pcos胰島素抵抗受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機制的分析

1、可f釆用放射兔境法測定各實驗組血清空腹腕島素(fasting insulin,fin)的濃度二采用葡萄檐氧化酶法測定血漿空腹血糖印制咱抖asma guc圃， fp 出來肘 11惻(homeost 兇 s model ass nment , homa)模型計算腆 島索抵抗指數(shù)(homa-ir),以分析研究指標(biāo)與頂?shù)年P(guān)系.2、采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測ar 在三組卵巢組織、中的表達(dá)3、采用1 astern bjot技術(shù)檢測irs-j , irs-2及pi3k p8號亞單 位蛋臼在二組脂肪組織屮的表達(dá)，進(jìn)行半定量分靳!并采用免疫組織化學(xué)技 術(shù)檢測irs1及irs2在脂肪組織中的分布a4、應(yīng)用免度沉淀技

2、術(shù)及增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemilumines陽聯(lián) ecl)檢測三組脂肪組織中irs-1及irs-2蛋門質(zhì)的酶氨酸磷酸化程度, 并進(jìn)行半定量分析e5、采用rt陀r方法檢測三組脂肪組織pi-3激酶p85亞單位mrna 的 表達(dá)！并進(jìn)行半定量分析：采用免疫沉淀、薄層層析及v液閃計數(shù)方 法儉測pi3擻酶的活性，并進(jìn)行分析.結(jié)果1、pcos ir組患者血清l1i,l11!fsh及皇盲kl的水平均顯著商于阿 o非ir組與對照組(p< 0. 0曰！問s非ir組患者血清lh、lh/rsh及 率閣的水平亦顯著商于對照組(p< 0. 05)民郎ir組患者fin、h則ir 與pcos非

3、1r組及對照級相比明顯升高，差異具有顯著性cp< 0. 01), pcoir組血清町、擎酬的水平及l(fā)ii1fsh值與h pq a-ir呈顯著正相關(guān)(植i關(guān) 系數(shù)分別為<*0.51，陽也?5; r二0.62, p< 0. 01: .=0.46,嚴(yán)隊 05) 2、雄激素受體主要在細(xì)胞核表達(dá)在pcos ir組卵巢組織，其表達(dá) 強 度顯著高于pcos非1r組與對照組(均pv o. 0日，且與homa-ir呈顯 著正相關(guān)(.1072, pvo.o日,3, w stern blot檢測顯示 pcc、ir組與匹 兇非ir組及對照組相 比，irs-1蛋白表達(dá)量明顯下降（p< 0. 05

4、）,而rs2蛋白表達(dá)無顯著性 差異u ；阻。s ir組pi-3激酶p85亞單位蛋白質(zhì)的表達(dá)與問s非ir組及 對照組相比差異無顯著性意義（p0. 0 fi.兔疫紐化顯示1rs1、ir氣2 均表達(dá)于脂肪細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞膜！者蛋白表達(dá)量與western blol檢測 結(jié)呆致.4, 脂肪組織ir號i及1rs-2蛋白質(zhì)酶氨酸鍵酸化分析表陰陽s ir 紉二者的酗氨酸磷酸化程度與rcos非ir組及對照組栩比均顯著下降（p <0. 05）05, rt陀r結(jié)果顯示pcos ir組pi 3激酶p85亞單位耐陽的表達(dá)與rcos非ir組及對照組柑比差異無顯著性意義（p隊出）,而p1-3 激酶的活性則顯著下降（p

5、vo.o忡，與homair呈顯著負(fù)栩關(guān)（隊 69 嚴(yán)0.01）,> /結(jié)論1、ir是影響pcos患者血清性激素水平和卵巢組織 ar表達(dá)的重要因 素。2、曲cos ir患者中，其發(fā)生川的重縣委環(huán)節(jié)是由于族島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 溫路中irsj表達(dá)的下降、irsj及irs-2蛋白質(zhì)酷氨酸磷酸化程度降 低!從而減弱了腕島索信號a3、陽由ir患者pi-3激酶p85亞單位的轉(zhuǎn)錄及翻譯水孚均龍改變 放株洲該撤酶的活性降低是由子irs因素造成的，井邊一步影響了膜島素 信號通路中信號分子的生物學(xué)作用，導(dǎo)致凹的形成匚以上結(jié)論提示r夷島蒙受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)恩路中irs-1、1rs2及pi-3激 酶活性在pcos 1r的發(fā)

