微流控芯片分析法7頁

1、微流控芯片分析法一、概述微流控分析是指利用微流控芯片或系統(tǒng)對物質(zhì)的組成、含量、結(jié)構(gòu)和功能進行測定和研究的一類分析方法。它起源于20世紀90年代初由瑞士的ManZ和Widmer提出的以微機電系統(tǒng)（microelectromechanical systems,MEMS）技術(shù)為基礎(chǔ)的“微全分析系統(tǒng)”(miniaturized total analysis systems，或micro total analysis systems，TAS）概念1,其目的是通過化學分析設(shè)備的微型化與集成化，最大限度地把分析實驗室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的分析設(shè)備中，甚至集成到方寸大小的芯片上。由于這種特征，該領(lǐng)域還有一個更為形

2、象的名稱“芯片實驗室”（lab a chip）。上述系統(tǒng)的核心是微流控芯片(microfluidic chips)，其結(jié)構(gòu)特征是在方寸大小的散芯片上加工微通道網(wǎng)絡(luò)，通過對通道內(nèi)微流體的操縱和控制，實現(xiàn)整個化學和生物實驗室區(qū)功能2。2、 微流控分析的基本技術(shù)1. 微流控芯片加工技術(shù) 微流控芯片的基本結(jié)構(gòu)單元是具有微米級深度和寬度的微通道，由其構(gòu)成微通道網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)不同的需要集成微結(jié)構(gòu)、微閥、微泵、微儲液器、微電極、微檢測器、微控制和微處理等單元，組成完整的微流控芯片系統(tǒng)。因此，加工微流控芯片需采用特殊的微細加工技術(shù)，該技術(shù)起源于微電子工業(yè)中的微機電加工技術(shù)，目前已發(fā)展出多種適合不同芯片材質(zhì)的芯片

3、微加工技術(shù)2-4。微流控芯片所使用的材料包括無機和有機材料兩大類。常用的無機材料包括單晶硅、無定型硅、玻璃、石英、金屬等。利用硅材料加工微流控芯片的優(yōu)點是芯片表面光潔度好，圖形復制精準度高，具備三維結(jié)構(gòu)加工能力，工藝成熟，可批量生產(chǎn)。其缺點是材料易碎、不透光、電絕緣性不好。通常被用于加工微泵、微閥和控制元器件，或制作高分子聚合物芯片的模具。玻璃和石英是目前加工微流控芯片中使用較多的材料，其優(yōu)點是透光性好，機械強度高，微加工工藝較成熟；其表面的電滲和親水性質(zhì)適于進行毛細管電泳分析。石英材料可透過紫外光，但其成本是玻璃的十倍。目前，用于制作微流控芯片的高分子聚合物主要有三類：熱塑性聚合物、固化型聚

4、合物和溶劑揮發(fā)型聚合物。熱塑性聚合物包括聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯等；固化型聚合物有聚二甲基硅氧烷（PDMS）、環(huán)氧樹脂和聚氨酯。溶劑揮發(fā)型聚合物有丙烯酸、橡膠和氟塑料等。高分子聚合物材料的優(yōu)點是材料種類多、成本低、適合大批量制作等。其中，PDMS因其具有良好的微結(jié)構(gòu)成形性、透光性和生物相容性，是目前使用最多的高聚物芯片加工材料。通常微流控芯片的加工按流程分為兩部分：芯片微通道加工和芯片的封合。目前，微通道的加工方法主要有光刻和蝕刻法、模塑、熱壓法、激光刻蝕法、LIGA技術(shù)和軟光刻法等。其中，光刻和蝕刻法主要是用于無機材料芯片的加工及芯片模具的加工。模塑、熱壓法、激光刻蝕法、LIGA技術(shù)和軟光刻

