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文檔簡介

1、利用rapd分子標(biāo)記鑒定甜瓜、苦瓜種子純度陳金體巫峽王曉峰摘要:甜瓜、苦瓜是華南地區(qū)兩種重要的水果蔬菜栽培品種,具冇較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。木 實驗以甜瓜、苦瓜種了為材料,通過改進種了 dna的ctab提取方法和優(yōu)化rapd-pcr各因了(模板 dna濃度、引物濃度、dntps濃度、m尹濃度、退火溫度、反應(yīng)循壞數(shù)),為實驗室建立了較為穩(wěn)定快 速可靠的水果蔬菜種子純度rapd檢測方法,為今后水果蔬菜rapd指紋建立打下基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:甜瓜苦瓜rapd分子標(biāo)記種了純度中國圖書資料分類號 文獻標(biāo)識碼甜瓜(cucumis melo l.)是葫蘆科cucurbitaceae)甜瓜屬中幼果無刺的栽培種,一

2、年生蔓性草 木植物,染色體數(shù)2n二2x=24,果實香甜,分為網(wǎng)紋甜j var. reticulatus naud.)、硬皮甜瓜 (raz; cantalupensis naud.)、冬甜瓜(var. in odor us naud.)、觀賞甜瓜(拠 z: dudain naud.)、檸檬 瓜(var. chi to naud.)、菜瓜(var. flexuosus naud.)、香瓜(var. makuwa maki no)、和越瓜(回:conomon maki no)等8個變利苦瓜o伽】ord i ca c haran t i a) 乂名涼瓜,一年牛.蔓性蔬菜,染色體數(shù)2n=2x=22, 含

3、糖首量高,按果實形狀和表面特征分為長圓錐形和短圓錐形兩類。前者如廣東滑身苦瓜、長身苦瓜 和長江流域的口苦瓜,后者如廣東人頂苦瓜,均是優(yōu)良的栽培品種。種了純度(genetic purity of seeds)檢測是指鑒定提供檢樣品屮木品種的種了數(shù)占提供檢樣 品總數(shù)的百分比。鑒定-批種子所屬品種、利或?qū)倥c標(biāo)簽上的標(biāo)明是否相同,是否名副其實稱為品種 真實性(genuineness of variety)鑒定。低純度、真實性差的種子將給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來極大的損失。 為了防止假種子事件發(fā)生,保護廣大農(nóng)民的利益,提高和控制我國種子公司的種子質(zhì)量,建立簡便、 快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的種子純度檢測方法已勢在必行。199

4、0年來,rapd (random amplified polymorphic dna)隨機擴增多態(tài)性dna標(biāo)記,已被證明是 植物系統(tǒng)學(xué)、分類與鑒定研究的一個有川而簡便的工具九役它是利用人工合成的隨機寡聚核昔酸片斷 (910bp)作為引物,用未知序列的基因組dna為模板,通過pcr擴增后,得到具有多態(tài)性的dna1 一作者簡介:陳金體(1983-12),女,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院02級生物技術(shù)專業(yè),本科在讀。 片斷。rapd標(biāo)記數(shù)量多,可以覆蓋基因組中所冇位點,rapd標(biāo)記是顯性的,不能區(qū)別生物個體基因 型是純合型述是雜合型的。該方法的優(yōu)點主要是快速簡便,無放射性污染,成本較低,分辨率高,靈 皺

5、度強,但由于其涉及到多種微量成分參加反應(yīng),會出現(xiàn)重復(fù)性差等一些問題。我們對pcr-rapd 中各關(guān)鍵因子進行了研究,根據(jù)自身實際,建立了一種比較簡便快速,穩(wěn)定準(zhǔn)確的蔬菜種子純度和品 種真實性的檢測方法。1.實驗材料與方法1. 1實驗材料本文所試11個甜瓜品種、12個苦瓜品種,皆購自種子市場,詳細(xì)信息如表1、表2:表1 11個甜瓜品種信息tab. 1 profiles for 11 cucumis melo l. types in the research品種品種特性果實近圓形,成熟時果皮成黃白色;果肉白綠色、肉厚、質(zhì)細(xì)而脆果味醇香,汁多 運蜜一號適口;長勢健壯,綜合抗性好。一代交配,耐濕、耐熱