6、'機制中起著關(guān)鍵作用，是pcos病理牛理改變的重要機制深入研究院島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，將進(jìn)步閻明pc克的發(fā)病機制 并為臨床診斷放抬擰開拓了新的思路.本研究的創(chuàng)新性丄、首次研究了ah在pg因患者卵巢組凱中的表達(dá)與凹的關(guān)系，2首次從細(xì)胞卻分子水平茅挽研究?麟島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在 問os發(fā).ir的重要分子機制！提示irs-j , irs-21堅pi3激酶在ir 受體后缺陷中可能發(fā)揮重要的作用。3、首次研究了pcos脂耐組織irsj及irs-2的表羋工pi3擻酶 活 性的檢測，為以后的臨床應(yīng)用研究提供了新的方法丿t關(guān)鍵回 鄉(xiāng)囊卵巢綜合征，信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 腕島索抵抗 雄激素受 體： 兔疫組織化學(xué)

7、技術(shù) 兔疫印邊！ 腕島素受體底物1, 腕島素 受體底物2,免鬣會瑞強化學(xué)發(fā)光法酶氨酸磷酸化，薄層層 析確脂酸肌醇3激酶丿，molecular mechanism of post-insulin-receptor signal transduction molecule in polycystic ova hjj syndrome with insulin resistance.depn.rtment of obstetrics li.nd gynecology xiebe hospi 低 l，ton 囚 imedic 淚i college rh 皿油 ong univei'!iity

8、ofscience li.nd t,肘 uulogyyongli chudoctoral candidatedirectorabstractobjec倉ii ves to invest®附加 levels of s 陽m gonadal hormones and androgen rece 陰陽侃pression in ovari 盹 and explore 吐 le relation時np between this and insulin resistancoin polycystic ovary syndrome (fcos). to investigate the possib

9、le role of post-insulin-recel 歸r signal transduction molecule insulin receptor subs 國21 (irs-j), insuliiii/“叩 tor subs2(1rs-2), and phosphatidylinositol 3-ki n 配 q 1-3k) in molecular mechanism of insulin resist 町陽 this project w 副 supported by a grant fro m 也 enational natural science fow tltion ofc

10、hina (hb. 30100200)b 啞 ethodsj. srum址 es from patients with pcos with insulin resistan00 cn""l肘,pcos without insulin resis iti ce (n=10) and controls (0=15) w宅 re collected smiiin luteinizing honnone (lh), follicje stimulati 昭 honnonebs 町， testosterone (盯曬re measured by ch卩因 i luminescen 囚

11、囚馳，y, fasting insulin (fin) was measured by radioirmm 川l liassay. fasting plasma glucose opg) was measured by ox 也0()銷路y. insulin resistance index was calcuiated usi 鳴 homeostasis model assessment (hdma) 10 analyze the relationship between tii.esemarkers 缸咀 insulin rcsistanco囚。2. the immnnohistoche

12、居i stry teclu |u：quecoupled wi 由specific antibodiesfsome of飛h3s ust對 codeten寸 th'久passion of androgen wceptor in ovari the patients3. western blot j,切怕嗎"飛歸 used to d,味c! the levels of irs-1, irs-2 and pi-3 kinase p85 subl 咀 t in adipose tis引 sues of all three groups. the results were analyz

13、ed by rile sem岳, 岳陽 tive analysis and comparh寸 by 筑 atistical methods-the immunohistochemis wj n 內(nèi)冋國 ed 10 det 民 t the distrib 卩 ir of irs-1 and irs-2 in adipose tissues ofall ofpatients4 immun(習(xí) precipitation and enhanced chej td luminescent immurcoblotting tedmique were used to de 能"由，d, %e o

14、f irs-1 and irs-2 tyrosine phosphorylation. the results w 宮"缸udyzed by the semi-q 且 ntitative piialys 四 and compared by statistical methods.5. gene exp陀每 sion of pi-3 kinase 問 5 subunit was detected hy reverse transcription poly ma "use chain reaction (rt-pcr) me tliodinin adipose twl pmth

15、, re 理 ults were 缸 a lyzed by semi-quantitative 缸 13. .lysis. pi-3 kinase acti 呎 y m施acoayed by immu 皿jprecipitaliofl thin-layer chromatography and，皿 ntillationco "咆.the results were an 冉 zoo by statistical methodresults1. the levels of 回mm lh, l且 jfsh 缸 u1 t in pcos wi 仙 lout insnlin res!s 陽 c

16、e were s!gr 曲cantly higher than those of con m 1 groups (p < 0.0 日:、0 j els of serum lh 丄h1fsh and t in pcos with insulin rcoislance were噸 nific頓 tly higher than those ofpcos without insulin resistance (p < 0.0 si fin and h0ma-1r in pcos with insulin resistance were substanti晦 1 ty higher irnm

