第八章酶催化

1、第八章 酶催化章節(jié)分配一、酶的結構和分類二、酶的分離與純化三、酶活力測定四、酶作用動力學五、酶的抑制作用六、pH值和溫度對酶作用的影響七、酶的作用機制八、應用酶學九、酶法制備L-氨基酸十、生物催化反應器十一、生物有機化學與生物催化 生物催化的定義：是利用生物催化劑(主要是酶或微生物)來改變(通常是加快)化學反應速度的作用。生物催化轉化的分類：(1)發(fā)酵：用活細胞將原材料(如糖、淀粉或甲醇)轉化成更復雜的目標產物。(2)前體發(fā)酵：發(fā)酵過程中添加前體物質，并由活細胞將其轉化成目標產物。(3)生物轉化：用酶或靜息細胞經過一系列步驟，將前體轉化成目標產物。(4)酶催化：提取粗酶或部分純化的酶

2、，將底物轉化成目標產物。生物催化的產生與發(fā)展：遠古時代酒的釀造：酵母發(fā)酵的產物，是細胞內酶作用的結果；飴糖的制作：用麥曲含有的淀粉酶將淀粉講解為麥芽糖；豆類做醬：在霉菌蛋白酶作用下，豆類蛋白質水解得豆醬和豆鼓，壓榨后制得醬油。1878年，Kuhne第一次提出“酶”(Enzyme)的概念,意為“在酵母中”(in yeast)；1894年，Emil Fischer發(fā)現了酶對底物(酶作用的物質)的專一性現象,提出了“鎖和鑰匙”模型；酶晶體的獲得，才認識到酶是蛋白質，是由酰胺鍵連接的氨基酸組成；1926年，Sumner從刀豆中得到脲酶結晶，催化尿素水解,產生CO2和NH3；1967年，絲氨酸蛋白酶的發(fā)

3、現，它專門用于洗滌劑；1992年，用于生產酶的克隆技術的誕生；最近發(fā)現除了“經典”酶以外，某些生物分子也具有催化活性。1982年Cech小組發(fā)現，四膜蟲的rRNA(核糖體核糖核酸)前體能在完全沒有蛋白質的情況下進行自我加工，催化得到成熟的rRNA產物。這就是說，RNA本身就是生物催化劑。20世紀80年代以來，基因工程技術用于酶學研究得到高度重視。應用DNA重組技術可以生產出高效能、高質量的酶產品，用定點突變法在指定位點突變，可以改變酶的催化活性與專一性。生物催化研究的重要意義：(1)生物催化與生物轉化是與生命活動及人類發(fā)展關系最為密切的自然規(guī)律之一；(2)基于生物催化與生物轉化的物質加工新模式

4、是人類發(fā)展的必然趨勢；(3)生物催化的獨特優(yōu)勢可以促進傳統(tǒng)產業(yè)的升級改造；(4)生物催化對于我國的經濟發(fā)展和安全具有戰(zhàn)略意義。生物催化的主要方式：生物催化幾乎能應用于所有化學反應，例如氧化反應、羥基化反應、脫氫反應、還原反應、水解反應、?；磻?。生物催化材料有酶、微生物菌體、動植物的組織及細胞。在手性合成中應用較多的是水解酶、氧化-還原酶以及面包酵母等微生物。生物催化的方式有添加前體發(fā)酵法、游離酶法、靜息細胞法、固定化酶法、固定化細胞法?？稍谒?、有機相和水-有機溶劑雙相等系統(tǒng)中進行。生物催化反應的特點：(1)高催化效率(2)高專一性(3)酶活性受一些化合物調控  酶催

5、化能力舉例底物催化劑溫度(K)速度常數*脲(水解)H+脲酶3352947.4×10-75.0×1052H2O2" 2H2O+O2Fe2+過氧化氫酶295295563.5×107*單位：(mol·L-1)-1·s-1NH3的合成：在植物中通常是25和中性pH下由固氮酶催化完成，酶是由兩個解離的蛋白質組分組成的一個復雜的系統(tǒng)，其中一個含金屬鐵，另一個含鐵和鉬，反應需消耗一些ATP(三磷酸腺苷)分子；工業(yè)上由氮和氫合成氨時，需在700-900K、10-90MPa下，還要有鐵及其他微量金屬氧化物作催化劑才能完全反應。酶催化的最適條件幾乎都為溫