6、,適應(yīng)性強,抗蔓割病。果空豐滿整齊,果皮光滑,白綠微 新解甜瓜帶黃色,肉色淡白綠,肉質(zhì)松脆。一代交配梨甜瓜(美濃瓜),結(jié)果力強。果實豐正微扁球型,成熟時皮 銀輝色銀口,不易裂果,肉色淡口綠,肉質(zhì)松爽細(xì)嫩,香甜可口。一代交配,早生強健,耐濕、耐熱,結(jié)果力強,果皮銀白色稍帶黃色,肉質(zhì)松脆可 新玉甜瓜口,果梗不易脫落,不易裂果,抗蔓割病及病毒病。原種,早熟品種,果實圓形,大而周正,果皮白色,質(zhì)脆爽口,味香甜,抗逆性強, 白沙蜜耐貯運。從白沙蜜屮歷經(jīng)三年套袋提純的白瓜。高抗病毒、霜霉、枯萎,早熟,果型人而均 白雪一號7 勻,雪白透亮,香甜可口。白雪一號與國外材料雜交定向選育,高抗病毒、霜霉、白粉、枯萎

7、,果圓型,籽、 賽雪皐后肉均口色,皮雪口透亮,果實清脆爽口,味香甜,耐貯運。果肉脆,果皮韌,耐貯運,植株長勢旺,果皮白綠色,果面冇淺條紋,成熟后略變 津甜一號黃。肉色淺綠,口感酥脆,風(fēng)味好。一代交配,果實近圓球型,皮色白綠,果肉青翠,甜度高,肉質(zhì)松脆,座果高,不 一灣青玉易裂果霉?fàn)€,抗病力強。雜交一代,果實蘋果型,果皮綠白色微透黃亮,果肉清脆香甜,易座瓜,抗病強,傲雪碧玉不易裂果、爛瓜。果實近似圓球型,皮色口綠,果肉青翠,甜度高肉質(zhì)松脆,座果高,豐產(chǎn),不易裂h本甜寶果霉?fàn)€,抗病力強。表2 13個苦瓜品種信息tab. 1 profiles for 13 momordica charantia t

8、ypes in the research品種品種特性旺優(yōu)大厚肉2號雜交一代,果實碩大,近圓柱狀,皮色淺綠,h有光澤,果肉豐厚致密,耐貯運,ihi質(zhì)優(yōu),產(chǎn)最最高的汕瓜新品種。南珠苦瓜雜交一代,瓜形大,皮色油綠冇光澤,柳條粗直,外觀美觀,肉厚、質(zhì)脆。雜交一代,屮熟,耐熱,豐產(chǎn),長勢旺盛,瓜人,長紡錘型,皮色淺綠,瓜形均勻綠華夏(668)一致,抗逆性強。代交配,長身油瓜,條瘤粗直厚大,瓜肩稍平,瓜底較鈍,味濃郁,是目前最早綠中寶熟的汕瓜。雜交一代,油綠苦瓜,中早熟,瓜頭尾勻稱,形狀美觀,味林爽口,微苦,結(jié)瓜多,檳優(yōu)一號延收期長。岀口型,早熟、耐寒、耐熱、耐濕、長勢旺盛,高抗枯萎病、口粉病,箱霉病,抗

9、泰國大肉王逆性強,瓜長棒形,頭尾均勻,高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。一代交配,原種從臺灣引進,瓜長棒形,具有早熟、高抗病、瓜碼密、肉厚、豐產(chǎn)臺灣翡翠等優(yōu)點,是目前蔬菜基地理想的首選品種z。早生長身苦瓜,臺灣品種,機旱生,生長強健,豐產(chǎn),果實出長形,果色玉白帶綠高華色,果面細(xì)吃刺瘤突起平滑,略有肋條。原種美國引進的一代雜交種,抗低溫弱光能力強,極耐熱耐澇,喜大水大肥,掛長美工綠劍圓棒型,瓜身堅實,空心極小,周身不滿疙瘩,刺瘤豐滿可愛,微苦、lt脆。瓜圓林形,較粗實,色澤綠口亮凈,縱瘤明顯,表面麻子均勻,品質(zhì)優(yōu)良,能適應(yīng)長白苦瓜全國各地春秋栽培。鼎豐大頂瓜圓錐形,翠綠有光澤,條紋粗直。具有高產(chǎn),瓜形美,快人,肉厚不易

10、裂,翠綠。 雜交一代大頂苦瓜,耐熱,主側(cè)蔓均可結(jié)瓜,果實圓錐形,頂特大,肉特厚,瘤條翠綠一號粗直,皮色油綠且有光澤,最適宜出口。代交配,生長勢強,瓜短圓錐形,條瘤初有,瓜形美觀,皮綠有光澤,肩平人、 五山黑籽大頂肉厚且致密,耐貯運。1.2主要儀器設(shè)備5415r型eppendorf高速冷凍高速離心機、渦旋器(scientific industries, tnc.)>電泳儀(大連 捷達 jmx, scientific instruments)> pcr 儀(mj research ptctoo)、微波爐(national)> 數(shù)顯 恒溫水浴鍋(國華電器hh-l)、-20°