17、 吐 lose in pcos wit 抽 ul insulin resistan 民 andcon 位 01 groups(p< 0.01) the levels of serum lh, t and l11ifsh were positively correlated wi 也 h0mair in pcos wi rh insulin resistance (r二0.51,pv 0.05戶 0.62, p <0.01:尸0.46, p<0.05).2. th 比 expre冶均 ion of androgen receptor 飛".as mainly loca

18、lized 10 the cell nuclain ovaries. the expression in pcos 日寸.thi pqlin resistance wassignificantly higher than it 1111 in both pcos wi 也out insulin resi!陽ice andh，index (in pcos wi 由 ir) (嚴(yán) 0.72 , p<0.05)3. western blot showed 也過 irs-i e:ep"組副 on in pcos y.ith insulin r pqistan 闊.nils signif

19、icant ly decremed comp 缸-°d 10 也al of both pcos wi rk lout insulin re啕玩 ance and °°ntrol groups (p < 0-0 白， no notable difference existed in irs-2 ex陽町 th,臼陽 no significant difference in the proteinexpression of pi-3 kinase p85 sublulit in pcos with insulin resistance companng 飛機曲

20、pcos without insulin resistance and control groups(p > 0.05) immunohiscochemistry results shro 飛 d 世 llll irs-1 and trs-2 were m 創(chuàng)， localized in cytoplasm and ce! 1 membrane 企 actions of adipose tissut 叉1" results were cons 冋歸twith 磯'estem blot data4. the tyrosine phosphor|lation analysi

21、s oflrs-1 and irs-2 showed 往冋 both were significantly decre 揭 ed in pcos wi 也 inslllin resistance c tothat ofpcos wi jfn. ollt insulin resistar 比e and control grollps (p <0.05)5. th 町 e was no slgnj cant differalce m 也 e gene expression of pi-3 kina 回 p85 subllnit in pcos wi 也 insulin resistan h

22、°°mpared 10 pcos 飛機，hll insulin re罵 istance and control groups(p) 0.0 口 ;howev rr. pi-3 kin®eactivity was signific凍ntlydecreased (p<o.oi) andnegatively correlated 、?h homa-ir cu0.69,p< 0.01)coudllslon$1 these data suggest 世回 insulin resisla nlce may be 吐 u： lmpor 臼it factoi whic

23、h 缸ffects the sen 皿 levels of gonadal hormones and androgen rec 卩卩, expression in ovaries ofpcos2. the important hnkcoperipheral insulin resistanco cf pcos patients was evidenced by decreased irs-1 pre 版mi口 pression and de撫配部 ed tyrosine phos肘町 ation oflrs-j and irs-2 in the insulin signal transduct

24、ion pathway. all ofthe 民 will viriken the activation signal.3. protein 臼id gene expressiob of pi-3 kinase p8s sllbunit v 罰< unalterated. however ? 肝噸 uentto 由 weaker signal caused by irs and pi- 3 kinasecotivity ,they will affect the insulin 劍 gnaling pathway leading to insulin resistancethe conc

25、lusions above suggest that irs-1 and jrs-2 vaj回hon,as vel 1 as pi-3 kinase activity,all play importa：r略 roles in the insulin signal transductionpathway. this is likely impor 兇 it mechanism (odiogconophy 目。華屮科技人學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院2°°o級憾士學(xué)位論文logical chllnges in pcos and may provide new inform 兇"祖ddi

26、rection forscientific research and clinical therapy ofpcosjn, 陰陽 elude the poi 礎(chǔ)。f creation as folio 叫時lfor title first time, we detected androgen recc；%:or expresslon m ov h j and supposed a possible link to insulin resista 且.ce in pcos patier 也，2. for 也 e first time，we systematically inv w tigated

27、 the target molecular mechanism fol insulin resistanc尬。陽回 m唱 in pcos at the cellular andmol ocular level. we suirjggest that irs-1, irs-2 w d pi-3 kinase may play important roles in post-rr此or malfuntion characteristic ofinsulin resistance3. f時也le first timewe investigated 吐le expression of irs-1，ir

28、s-2 and pi-3 kinase activity in adipose tissue of pcos. this could provide a new m耐 lod for 時幣 in cinical researchky、(vrds polycystic ov窗丫syndromeocos) signal tfflnsduction insulin resistance (1r)， ar 由 陰 f日 eptor (ar), tmmunohi 陽hemistry, w 四町n blot. insulin rccc(i:or 5u3 ffl.te-1 (irs-1),insulin r