5、法等主要是用于高分子聚合物芯片的加工。芯片的封合技術(shù)則有熱鍵合、常溫鍵合、黏結(jié)法等，不同材質(zhì)的芯片封合方法各有不同。2. 微流體驅(qū)動技術(shù)微流控芯片分析系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上的主要特征是各種構(gòu)型的微通道網(wǎng)絡(luò)，通過對通道內(nèi)微流體操控，完成芯片系統(tǒng)的分析功能。微流體驅(qū)動系統(tǒng)是實現(xiàn)微流體控制的前提和基礎(chǔ)。微流控芯片分析系統(tǒng)所使用的驅(qū)動系統(tǒng)，突出特點是流量低，通常范圍在pL-µL/min。依據(jù)驅(qū)動系統(tǒng)有無活動的機械部件，可分為有活動機械驅(qū)動部件和無活動機械驅(qū)動部件的微驅(qū)動系統(tǒng)（泵）。依據(jù)微驅(qū)動系統(tǒng)所用的驅(qū)動動力的不同，可分為流體動力、氣動動力、電滲動力、重力（流體靜壓力）、熱氣動動力、表面張力、剪切力、

6、離心力、聲波動力、壓電動力等。目前在微流控分析系統(tǒng)中使用的流休動力驅(qū)動系統(tǒng)主要有微量注射泵和各類微機械往復泵。微量注射泵具有驅(qū)動流量穩(wěn)定，可調(diào)范圍大的優(yōu)點，但其體積較大。不易實現(xiàn)系統(tǒng)的微型化：微機械往復泵的組成通常包括以下部分：一個具有出入通道的微體積泵腔，出入兩通道上分別設(shè)置兩個控制流向的單向閥，泵腔的部分內(nèi)壁由可往復運動的泵膜（可活動的機械部件，通常為隔膜或活塞形狀）構(gòu)成；致動器產(chǎn)生致動力作用于泵膜，使其發(fā)生形變或位移（運動），以馭動泵腔內(nèi)的液體。其基本工作模式是由致動力的循環(huán)往復變化，產(chǎn)生泵膜的往復運動，配合兩單向閥的限流作用，形成單向連續(xù)流動的液流。微機械往復泵按致動器類型的不同有壓電

7、微泵、電磁微泵、靜電微泵、氣動微泵、熱氣動微泵、雙金屬微泵等。微機械往復泵的特點是體積微小，易與芯片集成化，但結(jié)構(gòu)復雜，加工難度較大，輸出液流流速有脈動，泵壓較低。目前，在微流控芯片分析系統(tǒng)中，使用最多的微機械往復泵是基于PDMS氣動微閥的微蠕動泵5。該系統(tǒng)采用多層軟光刻技術(shù)加工，其有結(jié)構(gòu)簡單，體積微小，易實現(xiàn)芯片集成化、規(guī)?；庸さ奶攸c。目前，微流控芯片分析系統(tǒng)中使用較多的非機械驅(qū)動方式有電滲驅(qū)動、重力（流體靜壓力）驅(qū)動、負壓驅(qū)動和離心力驅(qū)動等。電滲驅(qū)動是在芯片毛細管電泳系統(tǒng)中占主導地位的驅(qū)動技術(shù)。電滲驅(qū)動的原理是利用微通道表明存在的固定電荷進行驅(qū)動，屬于致動力直接作用于流體的驅(qū)動方式電滲驅(qū)

8、動的特點是：以高電壓直接驅(qū)動液流，無需活動的機械部件；液流流動無脈動，生扁平流型；驅(qū)動同時，可以實現(xiàn)無閥無機械部件的微流控操作（如液流匯合、分流、切換等）；電滲流易受多種因素變化的影響，如外加電場強度、通道壁性質(zhì)、介質(zhì)解離性、離子強度、黏度等，以及試樣中組分的吸附，系統(tǒng)長時間工作的穩(wěn)定性有待提高。重力（流體靜壓力）驅(qū)動和負壓驅(qū)動方法因其簡便易行，也少目前芯片系統(tǒng)中經(jīng)常使用的流體驅(qū)動方法。離心力驅(qū)動方法因可實現(xiàn)多通道內(nèi)流體的同時驅(qū)動，多用于多通道陣列芯片中。3. 微流體控制技術(shù)微流控技術(shù)的核心是對微流體的操縱和控制。根據(jù)實現(xiàn)微流體控制時使用方法的不同，基本的微流控技術(shù)可分為：驅(qū)動（微泵）控制、微

