試驗二性染色質(zhì)觀察實用教案

1、一、實驗(shyn)目的： 三、實驗(shyn)材料：四、操作步驟：五、結(jié)果(ji gu)分析：二、實驗原理：第1頁/共22頁第一頁，共22頁。一、實驗(shyn)目的： 通過實驗初步掌握(zhngw)觀察與鑒別X-染色質(zhì)的簡易方法，識別其形態(tài)特征及所在部位，為進一步研究人體染色體的畸變與疾病，提供參考條件。 簡述(jin sh)用以說明性染色質(zhì)而制備人體口腔粘膜鱗狀上皮細胞裝片的步驟。 說明人體細胞核中X染色體數(shù)目和性染色質(zhì)體數(shù)目的關(guān)系。第2頁/共22頁第二頁，共22頁。二、實驗(shyn)原理： 巴爾和伯特倫（1949）注意到一個深著色小體，并且不是和核仁就是跟核膜接近(jijn)，絕大部

2、分存在于雌貓的神經(jīng)細胞和中，這種小體幾乎不會出現(xiàn)在雄貓類似的細胞中。進一步研究表明性的二態(tài)現(xiàn)象出現(xiàn)在像有袋動物，偶蹄目動物，翼手目，食肉動物和靈長目這些有代表性的動物的大多數(shù)細胞中。然而，一些兔形動物，性別差異只在很少一些組織中觀察得到。 這個染色(rns)質(zhì)體，是雌性細胞區(qū)別于雄性細胞的標志?，F(xiàn)在它通常叫做性染色(rns)質(zhì)或叫做巴爾氏小體。除神經(jīng)細胞外的其他細胞中的巴氏小體（直徑為1m）具有典型的平凸的外形，靠近于核膜內(nèi)側(cè)處。細胞化學上看，性染色(rns)質(zhì)的福爾根反應(yīng)陽性并具有用甲基綠派若寧染色(rns)很深，表示有DNA的存在。第3頁/共22頁第三頁，共22頁。 相當多的證據(jù)已經(jīng)證明性

3、染色質(zhì)是沒有活性的X染色體。正常的男性，只有一個X染色體，沒有性染色質(zhì)（見圖2.1 上）。正常女性，擁有2個X染色體，每個細胞核有一個染色質(zhì)小體（圖2.1下），但是一個雌性三倍體的X染色體有兩個(lin )性染色質(zhì)體（圖2.2）。幾乎沒有雌性的動物的4個X染色體的每個核內(nèi)有3個巴氏小體。 二、實驗(shyn)原理： Barr小體數(shù) = 細胞(xbo)內(nèi)X染色體數(shù) 1 Barr小體特征及位置：它是處于失活狀態(tài)的X染色體，一般位于細胞核膜內(nèi)側(cè)邊緣的一個深染區(qū)（較細胞核要?。?，形狀多樣。第4頁/共22頁第四頁，共22頁。 圖2.1圖2.2第5頁/共22頁第五頁，共22頁。二、實驗(shyn)原理：第

4、6頁/共22頁第六頁，共22頁。 由于兩個X染色體中的一個失活(小資料：三色貓)，性染色質(zhì)小體可以在間期細胞核中見到。這些活包括(boku)特殊X染色體的異質(zhì)化。利用放射性標記技術(shù)，Morishima 等（1962）發(fā)現(xiàn)了無活性的X染色體，像其他的異質(zhì)染色體，他們在細胞核中較其他染色體晚些復(fù)制。另外，這些晚復(fù)制X特點是位于核的邊緣，性染色質(zhì)小體大多在這里被觀察到。總的來說，所有的細胞都包含著一個X染色體。帶有遺傳上具有活性的染色質(zhì)叫做常染色質(zhì)，所有額外的X染色體成為異染色質(zhì)的性染色質(zhì)體。 證明人的口腔粘膜鱗狀上皮細胞存在性染色質(zhì)的方法是Ludwing和Klinger（1958）發(fā)明(fmng)

