G418篩選實驗

1、G418篩選實驗相關(guān)問題點擊次數(shù)： Jd 1011 作者：guodengjun12 zhaolifei sandy99 等發(fā)表于：2008-08-06 23:39 轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園來源：丁香園問：G418篩選預(yù)實驗用未轉(zhuǎn)染的細胞做，選 10-14天內(nèi)細胞死 亡的最小濃度，然后將更高一級別的濃度應(yīng)用于轉(zhuǎn)染的細胞， 是這樣 嗎？答：G418是一種細胞毒性藥物（氨基糖苷類抗生素），依不同濃度，對細胞有一定的抑制或殺傷作用，而擬轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒上帶有G418的藥代酶，能降解G418，從而使細胞獲得對G418的耐藥性。也 就是說轉(zhuǎn)染后的細胞可以耐受 G418，而未轉(zhuǎn)染成功的細胞不能耐受 G418，因而被殺

2、滅或抑制。通過 G418篩選體系，使得未轉(zhuǎn)染成功 的細胞比例不斷減少，轉(zhuǎn)染成功的細胞比例不斷增高。如果G418濃度太高則會殺傷所有的細胞，如果 G418濃度太低則沒有什么毒性， 兩種情況都不能起到篩選作用。G418篩選預(yù)實驗則是先用未轉(zhuǎn)染的 細胞做，選14天內(nèi)細胞死亡的最小濃度應(yīng)用于轉(zhuǎn)染的細胞，因為不 同的細胞對G418的耐受性也不一樣，這樣的目的是找一個實驗細胞 能耐受G418的工作濃度，從而為篩選轉(zhuǎn)染的細胞打下基礎(chǔ)，因為這種濃度只能抑制未轉(zhuǎn)染的細胞， 而不抑制轉(zhuǎn)染成功的細胞的！從而起到篩選作用。 建議你再多查找一下國內(nèi)外相關(guān)文獻， 實驗動手之前一 定要明白其原理， 要不然會很盲目， 充分的

3、準備可以避免走很多不必 要的彎路！問：第二次篩選要怎么做？答：第二次篩選就是將轉(zhuǎn)染好的細胞接種培養(yǎng)后，向培養(yǎng)液中加 入 G418 以殺傷或抑制其中的未轉(zhuǎn)染成功的細胞， 因為不管轉(zhuǎn)染效率 多么高，都不可能是 100% ，所以要通過 G418 篩選體系（或者其他 篩選體系） 來篩掉那些沒有成功轉(zhuǎn)染的細胞， 此時加入 G418 的濃度 可以略高于你第一次預(yù)實驗時摸索出來的 “最小有效濃度 ”，實驗中可 以再根據(jù)細胞生長情況進行濃度的調(diào)整！問：第二次篩選是經(jīng)過第一次篩選以后，已經(jīng)篩選出一部分轉(zhuǎn)染 細胞了，但是因為有些細胞還是會丟失目的基因所以要得到穩(wěn)定表達 的細胞還要進行 2-3 次篩選， 這時候還是

4、用原來預(yù)實驗的濃度， 還是 要再提高一個濃度？答：你要在熒光顯微鏡下觀察一下，判斷一下細胞轉(zhuǎn)染的效率， 也就是轉(zhuǎn)染成功的細胞的比例， 再根據(jù)情況選用或高或低的濃度！ 轉(zhuǎn) 染成功的細胞的比例越高，則加入 G418 的濃度就可以越低。問：我的質(zhì)粒上沒有熒光標記，要等到篩選完了以后打動物的， 那要怎么辦呢？答：可以用免疫細胞化學(xué)檢測！問：做 G418 篩選預(yù)實驗時每個濃度是不是要多弄幾個孔，還是 一個孔就行了？篩選的培養(yǎng)液是不是要用沒有雙抗的， 做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時 必須用 DMEM 培養(yǎng)基嗎？答： 用什么培養(yǎng)基視你培養(yǎng)的細胞特性而定吧 不見得非用 DME M，一般設(shè)三個復(fù)孔就足以 各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對照

5、3復(fù)孔。以 10-14 天細胞全部死亡的濃度為篩選濃度。 由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之 后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。 所以篩選不能太早， 但是也不能太 晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增殖較慢，時間長了 就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克 隆，一般要在轉(zhuǎn)染 24 h 之后才開始加 G418 篩選 。答： 每種細胞的生長狀態(tài)和速度不同，在一些細節(jié)處理上可能也 不同。我的是這樣做的：1、G418 篩選實驗：轉(zhuǎn)染 293 細胞，生長較快，所以在 96 孔板中加 入100ul細胞（2000/ml），第二天就加入 G418 ,從0, 100 , 200 1000卩g/ml,