29、eceptor 5ubstrate.2 f(irs-2), imm 陽precipl 回ion, ecl, tyrosine phosphorylation, thin.laye! ohro=cography phos(p-hatidylino 憂。1-3 kinasepcos膜島素抵抗受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機制的研究冃u apcos 是牛育年齡婦女常見的極為復(fù)雜的內(nèi)分泌疾病，典型臨床特征 有 月經(jīng)紊亂、慢性無排卵及不孕、雙側(cè)卵巢蠕大、高雄激素血癥 chyperandrogenl簡嘰ha). lh過度分泌等*但現(xiàn)代觀點認(rèn)為該綜合征.i/e存 在顯著的糖代謝異常，主要表現(xiàn)為腕島素抵抗 onsulin

30、 resistanco , 1r1及高腕島素血癥(hyperinsulinisrfr, hl)因此，pcos盟者發(fā)展為1 卡脫島素依賴性糖尿禍及心血管疾病的危險性較高，而r發(fā)俯年齡偏早。迄 今為止!其發(fā)病機市仍不清楚，由于該強病具有復(fù)雜的?；卣鱥臨床表現(xiàn)及發(fā)病機理！因而成為婦科內(nèi)分泌領(lǐng)模的研究熱點與難點多年來認(rèn) 為 民s患者的生殖功能異常是重要的臨床特征和主要的病理生理摹礎(chǔ)！肉此 有關(guān)發(fā)病機理的研究主要集中在性膝輸及卵巢局部，然而根據(jù)這些王軍 論設(shè) 計的臨床治療方案盡管有一定的短期療效但不能從根本土泊療 陀 oso由于對其發(fā)病機理認(rèn)識的局限性，臨床上也直尤法找到更有效的 治療方法，近年來！在

31、pcos的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)許多臨床和實驗現(xiàn)象單用性 腺軸功能異常無法解揮 如大多數(shù)陀os患者存在街代即異常【主 要 表現(xiàn)為ir及hi研究報邊pcos患者糖尿俯發(fā)生率較正驚人高7倍！發(fā) 捕時間也提前近30年不同種族崽者臨床表現(xiàn)有差異！但ir表現(xiàn)卻是共同的例單用山或i!cg 能誘導(dǎo)動物多囊卵巢，伺并不出現(xiàn) pcos 系列的生化表現(xiàn)加用膝島素后則可誘導(dǎo)出典型的 pcos動物模型”a 用腕島素蹣效刺可改善 pcos特征性的高雄激素血癥及高黃體體成素血 ?在促進(jìn)卵泡成熟、排卵及懷孕，而抗雄激索治療并不能緩解irshil1, jo 基j注些現(xiàn)象！國內(nèi)外學(xué)者對陰 囚的本質(zhì)及其發(fā)病機礎(chǔ)逐步有了新的認(rèn) 識.越來

32、越多的學(xué)者認(rèn)為ir及hi不僅是陀os的另 重要生化特征！ 而且可能是陀發(fā)生的主要病理生理基礎(chǔ)及重要的發(fā)病原因口叫因此ir 成為研究陀囚發(fā)病機制的熱點腕島素敏感的經(jīng)典靶器官是肝臟、骨由口肌及脂肪。牛理狀態(tài)下!殷島 素與受體的a亞基結(jié)合后誘發(fā)卩亞基的冒商氨酸殘基自身磷酸化，并激活 腕島素受體的冒商氨酸激酶，使腕島素受體底物的多個酷氨酸殘基磷酸化后者 再與含有sh2 (src holllology 2)結(jié)構(gòu)域利多種蛋白綜合調(diào)節(jié)細(xì)胞的 生長、 鄉(xiāng)抖憶和代潮，所謂ir是指機體對股島素敏感性降低，使腕島素作用 減弱，即正常劑量的腕島蒙產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的種狀態(tài)。tr泡發(fā)生機理可分為三類 腕島索受體前因

33、索包括:c!基因突變產(chǎn)生結(jié)構(gòu)異常的腕島索！使其生物活性下降或消失內(nèi)源性或外源性腕島素抗體形成、r夷島素受體抗體 形成，干擾麟島素與受體的正常結(jié)合腕島素降解加速z藥物潑尼松、苯 妥因納)、 tnp- 及戰(zhàn)島素描抗劑過多等.受體缺陷 包循受體功能與結(jié)構(gòu)的異常前者如腕島素受體數(shù)日減少 以反親和力下降，導(dǎo)致鵬島索與其受體結(jié)合降低后者多為受體基因突變 斂受體功能喪失或部分喪失。受體后缺陷指族島索與受體結(jié)合后信號向細(xì)胞內(nèi)傳邊所引起的 系列陽謝過程，包括信號傳遞、放大、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)、磷酸化與脫磷酸化以及酶但級聯(lián)反應(yīng)等諸多效隘的異常.近年來!囚的發(fā)病機制尤其是其分子靶點及細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制受劊極 大