6、和的溫度和非極端pH值。專一性：有些酶專一性很低(鍵專一性),如肽酶、磷酸(酯)酶、酯酶,可以作用很多底物, 只要求化學鍵相同,例如它們可分別作用肽、磷酸酯、羧酸酯;具有中等程度專一性的為基團專一性,如己糖激酶可以催化很多己醛糖的磷酸化;大多數酶呈絕對或幾乎絕對的專一性，它們只催化一種底物進行快速反應。調節(jié)性：酸濃度的調節(jié):誘導或抑制酶的合成,調節(jié)酶的降解;抑制劑的調節(jié):酶的活性受到大分子抑制劑或小分子抑制劑抑制,從而影響活力;金屬離子的調節(jié):有些酶需要K+活化,但Na+不能活化這些酶,有時還有抑制作用。生物催化研究的新進展：1.生物催化一進入傳統(tǒng)的化工領域，就給原料來源、能源消耗、經濟效益、

7、環(huán)境保護等方面帶來了根本性的變化。2.作為生物技術第三次浪潮標志的生物催化技術已成為發(fā)達國家的重要科技與產業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略，以生物催化技術為核心的生物制造產業(yè)正以指數規(guī)律加速發(fā)展。3.目前，美國在酶催化劑及手性化合物合成方面已處于領先地位，其生物催化制造的化學品產值已超過生物醫(yī)藥的產值。 所以，新的生物催化劑是21世紀可持續(xù)發(fā)展的化學加工業(yè)的必需工具。到2020年通過生物催化技術，化學加工業(yè)的原料、水資源及能量消耗將各降低30，減少污染物排放和污染擴散30。生物催化技術的應用領域： 工業(yè)部門應用領域成熟程度及應用情況石油煉制生物脫硫工業(yè)示范大宗化學品乙醇/甘油已成熟/工業(yè)示范高分子聚合物可

8、生物降解聚合物工業(yè)應用特殊有機中間體手性中間體工業(yè)應用醫(yī)藥醫(yī)用蛋白/手性藥物工業(yè)應用農用化學品生物殺蟲劑工業(yè)應用日用化學品乳酸/檸檬酸接近成熟/工業(yè)應用環(huán)境保護廢物處理技術開發(fā)中 現狀：1996年生物催化劑已占世界催化劑90億美元市場的11%；美國EBC成功開發(fā)了一種生物脫硫的新工藝；我國：生物催化丙烯腈制丙烯酰胺、有機廢水發(fā)酵法制氫技術、生物發(fā)酵法制造甘油已建成投產或通過中試驗證。 §1 酶的結構和分類蛋白質是構成人體的基礎物質、酶是蛋白質、酶由長鏈氨基酸組成、酶結構的4個層次：       

9、    溶菌酶(lysozyme)的一級結構圖：             酶的二級結構:-螺旋和-褶片              蛋白溶菌酶的三級結構圖：           &#

10、160;  溶菌酶部分四級結構示意圖：            氨基酸的排序決定酶的功能：            酶的分類(編號的第一個數字)：表示這個酶屬于哪一大類氧化還原酶：用于將電子從一個分子轉移到另一個分子;轉移酶：催化原子基團從一個分子轉移到另一個分子;水解酶：催化底物與水之間的反應,以及將水結合到某些分子上;裂解酶：從底物上移去

11、一個基團;異構酶：催化原子基團從一個位置轉移到另一個位置;連接酶：利用共價鍵將分子連接到一起.編號的第二個數字：表示在類以下的大組氧化還原酶：表示氧化反應供體基團的類型；轉移酶：表示被轉移基團的性質；水解酶：表示被水解鍵的類型；裂解酶：表示被裂解鍵的類型；異構酶：表示異構作用的類型；連接酶：表示生成鍵的類型.編號的第三和第四個數字：編號的第三個數字：表示大組下面的小組，各個數字在不同類別，不同大組中都有不同的含義；編號的第四個數字：是小組中各種酶的流水編號.例如：氧化還原酶的第二個數字E.C.1.（氫或電子供體）醇(RRCHOH) 1；醛或酮(RRC=O) 2； RRCHCHRR 3；伯胺RC