6、復(fù)3孔，每天觀察。前幾天，低濃度的孔中細胞生長， 中濃度的細胞生長緩慢,高嘗濃度的不長,稀稀拉拉。約一周左右, 中濃度的孔中出現(xiàn)死細胞, 低濃度的死細胞較少, 未加 G418 的孔長 得很密。14天時，觀察細胞全部死亡的最低濃度孔， 在500卩g/m, 做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時選用的600卩g/m。2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：24孔板，細胞密度也較小，轉(zhuǎn)染后第二天1 : 10稀釋 傳代，設(shè)立空白細胞對照組，第三天加 G418（600卩g/ml）。耐心等 待2周，前一周細胞死亡較少，后一周死細胞較多，可 3天換液，待 對照組里的細胞全部死亡，就可以開始挑單克隆了。http:/www.bio on .com/experim

7、e nt/sol/244209.shtmlG418通過干擾核糖體的功能而阻斷細胞的蛋白合成G418是一種氨基糖苷類抗生素，這種氨基糖類抗生素的結(jié)構(gòu)和新霉 素、慶大霉素、卡那霉素相似，在分子遺傳試驗中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。它通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601 , Tn5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細胞產(chǎn)生毒素，包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞，也包括原生動物和蠕蟲。當neo基 因被整合進真核細胞 DNA后，則能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為 mRNA ,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達，使細胞獲得抗性而能在含有G 418的選擇性培養(yǎng)基中生長。G 418的

8、這一 選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方 面得以廣泛應(yīng)用。G418使用方法 室溫下運輸，干粉在室溫下儲存，溶于水、甲醇，溶 液于-20 C儲存 由于各真核細胞系對 G418敏感度不同,各新細胞系 或株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時殺死非穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞所需用量需要通過實驗優(yōu)化。最適用量通過建立細胞死亡曲線獲得。將細胞稀釋至1000cell/ml，每 孔 100ul 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板，將每孔中的 G418 濃度稀釋至 0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml 等 12 個 級別 , 培養(yǎng) 10-14 天，以最低細胞全部死

9、亡濃度為基準， 一般 400-800 左右， 篩選時比該濃度再高一個級別， 維持時使用篩選濃度的一半即 可。G418 選擇濃度范圍細胞系或機體 G418 濃度( ug/ml )中國倉鼠卵巢細胞 700800Madin Darby 犬腎細胞 500人上皮 A431 細胞 400猿 CV-1 細胞 500盤基網(wǎng)柄菌屬 1035植物 10酵母 125 500G418質(zhì)量指標G418 :白色粉末，融點138144 C,溶于水、甲醇。 CAS No.： 108321-42-2分子式 : C20H40N4O10 ?2H2SO4 分子量 : 692.71結(jié)構(gòu)式 :比旋：+104O+1210 水分：<

10、10% 吸光值：< 0.015(280nm,1mg/ml),< 0.1 (570nm, 100mg/ml)效價： >700 ug/mg儲運室溫下運輸，干粉在室溫下儲存，溶液于-20 C儲存。Q： G418 怎么配制？A:我覺得不能用水配，因為這樣 PH會變化很大，至少要用 PBS 我是配在HEPES溶液中的，具體方法如下：1g包裝的G418瓶子中， 加入10ml HEPES溶液，濃度為100 mg/ml完全溶解后，0.22 um過 濾，20度保存。HEPES緩沖液配方如下：90 ml水中，0.8 g NaCI, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H

11、2O, 0.1 g 葡萄糖， 0.5 g HEPES, 溶解，NaOH調(diào)PH至7.05,定容至100ml。Good answer:推薦用HEPES特別是當細胞對G418不敏感，G418使用濃度高時， 如果用水、PBS配置，會極大的改變細胞培養(yǎng)基的 pH值，影響細胞 的生長。1mol/L HEPES的簡單配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml 的 ddH2O，用 10mol/L 的 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.5-8.0，定容至 50ml, 0.22um小濾器過濾。HEPES最終使用濃度15-20mM。Q: 我想一步篩選出高拷貝整合的高表達的細胞克隆，如果我用很高 濃度的G418直接加