5、的，本實驗使用1960年經(jīng)Reynolds修改的方法。二、實驗(shyn)原理：第7頁/共22頁第七頁，共22頁。三色(sn s)貓 三毛貓，又稱三色貓，指黑色、橘色與白色參雜在身上(shn shng)的貓，亦稱為玳瑁色。 成因：因決定(judng)黑色和橘色的基因是位于X染色體上(白色基因在體染色體上)， 若是貓的基因在分化的時候隨機去活性化， 可能毛色細胞內(nèi)黑色基因被去活性而表現(xiàn)出橘色， 反之則呈現(xiàn)黑色， 因此絕大部分三毛貓都是雌性。在少數(shù)的例子里， 因多出一個X染色體(en:Klinefelters syndrome)或嵌合體的情況會出現(xiàn)三色公貓。在日本因為雄性三色貓的稀少的緣故，而被視

6、為一種幸運的象征。二、實驗原理：三毛貓組圖第8頁/共22頁第八頁，共22頁。三毛(sn mo)貓三毛(sn mo)貓第9頁/共22頁第九頁，共22頁。三色公貓(n mo)（上）土耳其三色貓（左）第10頁/共22頁第十頁，共22頁。三、實驗(shyn)材料：帶有油鏡的顯微鏡壓舌板1%水溶性硫槿染液酒精(jijng)（濃度：50%，70%，95%，100%）二甲苯5或6當量(dngling)（N）鹽酸（HCl）于滴瓶中香柏油載玻片蓋玻片廣口瓶或平皿鑷子第11頁/共22頁第十一頁，共22頁。四、操作步驟：1. 毛發(fā)(mof)根部細胞的觀察: 拔取一根帶有毛根的頭發(fā)，自基部截取20m左右置載玻片上，小

7、心剔下毛囊細胞(注意千萬不要觸及毛發(fā)干),拔去毛發(fā)干,將細胞團塊散開,加一滴改良酚紅染液，覆以蓋片，在酒精燈上輕微加熱(ji r)后，靜置15分鐘，隔一片吸水紙用手指輕度加壓后鏡檢。第12頁/共22頁第十二頁，共22頁。四、操作步驟： 2. 口腔粘膜細胞(xbo)觀察: 要想制備一個適合的口腔粘膜涂片將會遇到兩個問題。如果你的裝片不是絕對的干凈，在染色的環(huán)節(jié)你將會失去上皮細胞。所以，玻片必須用去垢劑洗，而且在流水中沖洗，然后最終用70%的酒精沖洗，用火烤干他們。第二個問題較難克服，就是上皮細胞能被口腔細菌所污染(wrn)。細菌特別麻煩，因為他們?nèi)菀妆涣蜷热芤喝旧⑶液托匀旧|(zhì)混淆。如果碰巧他們

8、會遮蓋在上皮細胞核上面，因此，細胞提供者需要嚴格地用水龍頭的水漱口，以便去掉松動的上皮細胞和細菌。這樣的漱口應(yīng)該重復(fù)兩三次才能達到最好效果。第13頁/共22頁第十三頁，共22頁。方案(fng n)1: 用清潔滅菌的載片或適當?shù)墓纹瑥呐钥谇粌蓚?cè)頰部刮取上皮粘膜細胞，在原位刮取2-3次，分別涂抹在干凈載片上，每次可涂1-3片，涂抹范圍約1-2張蓋片大小。待稍干后，滴加1-2滴改良酚紅，在室溫下染色1-5分鐘，勿使干燥(gnzo)，然后再加蓋片復(fù)以吸水紙，用手指輕度加壓后進行鏡檢。 涂片后如不立即檢查，應(yīng)在稍干時立即放入95%酒精中固定30分鐘以上（也可達1-2天），取出干后編號，放置冰箱(bn

9、gxing)內(nèi)保存。四、操作步驟： 2. 口腔粘膜細胞觀察: 第14頁/共22頁第十四頁，共22頁。方案(fng n)2: 用清潔滅菌的載片或適當?shù)墓纹?，從女性口腔兩?cè)頰部刮取上皮粘膜細胞，在原位刮取2-3次，分別涂抹在干凈載片上，每次可涂1-3片，涂抹范圍約1-2張蓋片大小。待稍干后， 用95%乙醇浸泡每片玻片2分鐘，然后用70%乙醇泡2分鐘，然后是50%乙醇2分鐘，最后用蒸餾水洗2分鐘。從蒸餾水中拿出玻片后，滴幾滴5或6NHcl在細胞上靜置5秒鐘。這是準備染色的十分關(guān)鍵的一步(y b)。酸水解細胞核中的RNA并因此消滅了富RNA小體，這些小體也可被硫槿染液染色。過度的水解會破壞RNA也會破

