動物細胞培養(yǎng)常用方法

1、?動物細胞培養(yǎng)常用方法一. 細胞增殖周期（ cell proliferatinal cycle）概念細胞周期是描述細胞增殖和分化交替發(fā)生變化的概念。而細胞增殖周期主要是從細胞增殖角度賦予細胞活動的概念，兩者不應(yīng)混為一談。 細胞增殖周期是指細胞從一次分裂結(jié)束開始生長， 到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。根據(jù)細胞增殖周期不同時期的生化特點，劃分為四個連續(xù)的時期，即g1期（dna 合成前期），s期（dna 合成期） ，g2期（dna 合成后期），m期（有絲分裂期）。如以 g1期為起點，那么細胞增殖周期的各時期應(yīng)循著g1-s-g2-m 的順序進行， g1、s、g2三期合稱為細胞間期，此期完成細胞生長過程。

2、m期完成遺傳物質(zhì)的分配。因此，細胞增殖周期 =間期（ g1期+s期+g2期）+分裂期（ m期） 。二. 培養(yǎng)細胞生命期（ life span of culture cells）很多細胞特別是正常細胞， 在體外的生存不是無限的， 而是具有一個生命期。索維培養(yǎng)細胞生命期， 是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。培養(yǎng)細胞的生命期與細胞的種類、 性狀和原供體的年齡、 健康等情況有關(guān)。 人胚二倍體成纖維細胞，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，科傳 3050代，相當于 150300個細胞增殖周期，能維持 1 年左右的生存時間，最后衰老凋亡。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短； 其他細胞如肝細胞或腎細胞， 生存

3、時間更短， 僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時， 細胞的生存期才可能發(fā)生改變。 正常細胞培養(yǎng)時， 不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞生命的全過程中，大致都經(jīng)歷以下三個階段：原代培養(yǎng)期、傳代期、衰退期。三.培養(yǎng)細胞一代生存期培養(yǎng)細胞的生存空間和營養(yǎng)是有限的，當細胞增殖達到一定密度后， 則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存， 這一過程叫傳代（passage或 subculture ） 。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細胞的數(shù)量和細胞增殖的速度?動物細胞培養(yǎng)常用方法等有關(guān)。接種細胞

4、數(shù)量大，細胞基數(shù)大。相同增殖速度條件下，細胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快（實際上細胞接種數(shù)量大時細胞增殖速度比稀少時要快）；連續(xù)細胞系和腫瘤細胞系比初代培養(yǎng)細胞增值快；培養(yǎng)液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。所謂細胞“一代”一詞，僅指從細胞接種到分離培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法， 它與細胞時代或倍增非同意含義。如某一細胞系為第 20 代細胞，即指該細胞系已傳代20 次。在細胞一代中，細胞能倍增36次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下六個階段：游離期、貼壁期、潛伏期、指數(shù)增長期、停滯期、衰退期。四. 無菌操作要求（一） 實驗前培養(yǎng)室和超凈臺的消毒。在工作臺

5、面消毒時，切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液用紫外線照射； 工作臺面上的用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線，降低消毒效果；一些操作用具，如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75% 酒精擦拭后置臺內(nèi)同時紫外線照射消毒。（二） 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時放置， 其他實驗用品用完后應(yīng)及時移出，以利氣體流通。 試劑瓶口和外壁要用75酒精擦拭后才能帶人無菌操作臺內(nèi)。超凈臺上的物品布局要合理，污物廢液缸、酒精棉球缸在右側(cè)位， 酒精燈在中央?yún)^(qū)， 試劑瓶在左側(cè)位。實驗操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。（三） 洗手和著裝：嚴格按照外科手術(shù)要求