34、關(guān)注!但在陀os jr方面的研究國外才剛用起步，國內(nèi)尚屬空白?；A(chǔ)陽汗 究表明z在腕島蒙受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，irs介導(dǎo)的pi3途徑起關(guān)鍵作用 陽剛正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主耍通過irs與腕島蒙受體的結(jié)合并發(fā)生酶氨酸磷酸化，進(jìn)訃 激活pi-3激酶，通過 系列的作用便葡萄糖載體 蛋白發(fā)揮山細(xì)胞外問細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運葡萄糖的功能 岡此ire的表達(dá)缺乏或磷酸 化障礙均可導(dǎo)致受體后信號轉(zhuǎn)尋異常引起ir文獻(xiàn)報道pcos tr存在明顯 的1rs突變，因此推斷irs在內(nèi)os ir的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用”1 其 他!如葡萄街載體蛋白糖原合成酶、過氧化物酶增殖物撤活受體等的研 究亦有栩關(guān)報道腕島素與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合后，其生

35、物學(xué)效應(yīng)思過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而實現(xiàn)為便予理解和敘述，町大致分為以下兒個層次川（1）!夷島素受體的 活化；（2）膝島蒙受體底物口 rs）的德政化；（3） irs與合出血區(qū)段蛋白 質(zhì)的連接（4）蛋白撒酶、磺酸酶級聯(lián)反應(yīng)ccascade） ; （5）蔭島素的牛 物學(xué)效應(yīng)見圖示入因此，當(dāng)殷島素信導(dǎo)與細(xì)胞表面的受你結(jié)合到作用 于接后把分子的過程中！任何個環(huán)節(jié)受損，皆有可能引起ir.關(guān)于與麟島素信號傳遞的起始步驟相關(guān)聯(lián)的問題在近兒年有了很大 發(fā)展！最重要的是：陋的發(fā)現(xiàn) oi1sirs-2 , irs-3 , 1陽-的，該家 族成員是腕島素受體育路氨酸澈酶的底物也是腕島素信號傳遞中介。目前 認(rèn) 為irs-i是足夷島

36、素受體較好的底物!含杏多個酶氨酸磷酸化位點，這 些位點接受剌激發(fā)生酶氨酸磷酸化后非共價結(jié)合到情異的細(xì)胞內(nèi)蛋口質(zhì) 所以irs-i可視為細(xì)胞內(nèi)配體或載體（docking）蛋臼而傳遞信號，另 外，關(guān)于irs-2在院島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究也遠(yuǎn)漸培多'"復(fù)合保圖示腕島東信號轉(zhuǎn)導(dǎo)示意簡圖由于腕島素信號傳磁過程中插入細(xì)胞效應(yīng)體系的關(guān)鍵位點是發(fā)生陪氨 酸確酸化的irs ,它與pi3澈酶結(jié)合使該激酶的催化活性被激活，所 以 腕島索受體、irs-政irs-2和pi-3激酶是代表殷島素作用最早期的三 個步驟中重要的信號分子pi3激酶由 個分子最為85 kda的調(diào)節(jié)亞萃h8曰和個110 kda的催化

37、亞基組成(p11o),前者與ir結(jié)合后 者催 化磷脂西班肌醇的磷酸化！表現(xiàn)為 pi-3激酶的催化活性.存戰(zhàn)島素刺激f, irs與p85結(jié)合i解除抑制作用p110即發(fā)?；罨虼耍琾i-3激 酶的活性也成為腳島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究綿點盡管irj：ij陀傭的相關(guān)性及其豆在pcos發(fā)病機制屮的重要作用己逐步 被認(rèn)識，但其確切的分子機理仍不十分清楚目前的研究認(rèn)為問os ir 中 院島親受4年的表達(dá)反磷酸化可能并無異常，脫島素與受體的綜合也無障 礙!閃此推測r不是岀于受體前缺陷引起，而發(fā)生的可能原肉在于麟島素受休 后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙叭但對其更深入的分子機型目前尚不清楚那么，通過對腕島素 受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)退路的研