10、壞富DNA的性染色質(zhì)體，然而水解不足會留下象核仁那樣完整的富RNA小體。 四、操作步驟： 2. 口腔粘膜細胞(xbo)觀察: 第15頁/共22頁第十五頁，共22頁。 硫槿染液對核酸(h sun)是特異性的，能將DNA染成深藍黑色，而將RNA染為紫色。然而當研究細胞中核仁及性染色質(zhì)這樣小的物體時，最好避免按照顏色的不同來區(qū)分他們。適當?shù)乃鈱籖NA小體并防止與富DNA性染色質(zhì)小體的混淆。 接下來，把玻片放到蒸餾水中1015秒鐘以去掉Hcl。然后用1%硫槿染液染色(rns)1015分鐘，之后用蒸餾水洗,再按照下面步驟脫水：50%乙醇 30秒，70%乙醇 30秒，95%乙醇 30秒，純乙醇

11、30秒。 現(xiàn)在，把玻片放到二甲苯中分色1分鐘。拿出玻片后，立即(lj)滴上一滴香柏油并且蓋上潔凈的蓋玻片。在放蓋玻片時要小心不要留有氣泡。 這樣制備的粘膜細胞可以識別無色的細胞質(zhì)和一個淺蘭色的核。用低倍鏡對細胞進行觀察；然后用油鏡對性染色質(zhì)進行檢測。第16頁/共22頁第十六頁，共22頁。3. 性染色質(zhì)和核的性別(xngbi)四、操作步驟： 類似性染色質(zhì)的染色質(zhì)體，偶爾在雄性組織中觀察(gunch)到。在雄性細胞中發(fā)現(xiàn)的類似性染色質(zhì)的統(tǒng)計發(fā)生率通常的范圍是從口腔粘膜細胞的2%到肝臟制片高達20%。實際上，對核的性別的精確確定，統(tǒng)計學上有意義的細胞數(shù)字必須來檢測只有性染色質(zhì)的細胞百分數(shù)。對于雌性口

12、腔粘液細胞，大多數(shù)的實驗者發(fā)現(xiàn)50%到60%健康細胞存在著性染色質(zhì)。只有外形正常且染色均勻的才算數(shù)。核折疊,有粒狀的核質(zhì)，或者證明有任何衰退跡象的細胞都不能包括在這個關(guān)鍵的實驗中。 第17頁/共22頁第十七頁，共22頁。五、結(jié)果(ji gu)分析：X染色質(zhì)的辨認(binrn)l低倍鏡下檢出典型(dinxng)的可數(shù)細胞：標準：A、核質(zhì)呈網(wǎng)狀或細顆粒狀分布；B、核膜清晰，核無缺損；C、染色適度；D、周圍無雜菌；l高倍鏡下觀察：1、核膜內(nèi)側(cè)邊緣；2、核仁附近；3、染色質(zhì)中間游離部位。（正常女性口腔粘膜細胞中約30-50%有一個Barr小體。在不同實驗室中計數(shù)的差別較大，而在男性中則僅只偶爾可見不典

13、型者這是環(huán)境引起代謝的暫時現(xiàn)象，約2%以下）第18頁/共22頁第十八頁，共22頁。第19頁/共22頁第十九頁，共22頁。五、結(jié)果(ji gu)分析： 1. 檢測50個取自女性的口腔粘膜鱗狀上皮細胞(xbo),有多少個存在性染色質(zhì)？這50個細胞(xbo)中有性染色質(zhì)的百分比是多少？ 2. 50個取自男性的口腔粘膜細胞中有性(yu xn)染色質(zhì)的發(fā)生率是多少？ 3. 你發(fā)現(xiàn)女性細胞中多一個性染色質(zhì)小體的情況嗎？ 4. 對于大多數(shù)哺乳動物的研究，特別是人類，搜集的證據(jù)表明Y染色體決定為雄性，除有少數(shù)例外，個體表型將會是雄性。決定雌性的基因顯然座落在X染色體和常染色體上；人類正常女性的體細胞有46條染色體,包括44條常染色體和2條X染色體;正常男性有44條常染色體加上一個X和一個Y染色體。根據(jù)這些信息完成表2.1，指出個體可能存在的