考題：七、思考題：l1做好本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是什么？l2實(shí)驗(yàn)操作過程，為何不能用手接觸濾紙？l3影響rf值的因素有哪些？ 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳 l實(shí)驗(yàn)原理l實(shí)驗(yàn)材料與儀器l實(shí)驗(yàn)試劑l實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 醋酸纖維薄膜電泳(came)是以醋酸纖維薄膜(cam)作

30、支持物的一種 區(qū)帶電泳技術(shù)。醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸 酯。將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂 抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，滲 透性強(qiáng)，對(duì)分子移動(dòng)阻力小，厚度為120m 。 本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素薄膜為電泳支持物，分離人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中的遷移速度不同。分子量小、等電點(diǎn)低的，在相同堿性ph緩沖體系中，帶負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中遷移速度快。例如人血清蛋白在 ph8.6的緩沖體系中

31、電泳，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動(dòng)最快，其 余依次是球蛋白 。實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)材料與儀器（一）、材料：人血清（二）、儀器 醋酸纖維薄膜(8x2mm)；點(diǎn)樣器；染色皿，漂洗器， 鑷子；玻璃板；常壓電泳儀；直流電源整流器；水平電泳 槽；粗濾紙；直尺和鉛筆實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 巴比妥緩沖液(ph8.6 i=0.06)；氨基黑10b染色液；漂洗液；95乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸餾水50ml；洗脫液 0.4mollnaoh；透明液；無水乙醇；冰醋酸7：3實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1浸泡：用鑷子取醋酸纖維薄膜放在緩沖液中浸泡20分 鐘。2點(diǎn)樣：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干 多余的液體，然后鋪在玻

32、璃板上(無光澤面朝 上)，將點(diǎn)樣器在血清中沾一下（量薄薄一層為 好），再在膜條一端2-3厘米處輕輕水平地落下 并隨時(shí)提起，這樣即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血 清樣品。3電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個(gè)電極槽內(nèi)的液面 等高，將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上。膜 條點(diǎn)樣的一端放在負(fù)極上。通電，電流強(qiáng)度每條 膜1ma(注意強(qiáng)度),電泳時(shí)間約為50分鐘。4染色：電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡5分 鐘。5漂洗：將膜條從染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗數(shù) 次至無蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得到色帶清晰的 電泳圖譜。6透明：將脫色后干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡 23分鐘后取出平鋪在玻璃板上,用一直徑0

33、.5cm 的玻璃棒將其間的氣泡趕出,兩者之間不能有泡。 干燥后此透明薄膜,區(qū)帶著色清晰,可用于光吸收掃 描,長期保存不褪色。思考題：思考題：l.為什么將薄膜的點(diǎn)樣端放在濾紙橋的負(fù)極端？l.用乙酸纖維素薄膜作為電泳支持物有何優(yōu)點(diǎn)？ 實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌（1）了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)）了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。原理。l（2）學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸）學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。的方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理l雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)l尿素加熱至尿素加熱至180左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙

34、縮脲在堿性環(huán)境中能與縮脲在堿性環(huán)境中能與cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測(cè)定。也能發(fā)生此反應(yīng)。可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測(cè)定。l雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)所有。含有一雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)所有。含有一個(gè)肽鍵和一個(gè)個(gè)肽鍵和一個(gè)csnh2，ch2nh2，crhnh2，ch2nh2chnh2ch2oh或或chohch2nh2等基團(tuán)的物質(zhì)也有此反應(yīng)。等基團(tuán)的物質(zhì)也有此反應(yīng)。nh3干擾此反應(yīng)，因?yàn)?/p>

35、干擾此反應(yīng)，因?yàn)閚h-3與與cu-2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子cu（nh3）42+。因此，一切蛋。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。茚三酮反應(yīng)l除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有有氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，1 1 500 000濃度的氨基酸水溶液即濃度的氨基酸水溶液即能給出反

36、應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。l茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成co2、nh3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。有色物質(zhì)。l此反應(yīng)的適宜此反應(yīng)的適宜ph為為57，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同不同ph條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色。條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色。黃