9、閥控制、芯片微結(jié)構(gòu)控制、多相流體控制，以及基于光、電、磁、聲、熱等效應(yīng)的控制技木等。上述方法在各種微流控芯片分析系統(tǒng)中均有不同形式應(yīng)用。閥是在流動通道內(nèi)起控制性限流作用的器件。按閥的功能可分為單向閥和切換閥。切換閥的類型有多種，如三通閥和多位選擇閥等。按閥的結(jié)構(gòu)可分為機械閥和非機械閥，前者的閥系統(tǒng)通常含有活動的機械部件，而后者則不含活動的機械部件。按閥中有無致動器可分為主動閥和被動閥兩類。主動閥的原理是利用致動器產(chǎn)生的致動力實現(xiàn)閥的開閉或切換操作。PDMS氣動微閥是目前微流控芯片系統(tǒng)中使用較多的一類主動閥。被動閥的工作原理是利用流體本身參數(shù)的變化（如流動方向、流動壓力等）實現(xiàn)閥狀態(tài)的改變。其特

10、點是閥體積小，無需外來的致動力多被用來實現(xiàn)單向閥的功能。被動閥的典型代表是突破閥（burst valve)，利用通道表面張力的變化產(chǎn)生阻流作用，起到閥封閉的功能；利用增加流體前進的動力，突破上述阻力，實現(xiàn)閥開啟的功能。微流動通道不僅提供流體流動和進行微流控操作的場所，而且經(jīng)過特殊設(shè)計的微通道網(wǎng)絡(luò)本身即可作為微流體控制的一種重要手段。與流動通道有關(guān)的微流控方法，可分為改變微通道構(gòu)型、改變表面性質(zhì)、在通道內(nèi)外附加裝置等三類方法。在微流控芯片各單元功能的實現(xiàn)上，微通道構(gòu)型的設(shè)計起到了至關(guān)重要的作用。例如，芯片進樣操作中，不同的通道構(gòu)型可完成不同模式的進樣操作，如T型通道、十字通道、雙T型通道等。此外

11、，在芯片毛細管電泳系統(tǒng)中彎道效應(yīng)的消除以及在微混合器設(shè)計中，通道構(gòu)型的設(shè)計起到了關(guān)鍵作用。 三、微流控芯片分析系統(tǒng)完整的微流控芯片分析系統(tǒng)應(yīng)包括取樣、進樣、試樣預處理（預分離、濃集、稀釋、混合、反應(yīng)等）、高分辨分離、檢測及系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)處理顯示等單元系統(tǒng)。1，微流控芯片進樣系統(tǒng)進樣技術(shù)是微流控芯片分析系統(tǒng)中的關(guān)鍵技術(shù)。以微流控芯片毛細管電冰系統(tǒng)為例，主要有兩類進樣方式，基于時間的和基于體積的進樣方法。前者主要包括T型通道進樣法和門式進樣法，目前門式進樣法使用較多；后者包括“十”字通道和“雙T”型通道進樣法。門式進樣法（gated injection6）的原理。在注樣階段，即“十”字通道的交又區(qū)