12、HNH2 4；仲胺RRCHNH 5；NADH或NADPH 6。氧化還原酶的第三個數字E.C.1.16.（氫或電子受體）NAD+或NADP+ 1； Fe3+(如細胞色素) 2；O2 3； 其他未分類的受體 99。NAD+(NADP+)：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (磷酸)轉移酶的第二個數字E.C.2.（轉移的基團）含一個碳原子的基團 1；醛基或酮基 2；酰基 3；糖基 4；含磷基團 7。轉移酶的第三個數字，例如：E.C.2.1.1 轉移甲基的酶類E.C.2.1.2 轉移羥甲基的酶類E.C.2.1.3 轉移羧基的酶類E.C.2.4.1 轉移己糖基的酶類E.C.2.1.4 轉移戊糖基的酶類水解酶的第二個數

13、字E.C.3.（水解的鍵）酯 鍵 1；糖苷鍵 2；肽 鍵 4；肽鍵以外的C-N鍵 5。水解酶的第三個數字，例如：E.C.3.1.1 水解羧酸酯的酶類E.C.3.1.2 水解硫代酯的酶類E.C.3.1.3 水解磷酸單酯的酶類E.C.3.1.4 水解磷酸二酯的酶類裂解酶的第二個數字E.C.4.（裂解的鍵）CC 1； CO 2； CN 3； CS 4。裂解酶的第三個數字（以CC裂解酶為例，移去基團為）E.C.4.1.1 羧基(即CO2)E.C.4.1.2 醛基(CH=O)E.C.4.1.3 酮羧基(-OOC-C=O)異構酶的第二個數字E.C.5.（反應類型）消旋和差向異構 1； 順式-反式異構 2；

14、分子內氧化還原酶類 3； 分子內的轉移反應 4。異構酶的第三個數字，例如：底物E.C.5.1.1 氨基羧E.C.5.1.2 羥基羧酸E.C.5.1.3 糖類連接酶的第二個數字（合成的鍵）CO 1； CS 2； CN 3； CC 4連接酶的第三個數字，例如：進一步說明合成的鍵E.C.6.3.1 羧酸-氨(胺)連接酶類酰胺合成酶類E.C.6.3.2 羧酸-氨基酸連接酶類肽合成酶類 §2 酶的分離與純化酶的純化獨有的特點：特定的一種酶在細胞中的含量很少，給純化帶來了困難；酶可以通過測定活力的方法加以跟蹤，能迅速找出純化過程的關鍵所在。酶的純化過程包括下列步驟：  

15、60;       建立一個適當的測活方法測定酶活力方法要求高靈敏性、高準確性、是否經濟、方法簡單。          酶源選材要以含酶豐富、取材方便、經濟為原則例如，在分離純化動物Cu、Zn-SOD（超氧化物歧化酶）時，一般以動物血球為原料；Mn-SOD主要存在于線粒體中，所以肝、腎臟適宜作原材料；利用動植物細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術，可獲得極為珍貴的原材料（如人參細胞、某些昆蟲細胞等），用于酶的分離純化；利用基因工程重組DNA技術，使某些在細胞中含量極微的

16、酶的純化成為可能。          酶的提取除在體液中提取酶或胞外酶外，一般是將含目的酶的生物組織破碎，促使酶增溶溶解，最大程度的提高抽提液中酶的濃度。生物組織的破碎方法有：機械法、超聲波法、凍融法、滲透壓法、酶消化法。超聲波法：細菌和酵母細胞能得到很好的破碎；問題：超聲空穴局部過熱引起酶活性喪失，所以時間應盡可能短，容器周圍以冰浴處理。凍融法：生物組織經冰凍后，細胞胞液結成冰晶，使細胞壁脹破；簡單易行，但效率不高，需反復幾次才能達到破壁效果；若凍融時間過長，還應注意胞內蛋白酶作用引起的后果，一般需在凍融液中加入