37、色反應(yīng)l含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。l多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。乙醛酸反應(yīng)l在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì)，反應(yīng)機(jī)理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。 三、儀器、材料和試劑實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器試管；試管架；漏斗；鐵架臺(tái)；滴管；試劑瓶；試管；試管架；漏斗；鐵架臺(tái)；滴管；試劑瓶；水浴鍋。水浴鍋。實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料和試劑尿素；尿素；10%氫氧化鈉溶液；氫氧化

38、鈉溶液；1%硫酸銅溶硫酸銅溶液；液；2%卵清蛋白溶液；卵清蛋白溶液；0.5%甘氨酸溶液；甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；大豆提取液；頭發(fā)；指茚三酮水溶液；大豆提取液；頭發(fā)；指甲；甲；0.5%苯酚溶液；濃硝酸；苯酚溶液；濃硝酸；0.3%色氨酸溶色氨酸溶液；液；0.3%酪氨酸溶液；冰醋酸、濃硫酸。酪氨酸溶液；冰醋酸、濃硫酸。四、操作步驟與方法 取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加形成雙縮脲。冷后，加10%10%氫氧化鈉

39、溶液約氫氧化鈉溶液約1ml1ml，振蕩混勻，振蕩混勻，再加再加1%1%硫酸銅溶液硫酸銅溶液1 1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml1ml和和10%10%氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液2ml2ml，搖勻，再加，搖勻，再加1%1%硫酸銅溶液硫酸銅溶液2 2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。色的出現(xiàn)。雙縮脲反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作雙縮脲反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作茚三酮反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作l取取2 2支試管分別加

40、入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液液1ml1ml，再各加，再各加0.5ml0.1%0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混勻，茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱在沸水浴中加熱1212分鐘，觀察顏色由粉色變分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。紫紅色再變藍(lán)。l在一小塊濾紙上滴一滴在一小塊濾紙上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴干后，再在原處滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。黃色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作l向向7 7個(gè)試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出個(gè)試管中

41、分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。管 號(hào)1234567材 料（滴）雞蛋清溶液4大豆提取液4指甲少許頭發(fā)少許0.5%苯酚40.3%色氨酸40.3%酪氨酸4濃硝酸/（滴）244040444現(xiàn)象乙醛酸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作乙醛酸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作l 取取3 3支試管。編號(hào)。分別按上表加入蛋白質(zhì)溶支試管。編號(hào)。分別按上表加入蛋白質(zhì)溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸液、色氨酸溶液和水

42、，然后各加入冰醋酸2 2毫升，毫升，混勻后傾斜試管，沿管壁分別緩緩加入濃硫酸約混勻后傾斜試管，沿管壁分別緩緩加入濃硫酸約1 1毫升，靜置。觀察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。若不毫升，靜置。觀察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。若不明顯，可于水浴中微熱。明顯，可于水浴中微熱。試劑管號(hào)水滴0.03%色氨酸溶液（滴）蛋白質(zhì)溶液（滴）冰醋酸（ml）濃硫酸（ml）現(xiàn) 象1-521241-2135-21五、思考題：五、思考題：l1.1.茚三酮反應(yīng)的陽性結(jié)果是否經(jīng)常是同一色調(diào)？茚三酮反應(yīng)的陽性結(jié)果是否經(jīng)常是同一色調(diào)？并說明原因。并說明原因。l2.2.你能區(qū)分蛋白質(zhì)茚三酮反應(yīng)及其他氨基化合你能區(qū)分蛋白質(zhì)茚三酮反應(yīng)及其他氨基化

43、合物茚三酮反應(yīng)的結(jié)果嗎？試解釋之。物茚三酮反應(yīng)的結(jié)果嗎？試解釋之。l3.3.能否利用茚三酮反應(yīng)可靠地鑒定蛋白質(zhì)的存能否利用茚三酮反應(yīng)可靠地鑒定蛋白質(zhì)的存在？在？l4.4.哪些芳香基因（蛋白質(zhì)中的、非蛋白質(zhì)中的）哪些芳香基因（蛋白質(zhì)中的、非蛋白質(zhì)中的）可以與濃硝酸作用呈現(xiàn)黃色反應(yīng)的陽性結(jié)果？可以與濃硝酸作用呈現(xiàn)黃色反應(yīng)的陽性結(jié)果？ 實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)的變性、沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)的變性、沉淀反應(yīng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌（1）加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)）加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。識(shí)。l（2）了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用）了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。意義。l（3）了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系