12、，兩液流呈并行流動的層流流形，相互間互不干擾；在充樣階段，一部分試樣液流分流進人分離通道，通過控制充樣電壓和時間，可以控制進樣量。其優(yōu)點是在分離的同時可方便地進行試樣更換操作，適用于在線連續(xù)監(jiān)測和芯片上多維分離系統(tǒng)，但存在電動進樣的歧視性效應(yīng)問題。2，微流控試樣預處理系統(tǒng) 在進行檢測之前，試樣往往需經(jīng)過一系列預處理（如試樣預分離、預濃集和稀釋等）和反應(yīng)操作。通常預處理操作采用技術(shù)有過濾、滲析、氣體擴散、液-液萃取等。反應(yīng)操作則包括為完成分析目的所進行的各類反應(yīng)，如標記（衍生化）反應(yīng)、酶催化反應(yīng)、免疫反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及其他生化反應(yīng)等。3，高分子分離系統(tǒng)目前微流控芯片系統(tǒng)中使用的高分辨

13、分離技術(shù)主要為芯片毛細管電泳和芯片高效液相色譜技術(shù)。芯片毛細管電泳是加工有微通道的玻璃、石英、高分子聚合物芯片為載體，進行毛細管點用分離分析。與經(jīng)典毛細管電泳系統(tǒng)相比，芯片毛細管電泳系統(tǒng)具有分離速度快、分離效率高、進樣體積小、流體操控能力強、系統(tǒng)集成化和微型化等特點，已成功應(yīng)用于多種電泳分離模式，包括區(qū)帶電泳、膠束電動色譜、凝膠電泳、等電聚焦、等速電泳、電色譜等，分離的樣品包括氨基酸、手性氨基酸、藥物、金屬離子、蛋白質(zhì)、多肽、DNA、RNA等生化樣品。 目前，芯片液相色譜技術(shù)也得到較快發(fā)展。最近，Agilent公司研發(fā)了一種集成化的微流控高效液相色譜芯片，將液相色譜系統(tǒng)的進樣閥、預富集柱、分離

14、柱和用于電噴霧質(zhì)譜檢測的電噴霧針集成于高聚合物芯片上。首先利用預富集柱對樣品進行富集，然后再通過進樣閥將富集在預富集柱上的樣品洗脫，注入色譜柱中進行分離，流出的組分通過電噴霧針進入質(zhì)譜進行檢測。該系統(tǒng)被應(yīng)用于酶解牛血清蛋白（BSA）樣品的分析和腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)。4，微流控芯片檢測系統(tǒng)因微流控分析系統(tǒng)操作的液體體積通常也在納升、皮升，甚至飛升級，因此，相對常規(guī)分析系統(tǒng)，芯片系統(tǒng)對其檢測器系統(tǒng)的靈敏度和信噪比提出了更高的要求。此外，如需實現(xiàn)分析系統(tǒng)的微型化，還會在檢測的體積、系統(tǒng)集成度和成本等方面提出更高的要求。微流控分析系統(tǒng)的檢測器一般按其檢測原理可分為光學檢測器、電化學檢測器和質(zhì)譜檢測器等。其

15、中，光學檢測器還可分為熒光、吸收光度、化學發(fā)光。激光熱透鏡、核磁共振、原子光譜、折射率檢測器等。電化學檢測器包括安培、電導和電位檢測器。質(zhì)譜檢測器主要有電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜（MALDI-MS）檢測器兩類。熒光檢測器是在微流控芯片系統(tǒng)中應(yīng)用最早，并且至今仍然廣泛使用的光學檢測器7。采用激光作為激發(fā)光源的熒光檢測方法具有很高的靈敏度，通常靈敏度為10-3-10-9mol/L，甚至可達到單分子檢測水平。此外，配有高靈敏CCD照相機的熒光顯微鏡也是目前常用的芯片熒光檢測器。電化學檢測方法的種類繁多，目前在微流控分析系統(tǒng)中所采用的電化學檢測器主要有安培、電導和電位