11、;c低溫冷柜(sanyo)、磁力攪拌器(六一儀器廠)、培養(yǎng)皿、恒溫 培養(yǎng)箱、烘箱、研缽、通風(fēng)櫥。1.3主要試劑三疑甲基氨棊甲烷(tris)、乙二胺四乙酸(edta)、十六烷基三甲基滉化鞍(ctab)、硼酸、聚乙 烯毗咯烷酮(pvp)、p一疏基乙醇、氯化鈉(nacl)、鹽酸、氫氧化鈉(naoh)為國產(chǎn)分析純;瓊脂糖 為sigma公司產(chǎn)品;dl2000 dna maker> taq酶、dntp> mg2+為日本takara寶生物工程(大連)有限 公司產(chǎn)品,taq酶北京天為時代科技有限公司的。1.4實驗方法1.4. 1 d7a提取緩沖液的配制dna 提取緩沖液配制:稱取 ctab 4 g

12、, tris 2. 42 g, edta 1. 169 g, nacl 16. 38 g, pvp 4g 溶 于160 ml雙蒸水中,用鹽酸調(diào)ph值到8.0,并用雙蒸水定容到200 ml,裝入棕色瓶中,11公斤/ 平方厘米滅菌20分鐘。4°c保存。使用前,預(yù)熱至65°c,取出適當(dāng)體積,加入1%體積比的b疏基乙醇。1.4.2 dna的提取宙叫以苦瓜種了為參考,甜瓜種了稍小,加樣蜃略少)選取一粒種子,剝売,在研缽上先用液氮迅速磨至粉狀,轉(zhuǎn)移至1.5 ml滅菌離心管屮,加入500)11 預(yù)熱至65°c的種子dna提取緩沖液洗滌研缽,離心管中混勻。混合溶液于65°

13、;c水浴孵育15 niirio向上述反應(yīng)體系中加入0.25倍體積(即125gl)酚/氯仿/異戊醇(25/24/1),混勻,12000 rpm, 室溫離心10 mine取上清液再按相同方法用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提一次。將上清液轉(zhuǎn)移至新的1. 5 ml滅菌離心管中,加0. 6倍體積冷的異丙醇,混勻,12000 rpm 4°c離心 6 min。加70%乙醇1 ml,洗滌沉淀2次,12000 rpm離心1 min。棄上清,風(fēng)干總dna。加滅菌的lxte20pl溶解,在4°c下貯藏備用,或在-20°c下長時間保存。(提取時間約為40 min)1.4.3 pc

14、r反應(yīng)條件的優(yōu)化1.4.3. 1初始擴增反應(yīng)pcr反應(yīng)液的總體積為25卩1,其組成如下表表3 pcr-rapd初始反應(yīng)體系tab.3 pcr-rapd initial systempcr反應(yīng)液的組成反應(yīng)液中的用量dna template (約 30 ng)1 mtaq dna polymerase (5 u/l)o.2 mloxreaction buffer (mg)2.5 mdntp mixture (2. 5 mm)1.5 mprimer (1 pm)1 mmgcl2 (25 pm)2.o mddh.0add to 25 alpcr反應(yīng)條件如下:94°c預(yù)變性3 min;94&#

15、176;c變性 1 min, 37°c復(fù)性 1 min, 72°c延伸 2 min, 40 個循環(huán);72°c延伸 10 min;4°c保存。1.4. 3.2反應(yīng)混合物中各組分濃度搭配的篩選1.4. 3. 2.1單因素實驗設(shè)計法(苦瓜)1.4. 3. 2. 1. 1退火溫度優(yōu)化在初始擴增體系下,嘗試變化退火溫度,以求獲得最大數(shù)量和最清晰的多態(tài)dna。嘗試的追火溫度:34°c, 35°c, 36°c, 37°c, 38°c, 39°c, 40°c, 41°c, 45°c

16、, 48°c。1.4. 3. 2. 1.2 引物濃度的優(yōu)化在最優(yōu)退火溫度下,嘗試變化引物濃度,其它反應(yīng)條件不變。嘗試的引物濃度:6 網(wǎng)/1, 8 mm/1,10 m1/1,12 網(wǎng)/1, 14 pm/lo1.4. 3. 2. 1.3 dntps 濃度的優(yōu)化在最優(yōu)退火溫度、引物濃度條件下,嘗試變化dtps濃度,其它反應(yīng)條件不變。嘗試的 dntps 濃度:100 pm/1, 150 m/1,200 mm/1,250 剛/1, 300 網(wǎng)/1。1.4. 3. 2. 1.4 模板濃度的優(yōu)化確定了最優(yōu)退火溫度、引物濃度、dntps濃度后,嘗試變化加入的模板量,其它反應(yīng)條件不變。 根據(jù)與mark