12、進培養(yǎng)瓶直接篩選，這樣做可以嗎？我做過G418 殺傷曲線， 300ugml 就基本上可以殺死細胞， 我想直接用 1000ugml 來篩選，不知是否可行？會不會有什么問題？A: G418 篩選要做預(yù)試驗確定最佳濃度，將細胞稀釋至 1000cell/ml ， 每孔 100ul 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板，將每孔中的 G418 濃度稀釋至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等1 2個級別，培養(yǎng)10-14天，以最低細胞全部死亡濃度為基準，一般 400- 8 0 0左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度 的一半

13、。G418 濃度太高也不好，會對細胞的損傷太大，影響增殖。我用過Zeocin，為了加速篩選，用了最低劑量的兩倍濃度，結(jié)果一個陽性克 隆都沒篩到，欲速則不達。Q: 我用 24 孔板做了 G418 篩選的濃度梯度，確定最低致死濃度為600mg/l 。我現(xiàn)在用這個濃度篩選我轉(zhuǎn)染后的細胞，我應(yīng)該保持這個 濃度多少天才能確保我篩選完成呢？在這期間可以換液嗎？篩選完 了之后存活的細胞再培養(yǎng)傳代的話， 培養(yǎng)基中是否還應(yīng)該加一定濃度 的G418?如果要加的話什么濃度比較合適？A: 應(yīng)該保持這個濃度 9 天以上，每 3 天換液一次。篩選完了之后存活的細胞再培養(yǎng)傳代的話，培養(yǎng)基中應(yīng)該加一定濃度的G418, 般在最

14、低致死濃度的 60% 左右。Q: 在 6 孔板里進行 NIH3T3 細胞轉(zhuǎn)染后的 G418 篩選， 2 周后單克隆 形成 ， 于 是就挑 取 單 克 隆，之 前 6 孔板 里 的 細 胞 很多 ， 用 0.125%typsin+0.25%EDTA 消化， 1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘 ，肉眼 可以 看到細胞沉淀，接種至 25ml 塑料培養(yǎng)瓶中，鏡下看密度可以， 但是細胞形態(tài)成多態(tài)性：少量是圓形， 大多數(shù)是梭形。 第2 天一看沒 有細胞貼壁！做了 2 次都這樣，請問我的操作步驟有問題嗎？ A: 看了你的操作步驟， 個人觀點認為你挑出來的不能稱之為單克隆， 在 6 孔板里用 G418 篩選兩周

15、后只是大部分細胞死亡， 少數(shù)細胞存活 并逐漸生長，只能叫作克隆形成。我們一般在轉(zhuǎn)染后 24h 將細胞消化下來( 0.25%trypsin + 0.02%EDTA),以1: 10或更高的比例傳代，貼壁24h后加選擇性培 養(yǎng)基開始篩選。 待大部分細胞死亡， 極少數(shù)細胞漸形成克隆。再把這 些克隆經(jīng) 24 孔板、 6 孔板放大后再進行單克隆化的操作(具體操作 方法見附件)。從嚴格意義上來講，單克隆化的操作一般要進行 2-3 次，經(jīng)此操作后長起來的才能稱之為單克隆。另外，在把克隆或單克 隆放大的過程中動作一定要輕柔， 否則很容易出現(xiàn)你所說的細胞不貼 壁死亡的現(xiàn)象， 也可以在消化完用正常培養(yǎng)基， 待細胞貼

16、壁后再換為 含 G418 的培養(yǎng)基。還有，在多克隆形成后一定要及時凍存，以備后 續(xù)試驗。你挑選的克隆，不能貼壁原因可能有二 ;一、細胞很少，那么你接種 后，由于密度較低， 細胞是接觸生長， 所以密度太低， 細胞難以生存。 二、擬消化下來可能用 G418 篩選液篩選，這樣也會死亡。消化后先 用無 G418 的培養(yǎng)液培養(yǎng)，貼壁后，再換取 G428 培養(yǎng)液。Q:我想問怎樣的方法可以把陽性克隆從培養(yǎng)瓶中取下來， 書上說用彎 頭吸管， 我試了，不好用，根本就不能完整的吸取總個陽性克隆細胞下來，我想著用刮勺， 但進口的特別貴，所需又不多，你看有什么別 的好辦法嗎？謝謝了！A: 如何挑選克隆。你可以按以下操