17、絡合劑EDTA等蛋白酶抑制劑以防破壞目的酶。滲透壓法：是破碎細胞最溫和的方法之一，細胞在低滲溶液中溶脹破碎；此法對具有堅韌的多糖細胞壁的細胞，如植物、細菌和霉菌不太適用。酶消化法：利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶對細胞膜或細胞壁的酶解作用，使細胞崩解破碎；酶消化法常與其他破碎方法聯合使用，如在大腸桿菌凍融液中加入溶菌酶就可大大提高破碎效果。破碎生物組織一般在適當的緩沖溶液中進行。典型的抽提液由以下幾部分組成：抽提液=離子強度調節(jié)劑+pH緩沖劑+溫度效應劑蛋白酶抑制劑防氧化劑重金屬絡合劑增溶劑          酶的提

18、純：常用的提純方法如下。 性 質方 法溶解度改變離子強度、改變pH、溫度、改變介電常數電荷極性離子交換層析、色譜聚焦、電泳、等電聚焦大小或重量離心分離、透析超濾、凝膠過濾親和部位親和層析、免疫吸附層析、共價層析           酶的純度檢驗酶純化的目標是使酶制劑具有最大的催化活性和最高純度，以下幾種方法用于檢驗這些指標：1. 酶純度的檢驗2. 酶催化活性的檢驗3. 酶活性部位滴定§3 酶活力測定在酶作用下化學反應進行的速度，就代表酶的活力；酶活力的測定，實質上就是一個測定為酶所催化

19、的反應速度問題。在實際測定過程中，為了保證測得的是初速度，往往使底物濃度足夠大，把酶完全飽和，這樣整個酶反應對于底物來說是零級反應，而對于酶來說是一級反應，這樣測得的初速度可以比較可靠地反映酶的含量。酶活力的測定方法：中止法：是在恒溫反應系統(tǒng)中進行酶促反應，間隔一定的時間，分幾次取出一定容積的反應液，使酶即刻停止作用，然后分析產物的生成量或底物的消耗量；連續(xù)法：不需取樣中止反應，而是基于反應過程中光譜吸收、氣體體積、酸堿度、溫度、粘度等的變化用儀器跟蹤監(jiān)測反應進行的過程，算出酶活性。一般的連續(xù)法包括：光譜吸收法：主要是指分光光度法和熒光法。     &#

20、160;        分光光度法是利用反應物和產物在紫外和可見光部分的光吸收不同，選擇一適當的濃度，連續(xù)測定出反應過程中光吸收的變化。該法適用于反應速度較快的酶；              熒光法是具有熒光性的化合物吸收了某一波長的光后發(fā)射出更長波長的光。只要酶反應的底物或產物之一具有熒光，測定熒光的變化就可表示出酶反應的速度。電化學法：溶液的電勢取決于被測物質的濃度和性質，采用這一原理制成的離子選擇性電

21、極，如pH電極可測定酶反應過程中反應液pH的變化，從而得知參與反應的酶的活力；實際上，H+變化的酶促反應需要不斷加入酸或堿來恒定溶液的pH值，才能使酶活力不發(fā)生變化。量氣法：在酶反應底物或產物之一為氣體時，可通過測量反應系統(tǒng)中氣相的體積或壓力的改變，計算出氣體釋放或吸收的量；根據氣體變化和時間的關系，即可求得酶反應速度，準確程度較光譜吸收法低。量熱法：由于在反應過程中有反應熱的變化，用非常靈敏的量熱計可以測定酶反應速度；量熱法靈敏、無干擾，且很通用。旋光法：在某些酶催化反應中，底物和產物的旋光有所不同，這時就可以根據旋光的變化來跟蹤酶反應過程；在某些情況下，可通過形成絡合物來提高旋光度。酶活力

22、的定義與表示方法：國際酶學委員會曾規(guī)定：一分鐘內轉化一個微摩爾底物所需的酶量為一個國際單位IU；規(guī)定反應必須在25，在具有最適底物濃度、最適緩沖液離子強度和pH的系統(tǒng)內進行；EC推薦一個新的酶活力國際單位kat:一個kat單位定義為:每秒鐘能使一個摩爾底物轉化的酶量,則1kat=6×107IU。酶反應的分析：              總反應           &#