44、。）了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。 二、實(shí)驗(yàn)原理l 在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊偷睦砘蛩赜绊懴拢鞍踪|(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋怼５鞍踪|(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。l（1 1）可逆的沉淀的反應(yīng)）可逆的沉淀的反應(yīng) 此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其白質(zhì)的沉淀仍

45、能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類反應(yīng)。質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類反應(yīng)。 l（2 2）不可逆沉淀反應(yīng)）不可逆沉淀反應(yīng) 此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都

46、屬于此類。此類。l 蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。未必都已變性。三、儀器、材料和試劑 實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料和試劑0.2%0.2%雞蛋清溶液；雞蛋清溶液；ph4.7 ph4.7 醋酸醋酸- -醋醋酸鈉的緩沖溶液；酸鈉的緩沖溶液；3%3%硝酸銀溶液；硝酸銀溶液；5%5%三三氯乙酸溶液；氯乙酸溶液；95%95%乙醇；飽和硫酸銨溶乙醇；飽和硫酸銨溶液；硫酸銨結(jié)晶粉末；液；硫酸

47、銨結(jié)晶粉末；0.1 mol0.1 moll-1l-1鹽鹽酸溶液；酸溶液；0.1 mol0.1 moll-1l-1氫氧化鈉溶液；氫氧化鈉溶液；0.05 mol0.05 moll-1l-1碳酸鈉溶液；碳酸鈉溶液；0.1 mol0.1 moll-1l-1醋酸溶液；甲基紅溶液；醋酸溶液；甲基紅溶液；2%2%氯化鋇溶液；氯化鋇溶液；10%naoh10%naoh；飽和的；飽和的naclnacl；10%10%醋酸。醋酸。 四、操作步驟與方法 1 1鹽析：加鹽析：加5%5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 ml5 ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉

48、淀。倒出少量混濁沉淀，加溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過濾，向?yàn)V液中添加硫少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過濾，向?yàn)V液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。酸銨粉末到不再溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。2 2重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。復(fù)合物。 取取1 1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2 ml

49、2 ml，再加，再加3%3%硝酸銀溶液硝酸銀溶液1212滴，振滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？沉淀是否溶解？為什么？3 3某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)：取某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)：取1 1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2 ml2 ml，再加，再加1 ml5%1 ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。l4

50、加熱沉淀蛋白質(zhì)：取加熱沉淀蛋白質(zhì)：取5支試管，編號(hào)。依下表順序加入試支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑：劑： 將各管混勻，觀察記錄各管情況，然后，放沸水浴中加將各管混勻，觀察記錄各管情況，然后，放沸水浴中加熱熱10min，注意觀察各管的沉淀情況，最后將第，注意觀察各管的沉淀情況，最后將第3、4、5號(hào)管號(hào)管分別用分別用10%naoh或或10%醋酸中和，觀察并解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。醋酸中和，觀察并解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。試劑管號(hào)蛋清蛋白質(zhì)（滴）0.1mol/l醋酸（滴）10%醋酸（滴） 飽和的nacl（滴）10%naoh(滴）蒸餾水（滴）110-72105-5310-5-5410-52-510-255乙醇引起的變性與

51、沉淀：取3支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑： 振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8 ml，然后在第2、3號(hào)管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1 moll-1醋酸溶液及0.05 moll-1碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1 moll-1鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。 試劑（ml）管號(hào)5%卵清蛋白溶液0.1 moll-1氫氧化鈉溶 液0.1 moll-1鹽酸溶液95%乙醇ph4.7緩沖溶液123111111111五、思考題：五、思考題：l1. 雞蛋清為何可做鉛、汞中毒的解素劑？雞蛋清為何可做鉛、汞中毒的解素劑？l2氯化汞為何

