植酸酶活性的測定——鉬藍(lán)法(精)（精編版）

1、植酸酶活性的測定鉬藍(lán)法1 原理針對預(yù)混料復(fù)雜的物料體系，用不同的緩沖液對其進(jìn)行抽提，最大限度的減少飼料中無機(jī)磷，微量元素，多維及其他成分對植酸酶測定的影響，用鉬藍(lán)法對抽提液中植酸酶活性進(jìn)行定量。植酸酶在一定溫度和ph 條件下，水解底物植酸鈉生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性環(huán)境中與鉬酸銨顯色劑反應(yīng)生成藍(lán)色的（mo 2o3?moo 3）復(fù)合物，在波長700nm 下比色測定。酶活力單位定義：在37、 ph5.0 條件下，每分鐘從5.0mm 植酸鈉溶液中釋放出1 微摩爾的無機(jī)磷定義為1 個(gè)酶活力單位（u）2 試劑本規(guī)定中所用試劑，在沒有注明其它要求時(shí)，均指分析純試劑；所用溶劑和水無注明時(shí)，均指蒸餾水。清

2、洗實(shí)驗(yàn)用容器不要用含磷清洗劑。2.1 乙酸緩沖液a（ 0.25mol/l）： 稱取 14.355g 無水乙酸鈉，加入0.5gtritonx-100 和 0.5g 牛血清白蛋白， 900ml 水溶解，冰乙酸調(diào)ph 值至 5.00± 0.01，水定容至1000ml 。2.2 乙酸緩沖液b（ 0.25mol/l）：稱取 14.355g 無水乙酸鈉，加入1.0g 吐溫 -20 和 30gedta ，900ml 水溶解，冰乙酸調(diào)ph 值至 5.00±0.01，水定容至1000ml 。2.3 植酸鈉溶液 （ 6.25mmol/l ）：稱取 577.4mg 肌醇六磷酸鈉， 加入 574.

3、2mg 無水乙酸鈉， 90ml 水溶解， 冰乙酸調(diào)ph 值至 5.00± 0.01，水定容至100ml，現(xiàn)用現(xiàn)配（實(shí)際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0mmol/l ） 。2.4 終止液： 5%三氯乙酸（ 5%tca ）。2.5 1.5鉬酸銨（試劑a）： 7.5g 鉬酸銨溶于400ml 水中，慢慢加入22ml 濃硫酸，水定容到500ml ， 冰箱儲(chǔ)存，有效期1 個(gè)月。2.6 2.7硫酸亞鐵（試劑b）： 冰箱儲(chǔ)存，有效期1 個(gè)月。2.7 顯色劑： 移取 4 份試劑 a （ 2.5），1 份試劑 b （ 2.6 ）混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.8 磷酸二氫鉀： 稱量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸緩沖液

4、（ 2.2）配制 50mmol/l標(biāo)準(zhǔn)液，再用 50mmol/l配制成 4.0mmol/l 磷酸二氫鉀，溶劑為乙酸緩沖液（2.2），冰箱儲(chǔ)存。3 儀器設(shè)備恒溫水浴鍋，分光光度計(jì)（有10mm 比色皿），磁力攪拌器，渦流式混合器，酸度計(jì)（精確至小數(shù)點(diǎn)后兩位），離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速4,000rpm 以上），其它實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將 4.0mmol/l 磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙酸緩沖液（2.2）稀釋成 0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/l的溶液，按表1 的操作步驟一起反應(yīng)。以無機(jī)磷含量為縱坐標(biāo)（0.2ml 以上稀釋液無機(jī)磷含量分別為：0.00、0.16、 0.32、 0.

5、48、0.64、0.80mol ），以吸光值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出直線回歸方程（ y= k x+b ）。5 樣品測定5.1 試樣溶液的制備建議稱取5-10g 含酶飼料，精確至0.01g，置于 100ml 容量瓶中，加入乙酸緩沖液（2.1）定容（之前需充分?jǐn)嚢?0min ），取其中 2-10ml 置于另一100ml 容量瓶中用乙酸緩沖液（ 2.2）定容。稀釋的最終結(jié)果應(yīng)使樣液濃度保持在0.02-0.06u/ml. 左右，待反應(yīng)。65.2 反應(yīng)按下面的反應(yīng)順序進(jìn)行操作，在反應(yīng)過程中，從加入底物（2.3）開始，向每支管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對一致，37保溫 30min 。反應(yīng)步驟及試劑、溶液

6、用量見表a1。表 1反應(yīng)順序樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣品空白標(biāo)準(zhǔn)空白樣品稀釋液（ ml ）0.20.2乙酸緩沖液(2.2)（ ml ）0.237預(yù)熱 5min依次加入底物（2.3）（ ml）0.80.8（第二步）0.8（第二步）混合37保溫 30min依次加入終止液（2.4）（ ml）1.01.0（第一步）1.0（第一步）依次加入顯色劑（2.7）（ ml）1.01.01.0混合總體積（ ml）3.03.03.0a5.3樣品測定反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min ，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)上以4,000 rpm 離心 10min ，上清液以標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，在分光光度計(jì)700nm 波長處測定樣品空白（a0）和樣品溶液