17、作方法進行：【操作方法】（1）將已形成克隆的培養(yǎng)皿置于顯微鏡下觀察克隆位置，并將各個 克隆位置用標記筆標記準確；（2）在超凈臺內(nèi)，棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液；（ 3）用鑷子夾取一塊濾紙塊， 用 0.25%Trypsin 消化液浸濕， 置于所 標記克隆位置處， 5-20 秒；（有人可提前在一孔中裝入 0.02%EDTA PBS）（4）將 24 孔培養(yǎng)板每孔加 G418 選擇培養(yǎng)基 2ml ，用鑷子取出已黏 附克隆細胞的濾紙快，置于一個孔中的培養(yǎng)基中，涮洗濾紙塊數(shù)次， 以使黏附的細胞脫落下。 鏡下觀察確認細胞已經(jīng)脫落后， 將濾紙塊取 出棄掉，其它克隆方法轉(zhuǎn)移同上；（有人在細胞貼壁后再選用培養(yǎng)基）（5）將

18、移有克隆細胞的24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)置37C 5%CO2培養(yǎng)箱培 養(yǎng)， 2-5 天；（ 6）待細胞長滿后， 0.25%Trypsin 消化液消化，并將細胞轉(zhuǎn)移至 6 孔板繼續(xù)培養(yǎng)，或轉(zhuǎn)入多瓶中擴增，此后可做進一步鑒定工作。Q:用G418做HEp-2細胞的建系已經(jīng)有2個月了，已經(jīng)在細胞瓶中 擴大培養(yǎng)，但發(fā)現(xiàn)與正常 HEp-2 細胞相比，建系的細胞生長得很慢， 細胞間的邊界也不是很清楚， 而且細胞長得不均勻， 這樣正常嗎？為 改變這一狀態(tài)，我該怎么做呢？謝謝！A: 基本算正常吧。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞據(jù)細胞種類不同其形態(tài)都較正常 細胞有變化，有的很明顯，比如說細胞變大， 生長緩慢， 細胞界限不 明顯及細胞愛成

19、堆生長等等； 有的則變化不明顯。 對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細 胞，建議篩出單克隆后大量凍存。一方面防止細胞回復(fù)， 因為你轉(zhuǎn)入 的質(zhì)粒對于細胞而言畢竟是個負擔(dān)，細胞較傾向于甩掉負擔(dān)輕裝前 進，這一點對于腫瘤細胞尤甚；另一方面， 如果插入的質(zhì)粒明顯和細 胞周期有關(guān)的話， 這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞傳不了幾代就會死亡。 在傳代 過程中， 也可以使用正常培養(yǎng)基， 但過一段時間一定要用維持劑量的 含 G418 的培養(yǎng)基壓一壓，以除去回復(fù)的細胞。1. G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾 水至 1 0m l ，過濾消毒， 4 度保存。2. 細胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細胞，制備成細胞懸液，按等

20、量接種入多孔 培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 6 小時左右開始加藥。3. 制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個梯度， 比如先做個 100ug/ml 、 400ug/ml 、800ug/ml 、1000ug/ml ，按梯度 濃度用培養(yǎng)基稀釋 G418 制成篩選培養(yǎng)基。4. 加 G418 篩選:5. 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每35 天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同 4。6. 確定最佳篩選濃度：在篩選 1014 天內(nèi)能夠殺死所有細胞的最小G418 濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳 G418 濃度的 可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度 G418 的量在

21、篩選 14 天后還不能殺死細胞，而用下一個梯度的 G418 的量在 10 天前就看不到活細胞了。假如是 400ug/ml 不能殺死細胞，而 800ug/ml 在第 5 天就把所有細胞都殺死了，則可以再用 500ug/ml 、 600ug/ml 、700ug/ml 進一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由 于特性明確的細胞系 G418 的最佳用量還是比較穩(wěn)定的， 所以有時候 不需要在這么大范圍內(nèi)進行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染 NIH3T3 細胞 ， 現(xiàn)在我告訴你我測試過 NIH3T3 細胞對 G418 的敏感性，我用的篩選 濃度是 200 ug/ml 。這時你就可以做 150ug/ml 、200ug/

22、ml 、 300ug/ml 三個濃度進行篩選。 通過預(yù)實驗確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 24 小時或者更長，到細胞增長接近匯合時按 1 ：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞密度增至50 %70%匯合時；b加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的 G418 篩選培養(yǎng)基。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每 35 天更換一次篩 選培養(yǎng)基。當有大量細胞死亡時，可以把 G418濃度減半維持篩選。 篩選 1014天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增 大后；d 挑單克?。褐苽浼毎麘乙?，細胞計數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細胞到 1 個/10ul。在