52、能做為殺菌劑？氯化汞為何能做為殺菌劑？ 實(shí)驗(yàn)五五 凝膠過濾法使蛋白質(zhì)脫鹽凝膠過濾法使蛋白質(zhì)脫鹽 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌 學(xué)習(xí)凝膠過濾法分離純化物質(zhì)的原理學(xué)習(xí)凝膠過濾法分離純化物質(zhì)的原理與操作技術(shù)與操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理l 凝膠過濾也稱凝膠層析，其分離純化物凝膠過濾也稱凝膠層析，其分離純化物質(zhì)的原理是，凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)的原理是，凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻在質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻在外部，當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時(shí)，外部，當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不同分子質(zhì)量被分開了。溶液中的物質(zhì)就按不同分子質(zhì)量被分開了。此法可用于

53、測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、樣品的此法可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、樣品的濃縮和脫鹽等方面。濃縮和脫鹽等方面。l 目前常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰目前常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠，其中最常用的是葡聚糖胺凝膠、瓊脂糖凝膠，其中最常用的是葡聚糖凝膠。葡聚糖凝膠的商品名稱為凝膠。葡聚糖凝膠的商品名稱為sephadex，它是葡萄糖通過它是葡萄糖通過-1，6-糖苷鍵形成的葡聚糖糖苷鍵形成的葡聚糖長鏈，與交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷以醚鍵相互交連而長鏈，與交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷以醚鍵相互交連而成的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，呈珠狀成的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，呈珠狀顆粒。顆粒。三、儀器、材料和試劑實(shí)

54、驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器 鐵架臺(tái)；層析柱；滴定管夾；刻度離鐵架臺(tái)；層析柱；滴定管夾；刻度離心管；白瓷板；心管；白瓷板；sephadexsephadex g-25 g-25（粒度粗，（粒度粗，5050100100目）；細(xì)乳膠管目）；細(xì)乳膠管 ；螺旋夾；螺旋夾 ；燒杯。；燒杯。 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 10% 磺柳酸；納氏試劑（萘斯特試磺柳酸；納氏試劑（萘斯特試劑）；蛋白質(zhì)劑）；蛋白質(zhì)(nh4)2so4溶液；無離子溶液；無離子水（洗脫液）水（洗脫液） 四、操作步驟與方法 1. 1. 溶脹凝膠：用去離子水浸泡溶脹凝膠：用去離子水浸泡sephadexsephadex g-25 g-25凝膠凝膠24h24h以以上（中間

55、換一次水）或用去離子水沸水浴溶脹上（中間換一次水）或用去離子水沸水浴溶脹2h2h左右。左右。2. 2. 凝膠裝柱：按實(shí)驗(yàn)教程要求安裝層析裝置，將溶脹好凝膠裝柱：按實(shí)驗(yàn)教程要求安裝層析裝置，將溶脹好的的sephadexg-25sephadexg-25裝入層析柱中。裝入層析柱中。3. 3. 洗柱：接通洗脫液，按要求洗柱并調(diào)整好流速。洗柱：接通洗脫液，按要求洗柱并調(diào)整好流速。4. 4. 加樣洗脫：吸取加樣洗脫：吸取1ml1ml樣品（蛋白質(zhì)硫酸銨溶液），小樣品（蛋白質(zhì)硫酸銨溶液），小心地加到床面上，擰松螺旋夾，待樣品全部進(jìn)入凝膠柱中，心地加到床面上，擰松螺旋夾，待樣品全部進(jìn)入凝膠柱中，接通洗脫液，開始