7、（a）的吸光值， a a0 為實(shí)測吸光值。用直線回歸方程計(jì)算樣品植酸酶的活性。a6 結(jié)果計(jì)算和表示植酸酶活性u 按下式計(jì)算：u =k ×（a a0）×v× fs× m×30其中： u 樣品植酸酶活性，u/ g； k 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；f 樣品溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；s 樣品測試量，表1 中 s 0.2ml； v 反應(yīng)總體積，表1 中 v=1ml； m 試樣質(zhì)量， g；a0 測定樣品空白吸光值；a 樣品溶液吸光值；30 反應(yīng)時(shí)間， min 。兩個(gè)平行樣品的測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留整數(shù)。a7 允許差同一樣品兩個(gè)平行測定值的相對偏差不大于8。det

8、ermination of phytase activity molybdate-blue methoda1. principledetermination of phytase activityis based on the colorimetrical reaction between ammonium molybdate and free phosphorus which released from by the hydrolysis of phytate. the product solutionpainted inblueismeasured byspectrophotometer

9、at awave-length 700nm, the measured absorbency quantificates with the amount of free phosphorus.1 unit of phytase activity(u) is the amount of enzyme which releases 1 umol inorganic orthophosphate from substrate (sodium phytate ,50mm) at the temperature 37 and ph5.0 in 1 minute.a2. reagentsall the r

10、eagents used must be analyticalprue. detergents containing phosphate should not be used in washing container.a2.1. water distilled water, or equivalent.a2.2. buffer solution (0.1 mol/l) dissolve 5.742 g sodium acetic acid, 0.5 g triton x-100 and0.5 g bovine serum albumin in 900 ml water; adjust to p

11、h 5.0 with acetic acid (100%), and dilute to 1 l with water.a2.3. substrate solutiondissolve 577.4 mg sodium phytate (c 6h6o24p6na12) from rice (cat.no. p-3168, sigma chemical co., st. louis, mo) and 574.2 mg sodium acetic acid in 90 ml water, adjust the ph to 5.0 with acetic acid (100%), and dilute

12、 to 100 ml with water. prepare this solution fresh daily.a2.4. reaction stop solution trichloroacetic acid (5%).a2.5. ammonium heptamolybdate solution (solution a) dissolve 7.5 g ammonium heptamolybdate (n6h24mo 7o24.4h2o) in 400 ml distilled water, slowly add 22 ml sulfuric acid (98%), and dilute t

13、o 500 ml with water. this solution may be kept at 4 shielded from light for 1 month.a2.6. ferrous sulfate solution (solution b)ferrous sulfate (2.7%). this solution may be kept at 4 and shielded from light for 1 month.a2.7. color solution mix 100 ml solution a and 25 ml solution b. prepare this solu

14、tion fresh daily.a2.8. potassium dihydrogen phosphate stock solution prepare potassium dihydrogenphosphate to constant weight at 60before dissolving it to a final concentration of 4.0mmol/l using buffer solution (a2.2). prepare this solution fresh daily.a3. apparatusa3.1. waterbath: thermostatically

15、 controlled to 37.0 a3.2. ultraviolet-visible spectrophotometer0.1 by circula±ting water.a3.3. centrifuge: can be used at a relative centrifugal force of 3000g a3.4. ph metera4. preparation of standard solutions and curveprepare working standards of 0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/l potassium dihyd

16、rogen phosphate solution by serial dilution of stock solution (a2.8). carry out the procedure which described in table a1, and then plot the absorbance difference of the standard solutions (x-axis) against the corresponding exactly calculated amount of potassium dihydrogen phosphate (y-axis). draw t

17、he best fitting curve through the origin and give the regression equation (y=k x+b).a5. preparation of sampleit is suggested that weithted 5-10g enzyme sample ,place it in a volumetric of 100ml, adjust the volume to the mark by the acetate buffer solution and mix thoroughly.dilute the weighted sampl

18、e in duplicate (sample and blank) with buffer solution to the phytaseactivity within 0.03-0.08 u/ml.a standard sample with exactly calculated activity is recommended to be determined as the same procedure to test the accuracy.a6. assaythe assay is carried out according to the procedure in table a1.

19、in this procedure, interval of adding reagents to every tube should be the same after the substrate adding to the reaction solution.table a1proceduresample，standardssample blankstandards blanksample solution（ml ）0.20.2buffer solution（a2.2）（ml ） 0.25min at 37（ ml ）step）step）mixing30min at 37stop solu

20、tion（a2.4 ）（ ml）1.01.0（the first step）1.0（ the first step）color reagent（a2.7 ）（ml ）1.01.01.0mixingtotal volume（ml ）3.03.03.0substrate solution（ a2.3）0.80.8（the second0.8（the secondcentrifuge all the tubes for 10 min at 4,000 rpm before standing for 10 min at room temperature.measure the absorbance of samp（le a）and its blank（a0）at 700 nm with the spectrophotometerafter zeroing the instrument with standards blank of. determine the enzyme activity by r