38、究，觀察信號分子的變化，有叫能深入地攤討 pcos ir發(fā)牛的分子機理，為臨床診斷和治療提供確鑿的理論 依據(jù)另外p有研究發(fā)現(xiàn)pco的ha與iu有密切的關(guān)系!而且ar在rcos 卵巢組織中的表達(dá)與ir的關(guān)系也有待牙進(jìn) 步的研究.育關(guān)麟島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)研究己經(jīng)取得了一定的道 j展但在此os tr發(fā)生機理方面國外才剛月起步，目前僅局限于 些相關(guān)蛋白質(zhì)表 達(dá)水平的檢測上其確切的環(huán)節(jié)&棚關(guān)的研究國內(nèi)外報道甚少，為此我們試國基 于已有的基礎(chǔ)研究結(jié)果所提供的寶貴線索和依據(jù)，綜合臨床資料，對陀咽川受 休后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙的分子機理進(jìn)行初步探討.總之，研究院島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制有十分重要的意

39、義其可以對 發(fā)病機常有更深入的認(rèn)識，其二則可以對臨床診斷及治療技術(shù)提供新的靶位， 例如可以改變旗島索敏感性藥物的作用位點或方式等a那么卩通過本課題的研究，將試圖從細(xì)胞和分子水平，探討 pcos ir發(fā)生的分子 機理及原島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙的可能部位，為該病的臨床治療和研究 提供新的思路和方法，參考文獻(xiàn)cibula 0, skrha j, hill m,倉ual. predi<./tion of insulin sensiti川 ty fen9ocnrk)ie women wi 也 polycyst 比"缸y syndrome. j clinmetab 2002, 87(12)

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44、. c! in endocrino 1 (oxt) 2001,55(2):191-1999 gerald b shulman r. cellul mechanisms of insuhn resistance. j cin invest 2000,106(2):171-17610 kubota n, tobe k, terauchi、z，et al disrupl(» of insulin re伺機宀 substrate 2 causes type 2 diabetes because of 1 iver insulin resist 副ice and lack of compens

45、atory beta-cell hyperpl raia. d 脅由 s 20c 磯 49 (11):188c 機 188911 mkade 唱 sa lautier c. maeari f, et al role ofallelic varia fl也 gly972arg of irs-1 and glyl057asp of irs-2 in moderate-1o-severe i 兇 ulin re 腦囚cf women with poj 歸 ystic ov wt syndrome. diabe 陽 2001, 50(9):2164 卡216812陳家倫族島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及臨床意義上)國外

46、醫(yī)學(xué)內(nèi)分洶學(xué)分冊2002, 22(1), 1-413 jeffrey ep, saltiel a.si俱aling pa由ways in insulin action:molecul 缸 t 創(chuàng)gets of insulin resistance. j clin invest 2 °°, 1 鬧。如 165-169第一部分pcos的臨床資料分析多囊卵巢綜合征。cos）是育齡婦女最常見的生痕肉分泌紊而性疾惰， 發(fā)病率占牛育期婦女的5% 2h5 , cj匯，其主要特征為4、排到陽、商雄激素血癥 cjjyporandrogenis_iiil, iii）商展島索血癥 （hyperi

47、nsulinism. hi） 肥 胖等是種表現(xiàn)復(fù)雜的綜合征。大量研究表明陀 s存在ir.提水可 能為其重要的發(fā)病機理!但有關(guān)血惰性激素尤其是雄激索水平及其受體與的關(guān)系研究其少。本研究通過測定素陽的、靠朋、算homair:觀察receptor.ar)pcos ir和非ii崽者血清黃體生成素（lh）促卵泡空腹腕島素 （ftn） 及血漿空腹血糖的濃度，并計pcos tr和非r患者卵巢組織中雄激素受體（adrogen的表達(dá)及分布在此基礎(chǔ)上分析所得到的臨床資料，探討血清性激索水平及卵巢組扭中ar的表達(dá)與h劇a-ir的關(guān)系!為進(jìn)步探討性 激素尤其是雄擻隸水平及其受體與pcos ir的相豆關(guān)系以及后續(xù)的關(guān)于

48、艘 島素受休后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的實驗奠定基礎(chǔ)材料與方法一試劑與儀器z(-)主要到驗儀器明695型智能放兔v測量儀ace咽化學(xué)發(fā)光測量儀cx,血糖測量儀hpias病理圖象分析系統(tǒng)tgl -16b實驗陰離心在elt-w-85低溫冰箱p1120:j-b電子天平(二)主要試劑lii、fsh和擎蚓也學(xué)發(fā)光試劑盒 膜島素放射兔瘦分析試劑盆 血糖試劑盒鼠抗人雄激素受 體單克隆抗體s-p試劑盒 0 n 顯色試劑盒二、病例資料匕梅檢福光電儀器有限公司 美罔貝克曼公司 美國貝克曼公司 同濟(jì)千屏影像公司 上海安亭科學(xué)儀器廠 美國cryostar公司梅特勒托利多儀器仁海)有限公司美國貝克曼公司 北京北方生物技術(shù)研究所美