17、er dl2000電泳條帶比較,可估算加入每管反應(yīng)的模板梯度量為為:10 ng, 20 ng, 40 ng, 80 ng, 160 ng, 320 ng。1. 4. 3. 2. 1. 5 taq dna polymerase 濃度的優(yōu)化建立了最優(yōu)退火溫度、引物濃度、dntps濃度、模板濃度后,還需:要對taq dna polymerase濃 度進行調(diào)整,其它反應(yīng)條件不變。嘗試對每個不同的反應(yīng)管加入不同taq dna polymerase量:0.25 u, 0. 5 u, 1 u, 1. 5 u。1.4. 3. 2. 1.6 mg"濃度優(yōu)化在以上最優(yōu)條件下,対濃度進行實驗,其它反應(yīng)條件

18、不變,嘗試以下的濃度梯度:1.5mm/l, 2. 0 mm/1, 2. 5 mm/1, 3.0 mm/1, 3. 5 mm/1, 4.0 mm/lo1. 4. 3. 2. 1. 7 pcr-rapd擴增循環(huán)數(shù)優(yōu)化基本確定了最優(yōu)pcr擴增體系后,還需要對擴增循壞數(shù)進行優(yōu)化,嘗試了一下兒個循環(huán)數(shù):30, 35, 40, 45, 50o1.4. 3. 2. 2. 1正交實驗設(shè)計法(甜瓜)采用u (34)正交實驗設(shè)計,對dtp mixture濃度、引物濃度、mg"濃度、taq dna聚合酶濃度進行了篩選,找出最佳組合。試驗屮設(shè)兩個重復(fù),還有一個空白對照。方案如卜i表4各組分濃度水平tab.

19、4 concentration of every reaction elements水dntp mixture(mi)primer(mm)(mm )taq dna polymerase(u)1500.21.51.021000. 32.01.531500.42.52.0表5各組分正交設(shè)計方案tab.5 design of orthogonal experiment表頭設(shè)計dntp mixtureprimermg*taq dna polymerase號處理1 (mm)2 (ml)3 (mm)4(u)11 (50)1 (0.2)1 (1.5)1 (1.0)21 (50)2 (0.3)2 (2.0)2

20、 (1.5)31 (50)3 (0.4)3 (2.5)3 (2.0)42 (100)1 (0.2)2 (2.0)3 (2. 0)52 (100)2 (0.3)3 (2.5)1 (1.0)62 (100)3 (0.4)1 (1.5)2 (1.5)73 (150)1 (0.2)3 (2.5)2 (1.5)83 (150)2 (0. 3)1 (1.5)3 (2. 0)93 (150)3 (0.4)2 (2.0)1 (1.0)1.4. 3. 2.2模板dna濃度優(yōu)化還通過瓊脂糖電泳檢測dna濃度,對pcr體系中dna濃度進行了優(yōu)化,dna濃度分別為10 ng,約 15 ng,約 30 ng,約 60

21、ng,約 120 ng。1.4. 3.2.3退火溫度優(yōu)化再次進行了退火溫度的優(yōu)化,所用溫度為35°c, 36°c, 37°c, 38°c, 39°c, 40°c。1.4.4 pcr反應(yīng)引物的篩選在敲優(yōu)的擴增條件下,對pcr反應(yīng)引物進行篩選。引物由上海生工生物公司合成。木文所篩選的引物如下表:表6 rapd分子標(biāo)記所用的引物tab.6 primers in the researchsan gon編號序列(5'to 3')w97107ggt ccc tga cw97284cat ccc cot gw97286tgc gcc

22、 ctt cw97287tgc tct gcc cw97288ggt gac gca gw97290tgg ggg act cw97291ctg ctg gga cw97294cat ccc cgc tw97295ttcc gct ctg gw97302ccc aag gtc cw97303ggt gcg gga aw97224cag agg tcc cw97225cac ccc ctt gw97230tcc tgg tcc cw97232agt cgg gtg gw97237agg ggg ttc cw97238tgg gga cca cw97255ccc ctc acg aw97246tc

23、c gag agg gw97247acg ccc agg tw97248gaa gcc agc cw97249gga cgg cgt tw97251gga cct gct gw97253acc ccc cac tw97255aga tcc cgc cw97256cag tgc cgg tw97260ggg tgt gca gw97263cat cgc cgc aw97266ggc tgc gac aw97270agc agc gca cw97274ggg tot cgg tw97276agt cgc cct tw97280tga ggg tcc c1.4.5種子純度和真實性檢測木實驗的最終h的