23、160;  部分反應一個由特定的酶所催化的化學反應，當寫作計量化學方程式時，就稱為總反應（Overall reaction）；從底物A與B生成產物P與Q的總反應，可寫作：E + A + B = E + P + Q在適當條件下（如缺少一種底物），那么總反應的一部分就能被觀察到，這就稱作部分反應；舉例： Eox + S Ered + P Ered + O2 Eox + H2O2編號E.C.1.1.3.4的葡萄糖氧化酶催化的總反應為：-D-葡萄糖 + O2 " D-葡萄糖酸-內酯 + H2O2§4 酶作用動力學一、單底物酶促反應動力學· 以底物S、生成產物P的

24、酶催化反應為例，以E表示酶，其反應歷程如下： E + S D ES " P + E· 第一步：酶和底物形成中間配合物ES； · 第二步：ES配合物釋放能量，生成產物P和酶。 單底物酶催化反應與非酶催化反應的進程曲線圖如下：          對典型的單底物酶催化反應：酶的總濃度：(CE)t = CE + CES假定S、E和ES很快達到平衡，ES的分解是控速步驟，則在平衡時E + S D ES " P + E    &

25、#160;其中：kM是酶的特性常數，表明酶和底物間親和力的大小，kM愈小的酶，其催化活性愈高。酶催化反應的速率：r = k2CES，代進上式，得 即Michaelis-Menten(米氏)動力學方程。k2也稱為kcat，代表酶催化反應的轉化數(turnover number)。在極限情況下：1. 若底物濃度很大，使催化活性中心飽和，Cs>kM，此時上式簡化為Kcat為一級速率常數，反應速率取決于酶量。若反應速率以每個酶分子來表示，而不是以單位體積來表示，則應為零級反應。2. 如果底物對活性中心覆蓋度很低， CSkM，動力學方程簡化為：  Kcat/kM為二級

26、反應速率常數，若反應速率以每個活性中心表示，則為表觀一級反應。· 從動力學方程可見，酶的濃度、底物濃度、產物濃度都影響酶催化反應速率。此外溫度、酸堿度、離子強度和抑制劑也會影響酶催化反應。 · 酶催化反應速率與溫度的關系服從Arrhenius方程，溫度升高時，反應速率呈指數上升，與化學催化的規(guī)律相同；但酶蛋白質溫度過高，則易于變性，導致酶的催化活性下降，甚至失活；一般蛋白質在45-50便開始變性，到55變性已相當嚴重。 酶促反應按底物數分類： 底物數酶分類催化反應酶種類占總酶1. 單底物異構酶A DB5%2. 單向單底物裂解酶A DB+C12%3. 假單底物水解酶

27、A-B+H2ODA-OH+BH26%4. 雙底物氧化還原酶基團轉移酶AH2+BDA+BH2A+BXDAX+B27%5. 三底物連接酶A+B+ATPDAB+ADP+P130% 二、酶作用于多底物時的動力學雙底物、雙產物反應通式為：E + A + B = E + P + Q 考慮酶與底物是否形成三元絡合物，將酶分為兩大類。1. 反應過程中形成三元絡合物 2. 反應過程中不形成三元絡合物 E + A + B " EAB " EPQ " E + P + Q 形成了三元絡合物。A + E " EA " FP " F " FB

28、 " EQ " E + Q酶首先與一個底物結合，釋放一個產物，再與另一個底物結合，再釋放出產物，即底物和產物交替地與酶結合或從酶釋放。好像打乒乓一樣一來一去。反應過程中無三元絡合物形成。雙底物反應恒態(tài)動力學：Alberty推導的一般速度方程為：    Vmax A、B都飽和時的最大初速度；KmA B飽和時v0=1/2Vmax的A的濃度；KmB A飽和時v0=1/2Vmax的B的濃度；KsA E+ADEA的解離常數。 雙底物動力學方程的簡化： （1）在B0很高時，方程簡化為：  （2）在A0很高時