6、消毒著裝，雙手用肥皂洗凈后，浸泡于消毒液中，并用75的酒精擦拭。（四） 操作中，小心取出無菌實驗用品，避免造成污染。盡量減少手與器材的接觸面，學會手指操作。手指不能觸及器材使用端及容器瓶口，如觸及，需要更換或燒灼后再使用。 組織、細胞及培養(yǎng)板在未做處理和使用前，不要過早暴露于空氣中。（五） 一切操作，如打開或封閉瓶口，安裝吸管、注射器等，都要在酒精燈火?動物細胞培養(yǎng)常用方法焰前方進行。瓶口、吸管、注射器等使用前要經(jīng)過火焰燒灼后使用。但要注意，金屬器械不能在火焰中長時間燒灼，以防退火 c 另外，膠塞、橡皮乳頭及塑料制品等細胞培養(yǎng)用品過火焰時也不能時間太長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體， 危害細胞。（六）

7、 試劑瓶順風斜放在支架上，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液瓶不要過早打開。容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45角取用，盡量避免垂直放置以防止下落細菌的污染。 吸取液體前， 瓶口和吸管應(yīng)行火焰消毒， 吸取液體時避免瓶口和吸管碰撞。 吸管不能混用， 吸過培養(yǎng)液的吸管不能再燒灼，因殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)液成分如蛋白質(zhì)等燒焦后會產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用時會將其帶到培養(yǎng)基中。不要在打開的容器正上方操作。瓶口液滴不能倒回瓶內(nèi)， 液滴用于酒精棉球擦拭，瓶口再經(jīng)火焰消毒。（七） 不同的細胞同時操作時，要專管專用，并要勤換吸管，防止擴大污染和細胞交叉污染。（八） 操作者動作要準確敏捷，盡量避免空氣流動。不要面向操作臺講話或咳

8、嗽，避免唾沫將微生物帶人超凈臺內(nèi)，污染空氣。同時應(yīng)注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應(yīng)特別小心，并選擇適當?shù)燃壍臒o菌操作臺(至少兩級 ) 。操作過程中小心有毒性試劑，例如 dmso 及 tpa等。實驗者離開超凈臺時，立即用肘關(guān)節(jié)關(guān)閉側(cè)窗口，避免無茵室內(nèi)細菌隨空氣流人凈化操作區(qū)。五. 高壓蒸汽滅菌裝置（一） 使用方法1.首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。2.放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。 三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3.加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層

9、滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4.通電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后， 關(guān)上排氣閥， 讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。5.到達滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當壓力表的壓力降至 0 時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到 0 時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降而發(fā)生意外事故。（二） 注意事項1.消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止意外事件發(fā)生。消毒完畢后從壓力蒸汽

10、消毒器中取出的消毒好的物品( 不包括液體 ) ，應(yīng)立即放到 6070烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易被微生物污染。 但如果消毒物中有液體時， 一定要待消毒器冷卻后方可打開消毒器的蓋，不能先打開閥門放氣，否則液體會溢出。2.不同壓力蒸汽所達到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。平衡鹽溶液及其他需要滅菌的液體：121，10 磅(68.95kpa) ，20min；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：121，15磅(103.42kpa) 、20min。六. 使用血清的注意事項血清的質(zhì)量、 種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同

11、， 尤其是對克隆細胞的牛長， 某些批次血清可能含?動物細胞培養(yǎng)常用方法有毒性或抑制細胞生長的物質(zhì)。因此，在購買大量血清之前， 必須對血清支持細胞生長能力進行檢測，包括接種率、生長曲線、維持細胞特性、無生物污染性等方面，然后再大量購買質(zhì)量好的同一批號的血清，并注意以下幾點：（一） 需要長期保存的血清必須儲存于-20 或-70低溫冰箱中，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融。 4冰箱中保存時間切勿超過1 個月。由于血清結(jié)冰時體積會增加約10，因此，血清在凍入低溫冰箱前必須預(yù)留一定的體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。（二） 一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過