24、是找到快速簡便、穩(wěn)定可靠的種了純度和真實性檢測。建立在良好的反應(yīng)體系, 特異的多態(tài)性引物基礎(chǔ)上,pcr-rapd將是一個很好的選擇。方法是,按照本實驗摸索的種子dna提取法,pcr-rapd擴增條件,特異引物對某一假設(shè)蔬菜品種 進行檢測。本實驗首先対某一甜瓜品種進行了檢測。這一過程在數(shù)小時內(nèi)即可完成。今后如果建立了足夠大的rapd分子文庫,這樣的檢測手段將會變得更加全面和高效。1.4.6瓊脂糖凝膠電泳取5a1pcr擴增產(chǎn)物,加入1 w 6x loading buffer,點樣板上混勻,進行點樣。膠濃度為14%。電泳時,先把電壓調(diào)至140 v左右,待樣品跑出點樣孔后,再調(diào)節(jié)電壓至100 v (約

25、35v/cm), 電泳40 min左右即可取出凝膠,在bi0-rad凝膠成像系統(tǒng)上打描成像并保存。2結(jié)果與分析2.1甜瓜種子的外觀形態(tài)圖1 11個胡種甜瓜的種子圖fig. 1 11 cucumis melo l. seed appearance圖2 13個品種苦瓜的種子圖fig. 2 13 momordica charantia seed appearance從圖不難看到,11個甜瓜品種的種子在形狀上很相似,皆為橢圓形,在種子大小和顏色上有一定 的差別,但差別不明顯。因此,利用甜瓜種子的外觀形態(tài)特征不可能將11個品種區(qū)別開??喙戏N子的 外觀形態(tài)區(qū)別稍大,但亦難直接通過形態(tài)標(biāo)記來區(qū)分每一種類和種

26、內(nèi)的純度。分子標(biāo)記能反映生物 個體或種群間基因組中某種差異特征的dna片段,它直接反映基因組dna間的差異。pcr-rapd 分子標(biāo)記是檢測的一個重要手段。2.2提取的苦瓜dna圖取提取的1.5 m dna、3.5 m蒸憾水、1 m 6xloading buffer,點樣板上混勻,進行點樣。提取的dna質(zhì)量如下圖所示:圖3提取的苦瓜dna圖(ex代表提取的苦瓜dna, m為dl2000 marker)fig.3 dna extraction from momordica charantia(ex: extracted dna from momordica charantia m: dl2000

27、 marker)2.3 pcr反應(yīng)體系的優(yōu)化2. 3. 1 pcr反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化退火溫度低,引物和模板結(jié)合特界性較差,出現(xiàn)的條帶可能增多;退火溫度高,引物和模板結(jié)合特異性增加。在pcr-rapd屮,退火溫度尤為重耍,因此本實驗対退火溫度做了大量的研究。一灣青玉新玉甜瓜圖4不同的退火溫度対兩個甜瓜品種rapd結(jié)果的影響(甜瓜)引物:w97291;模板:灣青玉,新玉甜瓜;m: dl2000 dna markerfig4 rapd results of different annealing temp. (cucumis melo l.)primer: w97291; template: yid

28、aiqingyu, xinyu; m: dl2000 dna markerm 34t 35t 36c 37t 38t 39c 妣 41t 45t 48t 圖5不同的退火溫度對rapd結(jié)果的影響(苦瓜)引物:w97107;模板:五山黑籽大頂;m: dl2000 dna markerfig.5 rapd results of different annealing temp. (momordica charantia)primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker圖4、5中可以看到不同的退火溫度的條件卜,擴增帶區(qū)別明顯。對于甜

29、瓜,39°c、40°c的兩個處 理在兩個甜瓜品種中能擴增出5條帶,條帶的量大,穩(wěn)定性好。這兩個都可以作為較佳退火溫度,接 下來的甜瓜實驗選用39°c為退火溫度。對于苦瓜,36°c、40£、41°0都是較好的選擇,結(jié)合甜瓜實驗 和其它引物的擴增情況,最后選取/ 40為以后實驗的退火溫度。2.3.2引物濃度的優(yōu)化m 6810 12 14 ck圖6不同的引物濃度對rapd結(jié)果的影響(苦瓜)引物:w97107;模板:五山黑籽大頂;m: dl2000 dna markerfig. 6 rapd results of different prim

30、er concentration (momordica charantia)primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker引物濃度對rapd擴增質(zhì)量的影響還是比較明顯的。引物如果濃度過低,則無法與所冇模板dna結(jié) 合,影響擴增質(zhì)量;如果濃度過高,則引物二聚體的形成會降低擴增的有效性從圖6看到,從 10mi/l后出現(xiàn)了一條特異擴増帶,結(jié)合條帶清晰和成本考慮,故選擇10m 引物濃度為以后苦瓜rapd 的主要濃度。2. 3. 3 dntps濃度的優(yōu)化圖7不同的dntps濃度對rapd結(jié)果的影響(苦瓜)引物:w97107 ;模板:

