StreptomycesflavogriseusNJ-4抗菌物質的結構鑒定及合成調控研究

1、Streptomyces flavogriseus NJ-4 抗菌物質的結構鑒定及合成調控研究近年來,隨著越來越多的耐藥細菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)耐萬古霉素腸球菌(VRE)和耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)等的不斷出現(xiàn)，人們在臨床 上迫切需要新的抗生素。在目前使用的抗生素中 ,2/3 以上是由放線菌產生的。本研究擬從土壤中篩選出產生抗菌譜廣、活性高、安全高效的放線菌菌株 , 通過生理生化特征和16S rDNA同源性分析對篩選到的菌株進行菌種鑒定；對其抗 菌物質進行分離純化和結構鑒定 ,通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高抗菌物質的產量 ,并對 抗菌物質的合成調控機理進行研究。研究結果如下 :1.

2、 廣譜抗菌活性放線菌的篩 選及菌種鑒定。從不同來源的土壤樣品中共分離得到 260多株放線菌,通過瓊脂塊法初篩及 搖瓶發(fā)酵法復篩從中篩選出 8株抗菌譜廣、活性高的菌株。其中菌株 NJ-4 對革 蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和霉菌都有顯著的抑制作用。通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特性分析 , 初步判定其屬于鏈霉菌屬的 黃灰鏈霉菌(Streptomyces flavogriseus) 。菌株NJ-4的16S rRNA基因序列與 Gen eBa nk中報道的S.flavogriseus ATCC33331 16S rRNA 基因序列同源性最高, 同源性達到 99%。通過菌株NJ-4的16S rRNA

3、基因序列構建系統(tǒng)進化樹,結果與S flavogriseus ATCC33331 在同一進化分支 , 菌株 NJ-4 鑒定為 Sfavo riseus 。 2.S.flavogriseus NJ-4 抗菌物質的分離純化和結構鑒定。S.flavogriseusNJ-4 以高氏合成 1 號培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基 , 發(fā)酵液中的抗菌 物質被乙酸乙酯萃取到有機相中 , 乙酸乙酯有機相通過真空旋轉蒸發(fā)旋干后 , 使用甲醇復溶得到抗菌物質粗提物,抗菌物質粗提物經(jīng)SephadexLH-20分離得到兩 個抑菌活性峰。第一個抑菌活性峰再通過RP-HPLC分離純化,得到3個抑菌活性峰丄C-MS結果表明第1個活性峰的分子

4、量為1269 m/z,第2個活性峰的分子量為 1271 m/z, 第 3個活性峰的分子量為 1255 m/z, 這 3個活性峰的分子量分別于放 線菌素類抗生素的放線菌素 X0B、放線菌素X2、放線菌素D分子量相同。通過MS測定Sephadex LH-20分離到的第二個活性峰的分子量為 214 m/z, 與全霉素的分子量相同。通過對分子量為 1255 m/z 和214 m/z 活性物質的紫外 圖譜、紅外圖譜和核磁共振圖譜進行分析可知 , 分子量為 1255 m/z 的活性物質為 放線菌素D;分子量為214 m/z的活性物質為全霉素；初步確定分子量為1269 m/z 和1271 m/z的活性物質這

5、兩個活性物質分別為放線菌素X0B和放線菌素X2。研究了放線菌素D和全霉素的抑菌譜及對 A549肺癌細胞、BGC-823胃癌細 胞和HepG2肝癌細胞的抑制活性，結果表明放線菌素D和全霉素對革蘭氏陽性細 菌金黃色葡萄球菌、 綠膿桿菌、 蠟樣芽胞桿菌、 藤黃微球菌和革蘭氏陰性細菌熒 光假單胞菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及癌細胞A549肺癌細胞、BGC-823胃癌細胞和HepG2肝癌細胞都具有顯著的抑制活性；放線菌素D對 黑曲霉、米曲霉、串珠鐮刀菌、禾谷鐮刀菌和匍枝根霉都有明顯的抑菌活性 ； 而 全霉素僅對串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌有抑菌活性 , 對黑曲霉、米曲霉和匍枝根霉 沒有抑菌活性。

6、 3.S.favogriseus NJ-4抗菌物質發(fā)酵工藝的優(yōu)化。首先對全霉素的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化 , 以高氏玉米粉培養(yǎng)基為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基 采用 Plackett.-Burman 試驗設計對影響全霉素產量的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的 關鍵因子進行篩選 ,結果表明 ,在所選取的 11 個相關因子中 ,對全霉素的產量有 顯著影響的關鍵因子為玉米粉、KN03和FeS04在Plackett-Burman試驗結果的 基礎上 , 采用 Box-Benhnken Design 響應曲面法對影響全霉素產量的 3 個關鍵因 子的最佳水平范圍及其交互作用進行優(yōu)化 , 并建立了預測模型方程。通過模型方程3D圖及等高線圖結

7、果顯示,在玉米粉21.5 g/L、KN031.3g/L 和FeS040.016g/L的條件下,得到了全霉素產量的最大預測值。在最優(yōu)條件下全 霉素的產量達到 31.27 mg/L, 全霉素的產量與優(yōu)化前相比提高了將近 1 倍。4. 蛋白胨對 S.flavogriseus NJ-4 全霉素合成影響的研究。在 S.flavogriseus NJ-4 發(fā)酵全霉素的過程中發(fā)現(xiàn) , 在高氏合成 1 號培養(yǎng)基中蛋白 胨添加量達到 0.3%及以上時能夠完全抑制 S.flavogriseuS.NJ-4 合成全霉素。通過熒光定量PCF測定了蛋白胨對S.favogriseusNJ-4全霉素合成酶基因表 達的影響,結

8、果表明蛋白胨使 S.favogriseS.NJ-4 全霉素合成酶基因的表達顯著 下調。全霉素的合成還受培養(yǎng)基氧化還原電位的影響 , 使用氧化還原電位測定儀 測定了高氏合成 1 號培養(yǎng)基中蛋白胨添加量對發(fā)酵過程中培養(yǎng)基氧化還原電位 變化的影響,結果表明隨著高氏合成 1 號培養(yǎng)基中蛋白胨添加量的增加 ,培養(yǎng)基 的氧化還原電位顯著下降 ; 培養(yǎng)基氧化還原電位的下降 , 對全霉素的合成起到了 抑制作用。氧化還原電位的態(tài)勢影響菌體中輔酶的形態(tài)。 在高氏合成 1 號培養(yǎng)基中添加 蛋白脎降低了培養(yǎng)基的氧化還原電位 ,培養(yǎng)基氧化還原電位的降低使S.flavogriseusNJ-4 菌體中NAD/NAD和NAD

9、P/NADP的比值下降，即菌體中氧化 型輔酶NAD和NADP含量降低,還原型輔酶NADH和NADPI含量增加。5. 通過代謝組學的方法研究蛋白胨抑制全霉素合成的調控機理。 使用氣相色 譜-質譜聯(lián)用技術測定了在高氏 1 號培養(yǎng)基中添加蛋白胨對 S.flavogriseusNJ-4代謝產物的影響,并通過SIMCA軟件進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二 乘法-判別分析(OPLS-DA多維統(tǒng)計分析,篩選特征性代謝產物結果表明在高氏 1 號培養(yǎng)基中添加蛋白胨使 S flavogriseusNJ-4 代謝產物 核糖醇(Ribitol)、琥珀酸(Succinic acid)、磷酸根(Phosphate)、N-乙酸-B -D- 甘露糖胺(N-Acetyl-beta-D-mannosamine)