12、濾，切勿直接過濾血清。（三） 瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 或-70低溫冰箱中的血清放人4冰箱中溶解 1d，然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻 ( 小心勿造成氣泡 ) ，使溫度與成分均一， 減少沉淀的發(fā)生。 切勿直接將血清從 -20或-70直接放人37解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。（四） 熱滅活是指 56，30min 加熱已完全解凍的血清。加熱過程中需規(guī)律搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補體成分滅活。除非必須， 一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會產(chǎn)生其他不明效應(yīng)。究竟滅活與否，以有利于實驗為主。

13、切勿將血清在37放置太久，否則血清會變得渾濁，黏度增大，同時血清中的有效成分會被破壞而影響血清質(zhì)量。（五） 血清中的絮狀物主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中的纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？?000r/min ，離心 5min 去除，也可不用處理。（六） 采購血清時，最好先從供應(yīng)商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用 6 個月至 1 年的量，直至用到另一批經(jīng)過預(yù)先試驗的樣品代替。七. 基本培養(yǎng)基的應(yīng)用基本培養(yǎng)基只能維持細胞的生存，想要使細胞生長和增殖， 還需補充部分天然培養(yǎng)基和一些補充成分，效果才更好。主要是牛血清、谷氨酰胺等。此外，為防止污染， 還經(jīng)常加一定的

14、抗菌素。 補加了上述物質(zhì)的培養(yǎng)基叫完全培養(yǎng)基。按其血清量的多少又分為生長液和維持液。由于培養(yǎng)液是細胞賴以生存的環(huán)境，制備過程要操作嚴格，避免混入雜質(zhì)。使用的成分應(yīng)精心選擇，必須用質(zhì)量最優(yōu)的試劑，容器要仔細清洗和消毒。八. 合成培養(yǎng)基的保存（一） 液體培養(yǎng)基的保存：液體培養(yǎng)基應(yīng)于4冰箱避光保存，實驗前放入 37預(yù)熱。液體培養(yǎng)基中的l-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果細胞生長不良，可以再添加適量l-谷氨酰胺。液體培養(yǎng)基經(jīng)冷凍后再經(jīng)溶化時，其溶液的 ph值會發(fā)生改變， 溶液往往變堿， 某些成分溶解也會對細胞生長不利。?動物細胞培養(yǎng)常用方法故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養(yǎng)基在

15、冷藏條件下可存放6個月至一年。（二） 干粉培養(yǎng)基的保存： 4冰箱避光保存，有效期36 個月。九. 平衡鹽溶液（ balanced salt solution，bss ）平衡鹽溶液是細胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要是由無機鹽、葡萄糖組成，其作用是維持細胞滲透壓平衡，保持ph穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液、取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配置其他試劑等，最簡單的 bss是 ringer 。平衡鹽溶液的種類很多，常用的幾種見表。各種平衡鹽溶液的主要區(qū)別在于氯化鈉的濃度、 離子的濃度及緩沖系統(tǒng)不同， 可根據(jù)需要選用適當?shù)膫€衡鹽溶液。最常用的bss是 d-hanks、hank s、ea

16、rle 液。d-hanks和 hanks 的一個主要區(qū)別是前者不含有ca2+、mg2+，因此 d-hanks 常用于配制胰酶溶液。 hanks 和 earle 液的主要區(qū)別是緩沖能力個同，earle 液含會高濃度的 nahco3（2.2g/l ） ，緩沖能力較強，適合于5%c02的培養(yǎng)條件，在空氣水平的 c02中， ，溶液會變堿， hanks 液僅含有 0.35g/l nahco3，緩沖能力較弱，不能用于 5%c02的環(huán)境，若放入c02培養(yǎng)箱，溶液將迅速變酸使用時應(yīng)注意。平衡鹽溶液中一般加有少量的酚紅作為溶液酸堿度的指示劑，以便于觀察培養(yǎng)液ph的變化。溶液中性時為桃紅色，偏酸時呈黃色，偏堿時則