49、國randox公司福州邊新 生物技術(shù)公司美國 zeymed公司武漢博士德 生物公司選擇自2001年9月2例2年12月診斷為町陽的患者29例，平均 年齡27 土 5歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)飛臨床表現(xiàn) 月經(jīng)紊亂 邙u經(jīng)、月經(jīng)稀 發(fā)或功血、多毛、瘦瘡、肥胖、不孕等。血性激素水平i黃體生成索(lh) 與促卵泡素(fst 1)比值2刊或者雄激素水平 高:并排除垂體、腎上腺 和甲狀盼等內(nèi)分泌陽腐1 e超檢查至少側(cè)卵巢有10個以上直徑2- 8的卵泡，卵巢萃質(zhì)罔聲增強s卵巢的病理表現(xiàn)于術(shù)屮及術(shù)后證實。 所有同os病例巾有16例施行卵巢模形切除術(shù).13例施行股股鏡卵巢打 孔術(shù)。三、實驗分組選擇國單純子宮肌瘤施行子宮切除術(shù)的

50、病人15例為對陽、織，血清性 激素、空腹血糖1覽腕島素檢查均在正常泡圍，平均年齡28 土 3歲，與 pcos紐年齡匹配.腕島素抵抗診斷標(biāo)準(zhǔn)參照內(nèi)科疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)）（第1版） 陽，因高殷島索血癥是腕島索抵抗的定性指標(biāo)!所以本實驗r夷島索抵抗 的篩選指標(biāo)為空腹血麟島素>20 j.1.iu/叫阮1, >j以此為實驗分組依據(jù)， 篩 選19例設(shè)為pcos 1r組10例為pcos非:er組所有對彖排除糖尿病家族史及其他內(nèi)分泌疾病.3個月內(nèi)丑激素類 藥物應(yīng)用史，無心、肝腎疾病史等.四、標(biāo)本收集所有受試者于月經(jīng)干凈后5 7天（閉經(jīng)者同期不限，經(jīng)b超檢查沒有 優(yōu)勢卵袍比采集空腹靜脈血4時，2000 i

51、-pn:離心15mi幾分離血清后 20 °c保存待涮e術(shù)中留取少量新鮮卵巢組織約1. 5g）,以10%福爾馬林液固定6 12h , 常規(guī)脫水!石蠟包埋，切片（5 |1時，60c烘r30min. 10例陀os tr 7吃 6例pfos非ir患者卵巢組織標(biāo)木均為卵巢模'切除術(shù)中留取8例正常卵 巢 組織切片白協(xié)和醫(yī)院病理科提供，五、實驗方法實驗操作中各項質(zhì)控均符合實驗室標(biāo)準(zhǔn)e（）應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定血清促黃體生成素（lh）、促卵 泡素cfsh）、阜酣（1'）水平。由美國貝克曼公司acess化學(xué)發(fā)光測量儀全自動操作井計算樣品含so二）l.1標(biāo)記放射免疫分析法測定空腹血漏

52、腕島素（ftn）i、技操作步驟加入各種試'j單位）.1 lj,其順序如下;試制/管mn 0 ”曹標(biāo)準(zhǔn)樣品緩沖掖m1g)/標(biāo)準(zhǔn)品/100/樣品/100抗體/1g)10c100習(xí)，3tc 血胃 jornin標(biāo)記物100祖勻,10037 c榻育2h 00100分離剖500m50c印j據(jù)勻，室溫臟置15-20mi且2、2, ooog離心15min,棄上請，涮定各管30秒計數(shù)，3計算"0”管計數(shù)與各標(biāo)準(zhǔn)管或樣品管計數(shù)的比值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計算各樣品含量.（三葡萄糖氧化酶法測定血漿葡萄糖含暈血漿葡萄糖氧化酶法2h內(nèi)測定空腹血糖?？? 1、操作步驟單位，ml）加入物測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血