29、，方程簡化為： §5 酶的抑制作用許多物質與酶結合以后，影響了酶與底物的結合及酶的轉化數，從而改變了酶的活力。這些降低酶催化反應速度的物質稱抑制劑。很多抑制劑結構類似底物，但不被酶所催化或與底物相比反應速度極慢。 · 可逆抑制劑：以可逆方式與酶結合，可通過透析、直接稀釋、凝膠過濾等物理手段使酶活性恢復； · 不可逆抑制劑：不能用上述物理手段除去。 酶的抑制作用：a. 可逆抑制作用· 競爭性抑制 原理：競爭性抑制劑結構往往與正常底物非常相似，因而與底物競爭酶分子上的同一結合部位，與酶結合的抑制劑缺乏具有反應活性的基團或處于不恰當的部位，

30、使酶無法發(fā)揮催化功能，底物不能轉化為產物，上述任一情形下都會形成死端復合物(dead-end complex)。舉例：丙二酸(CO2-CH2CO2-)是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑：   丙二酸與琥珀酸結構非常相似，都具有兩個羧基，因而可以占據酶分子上底物的結合位點. 但由于丙二酸在兩個羧基之間只有一個碳原子，不會形成雙鍵，因而不會發(fā)生后續(xù)反應。競爭性抑制劑與底物結合部位相同：          競爭性抑制劑與底物結合部位不同：   &#

31、160;        · 反競爭性抑制 原理：反競爭性抑制劑(I)只與酶-底物復合物結合而不與自由酶結合。E + S D ES (DESI) " E + P反競爭性抑制示意圖：          ESI · 非競爭性抑制 原理：不論底物分子是否與酶結合，非競爭性抑制劑都能與酶分子結合，產生死端復合物。E (DEI) + S D ES (ESI) " E + PEI D ESI

32、非競爭性抑制示意圖：         · 混合型抑制 原理：若底物和抑制劑與酶的結合完全獨立，這種現象就稱為混合型抑制。E (DEI) + S D ES (DESI) " E + P· 部分抑制 原理：以上討論的都是形成死端絡合物的抑制，而這些復合物不會釋放產物。部分抑制就是指混合型抑制中ESI復合物也能釋放產物。ESI " E + P + I· 底物抑制 原理：在給定的酶濃度下，酶催化反應的速度隨底物濃度的增加而加快，至極限Vmax；有時，在極高的底物濃

33、度下，初速度仍低于最大值，有時認為測定系統(tǒng)與過量底物之間有相互作用，但在有些情況下的確發(fā)現高濃度的底物會抑制自身轉化為產物。· 產物抑制 產物對酶反應的抑制作用在生物體內較為常見，在細胞內，酶反應的產物雖然不斷地為另外的酶所作用，但S和P總是同時存在的；在單底物酶反應中，產物P對反應速度的影響相當于底物S的競爭性抑制對反應速度的影響。· 變構抑制 原理：抑制劑與酶結合，引起酶構象的改變，使底物結合部位的性質發(fā)生變化和改變了后續(xù)的催化活性，而不是指形成死端復合物. 例如：某一生物合成途徑表示為A " B " C " D " E &quo

34、t; F產物F作為這一合成途徑中幾個早期的酶(如A"B的酶)的變構抑制劑，對這一合成途徑加以反饋抑制，以避免產物過量堆積。b. 不可逆抑制作用原理：抑制劑與酶的必需基團以共價鍵連接，將必需基團進行了化學修飾，從而引起酶活性的喪失；被修飾的基團可以很多，多至酶蛋白中相似性質的基團都被修飾，也可專一地只修飾某一個必需基團。§6 pH值和溫度對酶作用的影響pH值對酶活性的影響主要是：· 使酶的空間結構破壞，引起酶活性喪失； · 影響酶活性部位催化基團的解離狀態(tài)，使底物不能分解為產物； · 影響酶活性部位結合基團的解離狀態(tài)，使其不能與底物結合；