17、為紫紅色。配制平衡鹽溶液應(yīng)使用雙蒸水。如果配方中含有 ca2+、mg2+，應(yīng)省首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。十. 消化液進行原代培養(yǎng)時常常需要用消化液將組織塊消化解離形成單細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要用消化液將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰蛋白酶(trypsin)溶液和二乙烯四乙酸二鈉(edta)溶液， 有時也用膠原酶 (collagenase)溶液。（一） 胰蛋白酶溶液胰蛋由酶是從動物胰臟分離的一種水解酶，其主要功能為使細胞間的蛋白質(zhì)水解和細胞分散。 胰蛋白酶的活性可用消化酪蛋白的能力表示，常用的有 1：125和 1：250，即一份胰酶可消化125 或

18、250 份酪蛋白。胰蛋白酶分散細胞的能力與細胞種類及細胞特性有關(guān)， 適用于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、?動物細胞培養(yǎng)常用方法肝、腎等組織。 對傳代培養(yǎng)細胞效果也很好。但對于纖維性組織和較硬的癌組織效果差。不同種類的細胞以及不同數(shù)量的細胞采用胰蛋白酶消化的時間也不相同。另外，胰蛋白酶濃度大、作用溫度高、時間長時，對細胞分離能力也大，但超過一定的限度會損傷細胞。 新配置的胰蛋白酶可使細胞分散速度增快。細胞培養(yǎng)用胰蛋白酶溶液一般配制成0.25%0.125% 的濃度，配制時要用不含ca2+、mg2+及血清的平衡鹽溶液 ( 如前面的 d-hanks) ，因為 ca2+、mg2+是細胞膜的重要

19、組成成分，它們能促使細胞凝集， 有阻礙消化的作用； 血清會對胰蛋白酶產(chǎn)生抑制作用。因此，也常用含血清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化作用。胰酶作用及溶解的最佳 ph是 89，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至ph 8 左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調(diào)至ph 75，也可不調(diào)。（二） edta 溶液edta 是一種化學螯合劑，能整合ca2+和 mg2+，溶液毒性小，使用方便，也常用來解離細胞。它的作用機制是，一些細胞尤其是上皮細胞在生長過程中需ca2+和 mg2+，參與細胞的連接，維持組織的完整性，而edta從細胞生存環(huán)境中奪取ca2+和 mg2+，并與這些離子形成螯合物，從而使細胞分離。因此，對于一些貼

20、壁特別牢固的細胞，可以用edta 和胰酶的混合液 (1 ：1)進行消化，提高消化率。注意：使用 edta 處理細胞后，一定要用hanks 液沖洗干凈，一是由于殘留的 edta 可損傷線粒體， 它與核蛋白中的ca2+和 mg2+結(jié)合，破壞核蛋白結(jié)構(gòu)， 且細胞長期處于無 ca2+的環(huán)境中， k+濃度降低， 細胞呼吸減弱， 從而影響細胞生長。二是由于 edta 作用不受血清抑制。另外，膠原酶的消化作用依賴于ca2+，因此，edta 不可與膠原酶聯(lián)用。十一.抗菌素溶液常用的是青鏈霉素， 俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭氏陽性菌有效，鏈霉素豐主要對革蘭氏陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細菌

21、污染。配制時用 10ml三蒸水溶解 1.0 l06 g/ 瓶的硫酸鏈霉素，取8ml硫酸鏈霉素液溶解 8.0 l05iu/ 瓶的青霉素粉，即成青、鏈霉素各1.0 105iu/ml 的母液。使用時， 100ml培養(yǎng)基內(nèi)加母液 0.1ml，這樣培養(yǎng)基內(nèi)青、鏈霉素的最終濃度為各 100iu/ml。有時為防止支原體和霉菌污染， 要用到卡那霉素液、 制霉菌素或兩性霉素b?？敲顾氐呐浞ǎ簩⒁黄靠敲顾?5.0 104g/ 瓶)溶于 5ml hank s 液中，即成 1.0 104g/ml 母液。使用時每100ml培養(yǎng)基內(nèi)加 0.5ml母液，最終使用濃度為 50g/ml。制霉菌素不能溶于水，故只能配成500