31、五山黑籽大頂;m: dl2000 dna markerfig. 7 rapd results of different dntps concentration (momordica charantia)primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker作為pcr反應(yīng)的原料,dntps的濃度直接影響擴增產(chǎn)物的牛成。隨著dntps濃度的升高,擴增產(chǎn) 物亦增加;但是濃度過高時,dntps容易與mh結(jié)合,降低taq酶活和產(chǎn)物的生產(chǎn)。因此,必須選擇合適的dntps的濃度。如圖7, 200 mm/l擴增帶最多尺清晰,所以木實驗的苦瓜部分選

32、擇200 mm/l為主要的dxtps反丿應(yīng)濃度。2. 3. 4 dna模板濃度的優(yōu)化>10 15 30 60 120 m圖8模板濃度(單位:ng)対rapd的影響(甜瓜)引物:w97291;模板:日本甜寶;m: dl2000 dna markerfig8 rapd results of di fferent template conccntration (cucumi s me io l.)primer: w97291; template: rriben tianbao; m: dl2000 dna markerm 10 20 40 80 160 320m 10 20 40 80 160

33、 320 ck圖10模板濃度(單位:ng)對rapd的影響(苦瓜)圖9加入的模板濃度梯度(單位:ng)(苦瓜)引物:w97107;模板:五山黑籽大頂;m: dl2000 dna markerfig.9 template concentration in ng (momordica charantia)fig 10 rapd results of differont template conccntration (momordica charantia)primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker述采用曰木甜寶品種對模板d

34、na濃度進行了優(yōu)化(圖9)。對于rapd擴增進行了不同dna濃度的 試驗,過低或過高的dna濃度均導(dǎo)致沒有擴增產(chǎn)物,只有理想的dna濃度才能產(chǎn)生可重復(fù)性的rapd 指紋。從結(jié)果中可以看到dna濃度小于10 ng時,沒有擴增的帶;dna濃度約為15 ng時擴增的帶比 較模糊不清;dna濃度約為30 ng、60 ng. 120 ng時,擴增出來的帶都比清晰。但考慮到dna的用量, 最佳的選擇就是30 ng。苦瓜相似的實驗在五山黑籽人頂中進行,從10ng160ng,均有比較漂亮的擴增帶。320ng開始, 擴增特弄性變化。所以,認(rèn)為40ng左右的模板dna量是較好的選擇。m 0.25 0.50 1.0

35、0 1.502. 3. 5 taq dna polymerase 濃度的優(yōu)化丄單位(u)圖11酶量對rapd的影響(苦瓜)引物:w97107;模板:五山黑籽大頂;m: dna marker (dl2000)fig. 11 rapd results of different taq polymerase concentration (momordi ca charant id)primer: w97107; template: wushanheizi, xinyu; m: dl2000 dna markertaq dna polymerase可以認(rèn)為是整個pcr-rapd屮最為重要的因子,其活性

36、與川量決定著擴增質(zhì)量的根本。圖11中0.25u, 1.0u, 1.5u四個實驗濃度均有擴增帶,0.5u沒有岀現(xiàn)擴增帶很可能是實驗錯謀操作所致,與酶最無關(guān)。但考慮到成木及穩(wěn)定性,選用1.0u的酶量,這與許多其它文獻的報導(dǎo)一致。2. 3. 5 mg"濃度的優(yōu)化m 1.5 22.5 10 3.5 4單位(mm/l)圖12 mg?濃度對rapd的影響(苦瓜)弓i物:w97107;模板:五山黑籽大頂;m: dna marker (dl2000)fig.11 rapd results of different mg" concentration (momordica charantia

37、)primer: w97107; template: wushanheizi, xinyu; m: dl2000 dna marker雖然在pcr屮主要的功能是與taq酶結(jié)合,促進反應(yīng)的進行。但是,過高濃度的mg'也會與 其它反應(yīng)成分作用,如dntps、dna模板等,影響反應(yīng)的順利進行。所以,合適的卜濃度很重要。圖 12中陸離子實驗濃度區(qū)別不大,最后選擇1.5 mm/l的。2.3.6 pcr-rapd擴增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化當(dāng)實驗各組分的反丿應(yīng)濃度基木確定示,減少所需的反應(yīng)擴增時間是提高rapd檢測有效性的一個 重要手段。到目前為止,此部分實驗還在進行當(dāng)屮。2.3.7對dntps mixtur