23、96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細胞懸液10ul/孑L。 待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到 48 孔中增殖。e單克隆鑒定：細胞大量擴增后，提取總 RNA,做RT-PCR檢測目的 基因是否存在。常見問題：1. 轉(zhuǎn)進去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細胞內(nèi)的？ 無怪乎兩種形式： 整合在染色體中和存在于細胞質(zhì)中。 沒有經(jīng)過篩選 前大部分轉(zhuǎn)染進細胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的， 但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn) 定的， 基本上篩選不出這種單克隆， 只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我 們想要的穩(wěn)定細胞系。2. neo 基因和目的基因是不是一定會整合在一起？整合是隨機發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達而目的基因不一定都 表達，所以在篩選之

24、后還要用 RT-PCR的方法進一步鑒定。 培養(yǎng)基處理的個人技巧體內(nèi)的任何細胞被置于體外培養(yǎng)后， 對環(huán)境都有一個適應(yīng)過程， 期間 細胞對培養(yǎng)液具有同化作用， 即細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時， 也 向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)， 其中有排泄物也有促 細胞生長因子。 這個過程也是細胞同化培養(yǎng)基的過程。 細胞越多則其 同化作用越強， 所以細胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長。在篩選后期，大 批細胞死亡， 不換液沒有死亡的細胞就會受到死亡細胞的影響， 換液 后殘留的少量細胞對培養(yǎng)基的同化作用不強， 也不利于生長。 我是用 適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的： 適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制 a培養(yǎng)同源細胞至半?yún)R合狀態(tài)時

25、，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)2448 小時后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心： 3000 4000rpm 10 min 后，吸取上清液c 慮過：再經(jīng)直徑 0.22um 濾器過濾，再加入 2 倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 低溫凍存?zhèn)溆?。eeflying1. G418 篩選要做預(yù)試驗確定最佳濃度，將細胞稀釋至 1000cell/mL ， 每孔 100uL 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板，將每孔中的 G418 濃度稀釋至 0， 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700 ， 800， 900， 1000， 1100ng/mL 等 12 個級別。培養(yǎng) 10-14 天，以最低細胞全部死亡濃度為基準，

26、一 般 400-800 左右，篩選時比該濃度再高一個級別， 維持使用篩選濃度 的一半。2 .我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候抗性基因會丟失，如果沒有 G418，很快會形成優(yōu)勢的。3 .即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重 要的。轉(zhuǎn)染后， 每個細胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的， 目 的蛋白表達有的多， 有的少，外源蛋白表達少的細胞由于代謝負荷較 小，所以生長較快，在生長若干代之后，表達少的細胞會形成優(yōu)勢， 長期之后， 表達最弱的細胞會由于競爭優(yōu)勢占主要， 轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白 基因后，表達越來越暗就是這個道理。所以，要進行單克隆化操作， 使得到

27、的均來自于同一祖先細胞， 遺傳性狀盡量一致， 也是對高表達 細胞的保護。操作用 96 孔板法，每代細胞長滿后，大多數(shù)凍存，留 200cell 左右 就可以進行該操作了， 該方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細胞原代培 養(yǎng)書中均有講述。1. 可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機的而且 不是單拷貝的，這點我們做過 FISH 驗證過，表達量與整合數(shù)目，上 游序列特性，特定部位 DNA 立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了 SV40 只 是增加了表達了數(shù)目， 但并不能掩蓋其它因素對表達的影響。 按你的 講法，轉(zhuǎn)染完 GFP 的細胞應(yīng)該亮度一致，但實際上差別很大。 neo 基因也是這樣， 而且，同一細胞中不

28、同基因的拷貝數(shù)不會相同， 不同 細胞同一基因的數(shù)目也不會相同， 這點可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀 點理解。有時， neo 表達了，但目的基因丟失了的情況也是有的。2. 那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一 細胞內(nèi)隨機含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因， 那么，一種基因拷貝 數(shù)為 0 的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小， 很大的 概率為外源基因的不均質(zhì)。打個比方，一個大口袋，抓 100 個紅球， 再抓 100 個黃球，然后以從中抓若干個， 這些球均為紅球的概率有多 大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是 neo ，黃球就是你的目的基因。我們 用 neo ，實際上是篩選的外源基因整

29、合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的 例子來說，如果我們抓著 5 個紅球，另一次抓著 10 個紅球，可以肯 定，第二次抓的球比較多， 那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因為二者出現(xiàn)的概率比是恒定的3. 維持就是只要養(yǎng)這種細胞，就要維持。可以再低些，但不能沒有。 或者隔一定時間從新使用篩選量壓一下， 我不知你是否干臨床， 想想 抗生素的用藥原則，反向思維一下，實際上我們在篩選耐藥株呀。4. neo 的產(chǎn)物是酶，過高的 G418 濃度就要有更多的 neo 酶來支持， 否則細胞也要被毒死的， 而此時過多的酶要求會對細胞代謝造成太大 負擔(dān)，細胞可能因此無法完成分裂與增殖， 我們曾試過， 即使在同一