56、洗脫并收集洗脫液。接通洗脫液，開始洗脫并收集洗脫液。5. 5. 收集檢查：每管收集收集檢查：每管收集1ml1ml洗脫液。取洗脫液洗脫液。取洗脫液2 2滴加入白滴加入白瓷板穴中，加入納氏試劑瓷板穴中，加入納氏試劑1 1滴，如有銨鹽洗脫下來，則有黃滴，如有銨鹽洗脫下來，則有黃紅色沉淀。取洗脫液紅色沉淀。取洗脫液2 2滴置小試管中，加入磺柳酸滴置小試管中，加入磺柳酸1 1滴，如有滴，如有蛋白質(zhì)洗脫下來，則有白色混濁或沉淀出現(xiàn)。蛋白質(zhì)洗脫下來，則有白色混濁或沉淀出現(xiàn)。五、思考題：五、思考題：l1. 利用凝膠層析分離混合物時(shí)，怎樣才能得到利用凝膠層析分離混合物時(shí)，怎樣才能得到較好的分離效果？較好的分離效

57、果？l2. 還有哪些方法可進(jìn)行蛋白質(zhì)脫鹽？還有哪些方法可進(jìn)行蛋白質(zhì)脫鹽？l3. 蛋白質(zhì)溶液中的鹽分為何能通過凝膠過濾方蛋白質(zhì)溶液中的鹽分為何能通過凝膠過濾方法被脫除？法被脫除？l4. 凝膠過濾法在蛋白質(zhì)分析中還有何應(yīng)用？凝膠過濾法在蛋白質(zhì)分析中還有何應(yīng)用？實(shí)驗(yàn)六 酵母rna的分離及組分鑒定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌(1)學(xué)習(xí)稀堿法提取rna的原理和操作方法。(2)了解核酸的組分，并掌握鑒定核酸組分的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理l 酵母核酸中酵母核酸中rnarna含量較多。含量較多。rnarna可溶于堿可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即

58、得到以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到rnarna的的粗制品。粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測(cè)出上述組分的存在。解液中可以測(cè)出上述組分的存在。三、儀器、材料和試劑實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器 1 1乳缽乳缽 2 2150ml150ml錐形瓶錐形瓶 3 3水浴水浴 4 4量筒量筒 5 5布氏漏斗及抽濾瓶布氏漏斗及抽濾瓶 6 6吸管吸管 7 7滴管滴管 8 8試管試管及試管架及試管架 9 9燒杯燒杯 10 10離心機(jī)離心機(jī) 11 11漏斗。漏斗。 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑1 1氯化鐵濃

59、鹽酸溶液氯化鐵濃鹽酸溶液 2 2苔黑酚乙醇溶液苔黑酚乙醇溶液 3 3定磷試劑定磷試劑 （1 1）1717硫酸溶液硫酸溶液 將將17 ml17 ml濃硫酸濃硫酸( (比重比重1 184)84)緩緩緩緩加入到加入到83ml83ml水中。水中。（2 2）2 25 5鉬酸銨溶液鉬酸銨溶液 將將2 25g5g鉬酸銨溶于鉬酸銨溶于100ml100ml水中。水中。（3 3）1010抗壞血酸溶液抗壞血酸溶液 10 g 10 g抗壞血酸溶于抗壞血酸溶于100 ml100 ml水中，水中，貯棕色瓶保存。溶液呈淡黃色時(shí)可用，如呈深黃或棕色則失貯棕色瓶保存。溶液呈淡黃色時(shí)可用，如呈深黃或棕色則失效，需純化抗壞血酸。效

60、，需純化抗壞血酸。臨用時(shí)將上述臨用時(shí)將上述3 3種溶液與水按如下比例混合。種溶液與水按如下比例混合。1717硫酸溶液硫酸溶液:2.5:2.5鉬酸銨溶液鉬酸銨溶液:10:10抗壞血酸溶液抗壞血酸溶液: :水水=1:1:1:2(v=1:1:1:2(vv)v)。4 4酵母粉酵母粉 四、操作步驟與方法 1.1.提取提取 將將15 g酵母懸浮于酵母懸浮于90 ml 0.04 moll氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液中，并在乳缽中研磨均勻。將懸浮液轉(zhuǎn)移至中，并在乳缽中研磨均勻。將懸浮液轉(zhuǎn)移至150毫升錐形瓶中。毫升錐形瓶中。在沸水浴上加熱在沸水浴上加熱30分鐘后，冷卻。離心分鐘后，冷卻。離心(3 000rmin)