38、e、引物、mg2 taq dna聚合酶的濃度的正交優(yōu)化實驗采用l9 (34)正交實驗設(shè)計,以一灣青玉品種研究了不同dntp mixture、引物、mg"和taq dna 聚合酚的濃度對pcr結(jié)果的影響。ck是用雙蒸水代替dna,檢驗各成分中有沒有被dna污染的。處理 號參照本文表5。正交表中的處理號112233445566778899 ckm圖13不同的濃度組合對rapd的影響引物:w97291;模板:一灣青玉;ck:空白對照;m: dna marker (dl2000)fig.13 results in the orthogonal experimentsprimer: w9729

39、1; template: yiwanqingyu; m: dl2000 dna marker圖13的結(jié)果表明,在9個處理中,主要的4大影響因索因濃度組合不同,擴增效果差異比較明顯。 處理6、8岀現(xiàn)不能重復(fù)的現(xiàn)象。為避免偶然性,分別對其進行了重復(fù)試驗,兩個處理都沒有出現(xiàn)不能 擴增的現(xiàn)彖。在所有組合中,各個組合多態(tài)性都比較好,都具有3條或以上的帶。但是考慮到實驗的 重復(fù)性,帶型的清晰度等因素,還要考慮到taq dna聚合酶川量,授后決定選擇處理9。處理9的譜帶 清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高,是九個處理中最理想的濃度組合:即反應(yīng)總體積25其中含10x擴增緩沖液 2. 5 m, mg2 + 2 mm/l,

40、 dntp mixture 150 mm/l,引物為 0.4 m-m/l, taq dna 聚合酶 1 u,模板 dna量為30 ng, -h他成分為無菌蒸餡水。2.4 pcr反應(yīng)引物的篩選隨機引物數(shù)量多,而且并不是所有的隨機引物都具有特-wo因此,必須進行引物篩選,找到具冇特異性的隨機引物來進行種了純度鑒定。本實驗對11種甜瓜品種進行了篩選。圖14引物w97274的pcr擴增結(jié)果圖15引物w97225的pcr擴增結(jié)果fig.14 results with w97274 primerfig.15 results with w97225 primer圖16引物w97255的pcr擴增結(jié)果圖17引

41、物w97295的pcr擴增結(jié)果fig.16 results with w97255 primerfig.17 results with w97295 primer圖18引物w97276的pcr擴增結(jié)果fig.18 results with w97276 primernote: al 1 markers above are dl2000 dna marker引物w97274在11個品種中可以擴增出5條或以上的帶。在白沙蜜、白雪一號和賽雪皇后3個品 種屮可以明顯看到多了一條特征帶。因而,引物w97274將11個陽種分成兩類:運蜜一號、新輝甜瓜、 銀輝、新玉甜瓜、津甜一號、一灣青玉、傲雪碧玉和日本甜

42、寶一類,白沙蜜、白雪一號和賽雪皇后一 類。引物w97225可以將一大類分成了三小類:運蜜一號和新輝甜瓜一類,銀輝、新玉甜瓜和日本甜寶 類,還冇津甜一號、一灣青玉和傲雪碧玉一類。再用引物w97255已經(jīng)可以將運蜜一號和新輝甜瓜區(qū)分開,將li木甜寶與銀輝、新玉甜瓜區(qū)分開, 將傲雪碧玉與津甜一號、一灣青玉區(qū)分開,將白沙蜜與白雪一號、賽雪皇后區(qū)分開。另外再用引物w97295可以將銀輝、新玉甜瓜區(qū)分開,將白雪一號、賽雪皐后區(qū)分開。用引物w97276將津甜一號、一灣青玉區(qū)分開。就這樣,通過這5個具有特異性的引物就可以將 11個薄皮的甜瓜品種區(qū)分開。因此,通過使用引物w97274、w97225、w97255

43、. w97295和w97276,我們可以將所試11個甜瓜品種逐一區(qū)分開,具體見圖10所示呵:w97274w97225w97255w97295w97255運蜜一號新輝甜瓜廠銀輝1新玉甜瓜日本甜寶w97276津甜一號w97255一灣青玉傲雪碧玉w97255白沙蜜w97295白毛1-賽雪皇后圖19 11個甜瓜品種的分析圖fig. 19 analysis process of 11 cucumis melo l.苦瓜這部分的實驗也正在進行當(dāng)小。2. 4甜瓜種子純度的檢測根據(jù)特界引物,我們可対某一甜瓜品種進行純度和真實性檢測。j圖20甜瓜種了純度檢測引物:w97295;模板:銀輝;m: dna mark

44、er (dl2000)fig. 20 result of the cucumis melo【“seeds purity testingprimer: w97295; template: yinhui; m: dl2000 dna marker圖21甜瓜種子純度檢測引物:w97295;模板:銀輝;m: dna marker (dl2000)fig. 20 another result of the cucumis melo l. seeds purity testingprimer: w97295; template: yinhui; m: dl2000 dna marker通過rapd的快速檢