30、轉(zhuǎn)染陽性細胞，在不同濃度的 G418 液中生長速度也不同，嚴重形態(tài) 也不同。 這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方 程理解吧。5. 胰酶的作用不必理會，有的細胞受影響，還有的細胞不受影響， 由幾代之后，不受影響的細胞會占優(yōu)勢的。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理， 實在是個人 經(jīng)驗， 而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友， 我還是想聽聽諸位專業(yè)人士 的理解和經(jīng)驗。在第 10 天左右就手挑單克隆或者 96 孔板單克隆操作了 本帖開始我就講了如何確定基準濃度，篩選濃度是基準濃度的高一 級，維持用篩選濃度的一半。匯合度 (confluence) 也許是我們實驗室的翻譯，實際上就

31、是指細胞占 培養(yǎng)表面的比例， 如果細胞鋪滿了整個容器， 我們就認為它們 100% 匯合，也就是匯合度 100% 。最近的一個實驗是：3X106細胞電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細胞分別接 種 1/4000 和 1/1000 和 1/300 到 24 孔板中，48 小時后加 g418 篩選， 這個時候接種了 1/300 細胞的孔會大約 50% 匯合，而理論上接種了 1/4000 細胞的孔會 4% 左右匯合，今天是篩選后第 9 天，觀察到 1/4000 孔有兩三個小克隆，按道理 1/300 孔會有 20-30 個克隆，但 實際的情況是它們幾乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細胞！ 所以我認為匯合度對 g418 篩

32、選影響很大，這耽誤了我將一個多月。 jiangql 同意菊花與刀對你的建議。我的感覺 G418 篩選時間太長， 到后來一般會對細胞生長有影響。以下是一些建議，供參考： 首先需要擴增細胞， 凍存部分中間產(chǎn)物細胞后， 再做克隆化比較合適， 否則一旦污染就會全軍覆沒。一般57天后G418就可以減半維持。 勤換液，去除死細胞，可以減少對存活細胞的影響。 血清濃度可以高到 20 ，質(zhì)量要好。進行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：克隆目的基因 (經(jīng)測序驗證) 準備真核表達載體將目的基因插入 表達載體中轉(zhuǎn)染篩選鑒定下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實驗操作。一、 試劑準備1、HBS( He pes

33、-buffered saline )：876mg NaCl 溶于 90ml ddH2O ， 加入 1M Hepes,調(diào) pH 到 7.4,補 ddH20 至 100ml, pH7.4，濾過除菌。2、核酸貯存液，過濾除菌。3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細胞的正常培養(yǎng)。、操作步驟 （一）克隆目的基因1、根據(jù) GenBank 檢索的目的基因序列，設(shè)計擴增引物，并在上、下游引物的5'-端分別引入酶切位點BamH I和Xho I,行RT-PCF。2、回收特異性擴增片段，連入 T 載體。3、轉(zhuǎn)化DH5a,質(zhì)粒制備。4、酶切初步鑒定，測序證實。（二）真核重組表達載體的構(gòu)建：pcDNA3 載

34、體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、 便于挑選帶重組質(zhì) 粒細菌的抗生素抗性基因，以及表達外源 DNA 序列所必需的所有真 核表達組件。重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamH I和Xho I雙酶切回收插入片段和 pcDNA3 線性片段T4 連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5%質(zhì)粒制備BamH I和Xho I雙酶切鑒定。（三）重組 pcDNA3 轉(zhuǎn)染 SHG-44 細胞：1、G418篩選濃度測定：SHG-44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板-G418分別 用 100mg/L 、 200mg/L 、 300mg/L 、 400mg/L 、 500mg/L 、 600mg/L 加入， 各濃度 3 復(fù)孔，設(shè)正常對照 3 復(fù)孔。以 10

35、-14 天細胞全部死亡 的濃度為篩選濃度，結(jié)果為 200mg/L 。2、在轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞， 各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的 生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞應(yīng)達到 60%-80% 覆蓋。 一般要求，6孔培養(yǎng)皿（35mm ）,每孔1-2ml培養(yǎng)基3X105細胞。 依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘米的細胞數(shù)量。 典型貼壁細胞平板密度培養(yǎng)板大小 生長面積（ cm2） 大約細胞數(shù) 培養(yǎng)基容積（ ml）組織培養(yǎng)皿（© 60mm）2866X1055-66孔培養(yǎng)板（© 35mm）9.53X1051-212孔培養(yǎng)板 © 22.6mm)413X10505-124 孔培養(yǎng)