53、漿葡甜精標(biāo)準(zhǔn)00,同用被0.02蒸館水0.022、美韻備磁旬町、血黯測翻艮測定井褂負(fù)結(jié)果自3 * °（四穩(wěn)態(tài)模型（homeostasis model assessment , h 佩。法評價族 島素抵抗的程度陽用也漿空腹血黯（fpg）和宇膽戰(zhàn)島素（ptn）計算腕島素抵抗指數(shù)， 分析腕島素抵抗的程度hc以-lrooptnxfpg/225叫由于該指數(shù)呈偏態(tài)in 分布，故馭其自然對數(shù)（ln）進(jìn)行統(tǒng)討學(xué)分析.經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化的liomair與 用于如斷ir ii:' 金標(biāo)準(zhǔn)正常血糖鉗夾實驗技術(shù)所得的腕島素抵抗指數(shù)顯著 相關(guān)，優(yōu)?其它簡單測試方法，且可重復(fù)性商，尤其適用于與基礎(chǔ)值的對照比較以

54、 及不同體重指數(shù)等的人群研究川（五）兔疫組織化學(xué)技術(shù)檢測且在卵巢組織中的表達(dá) 舷試劑盒（s-p法說明書操作a1、石蠟切片館m）常規(guī)脫蠟至水！2、孤f4孵創(chuàng)omin,封閉內(nèi)源牡（j,酶！4、蒸館水洲就后pbs漫泡5mln 微波修復(fù)抗原， 采用掏橡酸鹽緩忡 液（ph隊的作抗原修復(fù)液，9?（:, lomin4、滴加10（甬正常山羊血清（pbs稀釋），室溫孵育lomin 傾去，勿 洗。5、精力日1 田稀釋的 抗鼠抗人ar抗體），37（:孵育2h,pbs沖 洗5minx3次6、滴力l:20c稀馨的牛物素標(biāo)記二抗山羊抗小鼠 igg） ,37'c孵育2h. pbs沖洗5minx3汝7 滴伽 hrp標(biāo)

55、記鏈霉卵臼素,37（:孵育lh, pbs神就5minx3次38、dab顯氈，顯微鏡下觀察！水；中洗，終止顯色9、蘇木素復(fù)雜!常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片.陰性對照以pbs取代ar抗體。先鍵下觀察結(jié)果。結(jié)果判定陽性為細(xì)胞核山現(xiàn)棕黃色顆粒，表明 ar 蛋白的表達(dá).周全自2我病理圖 像分析儀進(jìn)行分布，每個標(biāo)本隨機，jl!j馭不重建的10個視野i選擇每張切片 的空白處選行技ie 并調(diào)鞍灰度然后對陽性物質(zhì)進(jìn)行二值化處理和圖像 修，“，由計算機系統(tǒng)自動計算出光密度(optical densit, 0d)值丨以正 常 組平均值為參照邊行比較。六統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用 依士，)表示，采用spssio.o統(tǒng)計軟件

56、，應(yīng)用單因素 方 差分析及直線相關(guān)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，按雙側(cè)。而檢驗水準(zhǔn)，p<005 認(rèn)為有顯著性差異.一、pcos 1r組、配os非1r組與對照組血清性激素水平的比較pcos ir居者血清lh丄h/fsh及率勇冃的水平與對照組相比均明報升高, 差異具有極顯著性意義(pv隊01)陀os i1患者血消lh、lh/fsh及擎 酣的水平均高于pcos非ir組，差異具有顯著性意義(p< o. 05); pcos 非ir組血清lh、lh/f劃及率嗣的水平亦均商于對照組，差異具有顯著性 意義嚴(yán)o. 05);三組z間血精fsh水平的比較無顯著性差異(p>o. 05).見表1-,圖-1)表11各

57、實驗組血清性激素水平的比較(王土?xí)r分綱例數(shù)lh(ru/lle;h(lu/l)uu,百t(nmo 1 !ijpcos ir 組15.8± 2.8*< 1 土 lv2.8：l：0 曠u±o gf"非r扭w13.9 土 1. 9m6：1 ： 1.12.2 土 o.4m3.6 ± 0.4"對照組j<7.2 士, ”<.8 ±l<1.3 士口 3.9: t0且tb串-"姐，,囚非組及時照組f< 0. 05 9串串f淪非姐琦陽組p,o.0520【3t弓11署峙121:)454z0口 prrs 1日組u (t1/1th (11/lliu 于精 1j圖各實驗組血清性激素水平的比較1* pcos ir 組 rs pcos非 ir 組及對照組 p<0.05:* pcos非 ir 組 ys 對照組 p< 0.05二、pcos ir組、pcos非ir組與對照組fpg、fin及homa-ir的比較pcos ir組與pcos非ir組及對照組相比，其fin、homa-ir明顯升 高，差