35、83; 影響底物的解離狀態(tài)，使底物不能和酶結合，或結合后不能生成產物。 綜合上述種種原因，用酶活力對pH作圖往往有鐘罩形曲線，酶的作用存在一最適的pH值，它和酶的最穩(wěn)定pH值不一定相同。 溫度值對酶作用的影響：· 影響酶的穩(wěn)定程度，酶蛋白的熱變性； · 影響最大反應速度，即k2； · 影響酶和底物的結合，即影響k1或k-1 ； · 影響酶和抑制劑、激活劑或輔酶的結合； · 影響酶和底物分子中某些解離基團的pK值。  溫度對反應速度的影響：根據絕對反應速度理論， (1)式 式中k 反應速度常數； KB Boltzma

36、n常數； K 反應物與活化絡合物之間的平衡常數. 將熱力學關系 代入(1)式   (2)式 將(2)式兩邊取對數，再對T微分：     (3)式 將(3)式與Arrhenius經驗方程比較： 將式 改寫為：    用以上方法即可測定酶反應的活化能數值。§7 酶的作用機制酶的活性部位：              

37、;  酶和底物的誘導契合模式圖：           酶和底物的活性部位結合圖：          提出一個酶的作用機制，應確證以下幾個方面：· 底物轉變?yōu)楫a物每一步過程的中間絡合物及其基元反應次序； · 這些絡合物之間相互轉變的速度常數； · 絡合物的結構。 基元催化反應酸堿催化：· 酸(或堿)可以通過暫時提供(或接受)一個質

38、子以穩(wěn)定過渡態(tài)達到催化反應的目的，如醇與酮的異構化反應十分緩慢，若加入酸或堿催化劑，可使反應大大加快。 · 酶分子中氨基酸側鏈具有質子供體和受體的功能，所以推測酸堿催化在酶分子中起了重要作用是合理的。 基元催化反應共價催化：是通過催化劑與底物的共價鍵結合，形成過渡態(tài)來加速反應，如伯胺催化的乙酰乙酸脫羧過程：            共價催化具有親核、親電過程：（1）催化劑和底物進行親核反應形成共價鍵；（2）再通過同一催化劑進行親電催化，從反應中心吸收電子。已分離出大量

39、的共價鍵連接的酶-底物絡合物，證明酶具有共價催化機理?；呋磻饘匐x子催化：在所有已知的酶中，幾乎有三分之一的酶表現活性時需要存在金屬離子。根據金屬離子與蛋白質結合作用的大小，將需要金屬的酶分成兩大類：金屬酶，具有緊密結合的金屬離子，常見的過渡金屬離子為Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Co3+；金屬激活酶，金屬離子結合較松，通常是堿金屬和堿土金屬離子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+。金屬酶：· 極微量的Mo和Fe存在于氧化氮還原酶、固氮菌的活化氮絡合物中； · Fe是血紅蛋白的組分； · Co存在于維生素B12中。 在生物體中這些金屬離子含量極微。金

40、屬激活酶：· 堿金屬陽離子和酶以弱的結合形成絡合物，細胞內含量最多的K+能激活很多酶，特別是催化磷?；D移或消去反應的酶； · K+的作用基本上是和酶失活形式的負電荷基團結合，從而引起酶分子構象的變化，使之變?yōu)楦谢钚缘男问?；在某些情況下，K+也能促進底物的結合。 1970年Mildvan指出，在酶(E)、金屬離子(M)和底物(S)之間形成三元絡合物，可有以下幾種形式：（1）酶橋絡合物 ME S（2）底物橋絡合物 E S M（3）金屬橋絡合物 E M S 多元催化：· 酶的催化反應通常是幾個基元反應協同作用的結果； · 多元催化也是使酶反應加速的因素之一

41、。 酶作用機制的實驗探測：· 動力學研究 · 中間物探測 · X-射線晶體衍射 · 氨基酸側鏈化學修飾 · 定點突變 · 蛋白水解酶作用(酶的修飾) 這些方法互為補充，并應得到一致的結果。80年代初期，重組DNA技術迅速發(fā)展，如果能夠得到某一蛋白質密碼順序，具有合適的表達基因的載體，這一技術已可能將氨基酸導入該蛋白質特定的位點，典型操作過程見圖：定點突變的典型操作過程：             ·