22、0iu/ml 懸液。使用時每100ml ，培養(yǎng)基內(nèi)加 0.5ml母液，最終使用濃度為25iu/ml。在實際工作中，選擇哪一種抗生素、劑量多少、何時加入等，與污染源、抗菌素的抗菌范圍、 抗菌素的穩(wěn)定性等有密切關(guān)系，應(yīng)靈活運用。 需要特別注意的是，抗菌素液配制對要無菌操作、小量分裝、-20凍存。?動物細胞培養(yǎng)常用方法十二.細胞計數(shù)原代細胞制備時培養(yǎng)的細胞要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。 細胞計數(shù)是細胞培養(yǎng)中一項基本技術(shù)，是了解培養(yǎng)細胞生長狀態(tài)以及測定培養(yǎng)基、血清、藥物等物質(zhì)生物學作用的重要手段。細胞計數(shù)主要利用血球計數(shù)板來完成。血球計數(shù)板的每一大方格長

23、為1mm ，寬為 1mm ，高為 0.1mm ，體積為 0.1mm3，可容納的溶液是0.1 l，每 lml 溶液中所含細胞數(shù)即是視野中每一大方格數(shù)出的細胞數(shù)的10000 倍。（一） 準備計數(shù)板：用酒精清潔計數(shù)板和蓋玻片，然后用吸水紙輕輕擦干；（二） 準備細胞懸液：用0.25%胰蛋白酶消化單層細胞或收集懸浮培養(yǎng)細胞，制成單個細胞懸液。要求細胞密度不低于104個/ml，若細胞數(shù)很少，應(yīng)將懸液離心(1000r/min ，5min)，重懸浮于 dmem 培養(yǎng)基中；（三） 加樣：將蓋玻片蓋在計數(shù)板兩槽中間。 用微量移液器輕輕吹打細胞懸液，吸取少量細胞懸液， 在計數(shù)板上蓋玻片一側(cè)邊沿加細胞懸液，加樣量不要

24、溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。否則要將計數(shù)扳和蓋玻片擦干凈重新加樣。（四） 計數(shù)：在顯微鏡下，用10物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)。細胞壓中線時，只計左側(cè)和上方者，不計右側(cè)和下方者。十三.細胞傳代培養(yǎng)（一） 細胞在培養(yǎng)過程中隨著數(shù)量的增長，尤其細胞生長十分旺盛時，代謝產(chǎn)物堆積， c02增多，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分枯竭，一方面長滿培養(yǎng)空間，另一方面細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度逐漸減慢甚至停止， 更換培養(yǎng)基也不能使細胞繼續(xù)生長， 這種情況下， 為使細胞能繼續(xù)生長， 都需要將其分成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)，再進行培養(yǎng)，這個過程被稱為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去

25、的方法，同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。細胞長滿80%90%或剛剛?cè)繀R合是細胞傳代的理想時期，過早細胞產(chǎn)量不足，過晚細胞健康狀態(tài)不佳。（二） 將分裝好的細胞培養(yǎng)物置37、5%c02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，必要時可于23d后換 1 次生長液，類上皮細胞在57d后可長成單層細胞，成纖維細胞則以34d?動物細胞培養(yǎng)常用方法或 57d為宜。單層細胞已鋪滿瓶皿底面時，如繼續(xù)培養(yǎng)，則易老化，甚至脫落；感染病毒等可影響特異性細胞病變效應(yīng)的判斷，因此成片細胞不能當天使用對應(yīng)換成維持液 ( 不含或僅含 2% 以下血清的培養(yǎng)液 ) ，以后每隔 57d換維持液 1 次，一般可維持 13 周。（三） 這種長成單層的細胞可進行傳代培養(yǎng)。細胞傳代時，首先棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入 5ml左右生理鹽水，清洗細胞表面，然后向瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶( 或