16、檢測器。電化學檢測器的電極容易在芯片上進行微型化加工，且其檢測靈敏度不會因通道幾何尺度的縮小而降低，因此在原理上在微流控分析系統(tǒng)中采用電化學檢測具有獨特的優(yōu)勢。芯片電化學檢測器中使用較多的工作電極是碳電極、金屬電極和化學修飾電極。碳電極多采用碳素墨水、碳糊等材料通過篩印和填充等微加工技術(shù)制作。金屬電極多采用金膜電極和鉑電極，采用噴涂法、光刻法或化學鍍法加工。四、總結(jié)與常規(guī)分析系等些竺，禪流控分析系統(tǒng)通常具有以下特點： (1)微量一試件與試劑的消耗可由微升級降低至納升級，甚至皮升級。不僅降低廠分析費用和貴重生物試樣的消耗，也減少了對環(huán)境的污染。(2)高速-許多微流控分析系統(tǒng)可在數(shù)秒至數(shù)十秒時間內(nèi)

17、完成反應(yīng)和分析操作。速度常較宏觀系統(tǒng)高1-2個數(shù)量級。其高速特點主要來源于微米級通道中的高傳質(zhì)和高傳熱速率，以及反應(yīng)和分析系統(tǒng)空間尺寸的縮小。(3)高通量-在微流控芯片上容易加工多個反應(yīng)和分析通道，形成并行的多通道陣列分析系統(tǒng)，實現(xiàn)高通最分析。(4)系統(tǒng)微型化、集成化和自動化-利用微加工技術(shù)可將多個分析和控制功能單元集成在數(shù)平方厘米的芯片上，能夠?qū)崿F(xiàn)分析系統(tǒng)的微型化、集成化和自動化，進而發(fā)展出功能齊全的便攜式分析儀器，用于各類現(xiàn)場分析。(5)顯著的尺度效應(yīng)在微流控系統(tǒng)內(nèi)，存在著多種區(qū)別于宏觀系統(tǒng)的尺度效應(yīng)，如層流效應(yīng)、快速擴散傳質(zhì)效應(yīng)、快速傳熱效應(yīng)、界面效應(yīng)等。此外，由于尺度相近，微流控系統(tǒng)尤

18、其擅長進行單個細胞的操控，是進行復雜細胞操控和分析、大規(guī)模單細胞分析及單分子分析的理想工具。 由于微流控分析技術(shù)所具有的獨特優(yōu)勢，白該技術(shù)出現(xiàn)以來，相關(guān)研究取得了快速發(fā)展。目前，微流控分析技術(shù)已應(yīng)用到化學、生物學、醫(yī)學、藥學、材料學、物理學、計算機學等多個學科領(lǐng)域。在超微量樣品的生化檢測，高靈敏單細胞單分子分析，分子生物學、細胞生物學、結(jié)構(gòu)生物學和合成生物學研究，高通量藥物篩選，臨床診斷，現(xiàn)場即時檢測（point-of-care testing,POCT），環(huán)境監(jiān)測、衛(wèi)生檢疫、司法鑒定和生物試劑偵檢中的現(xiàn)場檢測，新材料合成與篩選，以及天體生物學研究等眾多領(lǐng)域中，表現(xiàn)出突出的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。此外，隨著微流控芯片技術(shù)本身的發(fā)展，也逐漸形成了一門多學科交叉的新興學科微流控學（microfluidics)：在微米尺度空間內(nèi)操控微量流體的技術(shù)與科學。近年來，在微流控芯片研究領(lǐng)域還出現(xiàn)了許多新的分支，如納流控芯片與納流控學（nanofluidic chip和nanofluidics），多相微流控技術(shù)，光速控技術(shù)，以及仿生器官芯片和人體芯片技術(shù)等。這些科學和技術(shù)的出現(xiàn)，為微流控分析技術(shù)的發(fā)展提供了更加強大的理論和技術(shù)支撐，以及更加廣闊的應(yīng)用。參考文獻：1 Manz A,Graber N,Widmer H M.Sens Actuators B,1