36、板1 © 8mm)05 06X105025-053、 SHG-44細胞的轉(zhuǎn)染：（1）轉(zhuǎn)染當天，加入脂質(zhì)體 / DNA 混合物之前的短時間內(nèi)，更換 1ml 新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。 準備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個細胞系的最 佳比例。 溶液A：用HBS稀釋DNA（ pcDNA3、重組pcDNA3）各1.5卩g到總體積50卩1（30卩g/m）。溶液B:用HBS稀釋6卩脂質(zhì) 體到終容積501（ 120卩g/ml）?；旌先芤篈和B,輕柔混合（不要 振蕩），室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。（3）不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100卩脂質(zhì)體/DNA混合物（從

37、培養(yǎng) 孔一邊到另一邊） ，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。37 C孵育6hr。（5） 6hr 后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入 2-3ml 新鮮生長培養(yǎng)基 屋尸轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含 G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。4、G418篩選：在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆， 擴大培養(yǎng)，同時轉(zhuǎn)染 pcDNA3即SHG-44-vect，并設(shè)對照組細胞即 SHG-44。(一)篩選結(jié)果鑒定：(1) 基因組DNA提取-PCR鑒定外源基因(2) SHG-44-重組pcDNA3陽性細胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰 胺凝膠電泳免疫印跡鑒定 P16蛋白表達(Western-blot )。(3) 測定外源性基因?qū)H

38、G-44細胞增殖的影響 流式細胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組 pcDNA3單細胞懸液70%酒精固定裂解細胞核糖核酸酶消化碘化 丙啶染色上機分析 G1期和G2/M、S期比例。 細胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA35X104/孔接種24孔培養(yǎng)板24hr后各自用苔盼藍染色計數(shù)細胞 計算細胞生長抑制百分率。 軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3 104細胞0.3%低熔點瓊脂糖培養(yǎng)1-2周后計數(shù)不可少 于50個細胞的克隆數(shù)計算克隆形成率抑制率。三、注意事項1、優(yōu)化轉(zhuǎn)

39、染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質(zhì)體 和DNA混合孵育時間)每種細胞和質(zhì)粒均須進行。用于轉(zhuǎn)染的核酸 應(yīng)高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應(yīng)在無菌條件下，這是細胞慣常的做法。 但是， 脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA 混合物無需濾過除菌。2、預(yù)備脂質(zhì)體 /DNA 混合物必須在無血清下進行。但是在隨后的脂 質(zhì)體 / DNA 與被轉(zhuǎn)染細胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部 分。3、在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須37 C預(yù)溫。4、脂質(zhì)體 / DNA 混合物應(yīng)當逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿 一邊到另一邊， 邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿， 以確保均勻

40、分布和避免局部高 濃度。常見問題和解答：Q:我覺得套環(huán)法操作不如96孔辦法效率高。A:也不一定.依據(jù)實驗?zāi)康呐c要求而定.如果克隆效率較低的細胞, 套環(huán)可能更好 .用96孔板法,如果不是每孔單個細胞 ,就不能保證是單 克隆.即使是增加到每孔十幾個細胞或上百個 ,一個 96 孔板也只能培 養(yǎng)一萬個細胞 ,十萬個細胞就至少需要 10 個板,100 萬個細胞就需要 100 個板,對于轉(zhuǎn)基因細胞篩選或基因打靶 ,工作量就太大了 .且細胞 在單獨生長條件下 ,遠遠不如千萬個細胞共同培養(yǎng)活力好 . 因此還得 看這位朋友使用的是什么細胞 ,有限細胞系還是無限細胞系 ,轉(zhuǎn)基因還 是非轉(zhuǎn)基因 ,篩選還是不篩選 ,

41、需要的單細胞克隆株數(shù)量多少 ?Q：請問一種細胞如果轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定表達的， 含neo抗性基因的質(zhì)粒后， 如何用G418篩選？我查看了國內(nèi)、外 50幾篇文獻后發(fā)現(xiàn)沒有一個 定論的說法。即使對于同一種細胞其篩選劑量和篩選時間也不一樣。 我自己認為， 從理論上講， 如果穩(wěn)定表達最好要一直篩選到細胞傳代 后。不知這種觀點對不對。然而開始篩選的劑量、 維持劑量以及篩選 持續(xù)時間又該如何確定？維持劑量與開始篩選時的劑量是否有一定 關(guān)系？A： 1. G418 篩選要做預(yù) 試驗確定最佳濃 度， 將細胞稀 釋至 1000cell/ml ，每孔 100ul 加入有培養(yǎng)基的 24 孔板，將每孔中的 G418 濃 度 稀