42、 定點突變是評價酶分子的特定氨基酸重要性的非常有效的方法，圓二色性(circular dichroism)與分光光度技術可以快速確定酶的結構特征，在這一領域非常有用； · 定點突變首先要得到酶的基因，如果已知酶的X-射線結構，就可以很詳細地描述實驗結果。 舉例：枯草桿菌蛋白酶對核糖核酸酶的作用，它可將酶分子水解成兩部分，一部分稱S-肽(核糖核酸酶一級結構中最初由20個氨基酸組成)，另一部分稱為S-蛋白(由酶分子上其他104個殘基組成)； 將這兩部分分開，都沒有活力，若將兩者以等摩爾比例混合，酶完全恢復活性，推測兩者對于酶的活性中心都有貢獻，結合側鏈修飾方法證實了第12、41和119號

43、側鏈都為酶活性所必需。§8 應用酶學· 固定化酶（immobilized enzyme） · 酶在醫(yī)藥上的應用 · 酶法手性化合物的拆分 酶的固定化方法：載體結合法（共價結合法、離子結合法和物理吸附法）、交聯法、包埋法（網絡型和微囊型）。固定化酶的模式：                         

44、60; 游離的酶經固定化后所引起的酶性質的改變，其原因可能有：· 酶分子構象的改變 · 微環(huán)境的影響 · 底物在載體和溶液間存在著分配效應 · 擴散效應 藥用酶類：· 促進消化酶類 · 消炎酶類 · 與纖維蛋白溶解作用有關的酶類 · 抗腫瘤的酶 酶類藥物一覽表品 種來 源用 途胃蛋白酶胃粘膜助消化木瓜蛋白酶木瓜果汁抗炎，消化溶菌酶雞蛋卵蛋白抗炎，抗出血鏈激酶B-溶血性鏈球菌部分清潔，溶解血栓凝血酶牛血漿止血彈性蛋白酶胰臟降壓，降血脂無花果蛋白酶無花果汁液驅蟲劑青霉素酶蠟狀芽孢桿菌青霉素過敏癥細胞色素酶牛、

45、豬、馬心臟改善組織缺氧 診斷用酶：· 臨床生化的中心任務是研究并定量分析疾病時的生化改變。細胞外液(血漿、血清、尿、消化液及羊水等)，是最常用的材料。 · 大多數酶存在于活細胞內，但細胞受損時，酶則溢出并進入細胞外液，于是細胞外液酶活性增高。測定這些酶活性增高的程度、類型及持續(xù)時間，可為臨床醫(yī)生鑒別受損細胞，了解損傷程度，估價治療效果提供極為有用的資料。 酶法拆分手性化合物：· 化學方法難以拆分的外消旋體，可藉酶動力學拆分。主要是利用酶或微生物與消旋化合物中兩個對映體水解或還原速率不同，進行拆分以獲得兩個光學活性產物。 · 例如：D-苯基甘氨基

46、酸是制備抗菌類藥物的重要中間體，它由化學合成法制備得到外消旋體，利用氨肽酶成功地進行了拆分。 §9 酶法制備L-氨基酸L-氨基酸的主要用途：· ·        醫(yī)藥領域（氨基酸輸液、抗生素及多肽類藥物）· ·        食品添加劑領域（風味及營養(yǎng)強化劑、甜味劑）· ·        飼料添加劑領域（蛋氨酸、賴氨酸、色氨酸） 國內L-氨基酸生產狀況：· 生產規(guī)模小 · 生產工藝落后 · 生產品種不齊全 L-苯丙氨酸：· 學名（L-2-氨基-3-苯基丙酸） · 醫(yī)藥領域（人體必需的8種氨基酸之一） · 食品添加劑領域（用于合成阿司帕坦甜味劑） 酶法制備L-苯丙氨酸：苯丙酮酸 " L-苯丙氨酸（在轉氨酶作用下）肉桂酸 + NH3 " L-苯丙氨酸（在苯丙氨酸解氨酶作用下）酶法制備L-丙氨酸：· 學名（L-氨基丙酸，最甜的氨基酸） · 醫(yī)藥領域（輸