42、釋 至 0,100, 200,300,400,500, 600,700, 800,900,1000,1100ng/ml等1 2個級別，培養(yǎng)10-14天，以最低細胞全部死亡 濃度為基準，一般400- 8 0 0左右，篩選時比該濃度再高一個級別， 維持使用篩選濃度的一半。2。我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候 抗性基因會丟失，如果沒有 G418，很快會形成優(yōu)勢的。3。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重 要的。Q:請問：能談一談單克隆化操作的步驟以及其與目的基因表達的關(guān) 系嗎？A:轉(zhuǎn)染后，每個細胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的， 目的蛋白表達有

43、的多， 有的少， 外源蛋白表達少的細胞由于代謝負荷 較小，所以生長較快，在生長若干代之后， 表達少的細胞會形成優(yōu)勢， 長期之后， 表達最弱的細胞會由于競爭優(yōu)勢占主要， 轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白 基因后，表達越來越暗就是這個道理。所以，要進行單克隆化操作， 使得到的均來自于同一祖先細胞， 遺傳性狀盡量一致， 也是對高表達 細胞的保護。操作用 96 孔板法，每代細胞長滿后，大多數(shù)凍存，留2 0 0 cell左右就可以進行該操作了，該方法在很多關(guān)于單克隆抗體 和細胞原代培養(yǎng)書中均有講述，我就不贅述了。必須指出， 單克隆化要做幾遍， 一遍是不夠的， 我前十代都是這樣的， 結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒減弱，反而增強了很

44、多。 現(xiàn)在很多代了，很 穩(wěn)定。Q ：1。我的質(zhì)粒中含有 SV40 與 neo 基因，好像就不存在外源蛋白 表達少的細胞形成優(yōu)勢這個問題了吧。2。按您的講法， 篩選要進行 10 代，那么維持劑量要進行多長時間？ 如果我使用對照組 ,在對照組細胞全部死亡后就用維持劑量進行培養(yǎng) 行嗎？3。在細胞用胰酶進行傳代時，此時細胞膜受到一定影響，如果培養(yǎng) 基中存在 G418 對細胞是否有影響？4。既然細胞表達 neo, 從理論上講是否無論多大濃度的 G418 對之都 無影響？A： 1.可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機的而 且不是單拷貝的，這點我們做過 FISH 驗證過，表達量與整合數(shù)目， 上

45、游序列特性，特定部位 DNA 立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了 SV40 只是增加了表達了數(shù)目， 但并不能掩蓋其它因素對表達的影響。 按你 的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細胞應(yīng)該亮度一致，但實際上差別很大。neo 基因也是這樣， 而且，同一細胞中不同基因的拷貝數(shù)不會相同， 不同 細胞同一基因的數(shù)目也不會相同， 這點可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀 點理解。有時， neo 表達了，但目的基因丟失了的情況也是有的。2。那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細胞內(nèi)隨機含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因， 那么，一種基因拷貝 數(shù)為 0 的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小， 很大的 概率為外源基因

46、的不均質(zhì)。打個比方，一個大口袋，抓10 0個紅球， 再抓 100 個黃球，然后以從中抓若干個， 這些球均為紅球的概率有多 大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是 neo ,黃球就是你的目的基因。我們 用neo,實際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的 例子來說，如果我們抓著5個紅球，另一次抓著10個紅球，可以肯 定,的二次抓的球比較多, 那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就 很大了。因為二者出現(xiàn)的概率比是恒定的。3。維持就是只要養(yǎng)這種細胞，就要維持?？梢栽俚托荒軟]有。 或者隔一定時間從新使用篩選量壓一下, 我不知你是否干臨床, 想想 抗生素的用藥原則,反向思維一下,實際上我們在篩選耐藥株呀。4。neo的產(chǎn)物是酶，過高的G4 18濃度就要有更多的neo酶來支 持,否則細胞也要被毒死的, 而此時過多的酶要求會對細胞代謝造成 太大負擔(dān),細胞可能因此無法完成分裂與增殖,我們曾試過,即使在 同一轉(zhuǎn)染陽性細胞，在不同濃度的 G418 液中生長速度也不同，嚴重 形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的， 用米 氏方程理解吧。5。胰酶的作用不必理會，有的細