45、測,可知檢測的種子純度約為83. 3%o3討論由于rapd是胃接以基因纟fl dna為模板擴增的產(chǎn)物,所以用rapd分了標(biāo)記方法鑒定的結(jié)果可 靠,不受環(huán)境的影響。rapd標(biāo)記涉及pcr反應(yīng)屮的變性、退火、延伸的溫度和時間,以及反應(yīng)過程 循環(huán)數(shù),反應(yīng)體系中的多種試劑來源、濃度,mg?+濃度、模板dna的量和純度等諸多因素的影響。因 此,有的學(xué)者認(rèn)為rapd靈敏度高,但可重復(fù)性差。但本研究表明:只耍反應(yīng)條件適當(dāng),反應(yīng)體系中多 種試劑來源和濃度保證一致并嚴(yán)格控制反應(yīng)程序的各個環(huán)節(jié)及各個循環(huán)參數(shù)的穩(wěn)定性,重復(fù)結(jié)果是不 難得到的。在pcr反應(yīng)程序中,退火溫度的影響最為明顯。由于rapd是尋找特異性擴增帶

46、的過程, 所以合適的退火溫度尤為重要。根據(jù)實驗情況,39°c. 40°c是很好的選擇。其它程序像變性、復(fù)性和 擴增的溫度、時間以及循環(huán)的次數(shù),變性和延伸溫度等對實驗的影響相対退火溫度而言較少。至此, 本實驗基本上以完成了對pcr-rapd反應(yīng)條件的摸索,建立在各最優(yōu)濃度和組合下的rapd反應(yīng),有 效性和穩(wěn)泄性均有較好的保證。rapd 分析應(yīng)用于厚皮甜瓜 british queen> earps favouritecrenshaw> pak istan2981)卩習(xí)及 earl's favourite的3個品系(春系3號、磐田2號、夏系722)間的比較。劉

47、富中等利用rapd鑒定厚皮甜 瓜雜交種中蜜1號、中蜜2號、中蜜3號及其親本的遺傳純度,建立了快速鑒定甜瓜純度的技術(shù)體系, 構(gòu)建其特有指紋圖譜,為甜瓜品種保護和雜交制種屮純度和真實性的快速準(zhǔn)確鑒定提供了技術(shù)保證。 樂錦華等利用20個隨機引物對厚皮甜瓜8個親本與4個雜交種進行了 rapd分析,結(jié)果表明,可以 利用rapd標(biāo)記在dna水平上進行厚皮甜瓜親緣關(guān)系的鑒定。劉萬勃說利用rapd和issr兩種分子標(biāo) 記技術(shù)對37份甜瓜種質(zhì)進行了多樣性研究。在供試材料屮篩選到具有多態(tài)性的rapd引物21個,issr 引物10個等等。本研究可以用5個特異引物將11個甜瓜品種(文獻上沒有被研究過的)區(qū)分開來, 而

48、且可以用有特異性擴增的引物檢測了其中一個品種,結(jié)果顯示rapd分了標(biāo)記在用在甜瓜種了檢測。 這種方法也町以對市面上銷售的甜瓜品種進行種子純度鑒定。用rapd分子標(biāo)記鑒定種子純度,有兩種情況口7,詢:一是有父母本種子時是要尋找到至少一條 dna特征帶,通過対f1種子和父母本種子dna帶型的比較來鑒定珀種子純度。但是本研究是市場上 所銷售的種了,缺少父母木。二是rapd應(yīng)用于兒常規(guī)品種種了純度檢驗時,要求選擇hl標(biāo)品種a的 rapd圖譜中出現(xiàn)而其他常規(guī)甜種中不出現(xiàn)的dna譜帶作為鑒定純度用的特界譜帶。為保證檢測結(jié)果 的真實性和町靠性,尋求特異譜帶的研究屮通常應(yīng)選川較多的其他非fi標(biāo)常規(guī)品種。為此,

49、本研究就 是通過pcr優(yōu)化條件卜篩選出一些引物能將11品種區(qū)分開來。再用能區(qū)別不同品種的引物檢驗其中 -種品種的種子純度。結(jié)果顯示該方法能應(yīng)用在甜瓜品種純度上。4.參考文獻1 王志敏、牛義、宋明等rapd技術(shù)在蔬菜研究中的應(yīng)用j西南園藝.2005, 33(5):21-22, 29.2 苗玉新、劉麗艷、包春蓮.pcr和rapd技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的應(yīng)用j.農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研 究.2005, 21(5) :231-234.3 辛景樹、郭景倫、張軟斌.兒種常用分了標(biāo)記技術(shù)在種了純度和品種真實性鑒定方面的比較與分析 j種子.2005, 24 (1): 58-60.4 孫妮、胡開林、張長遠(yuǎn).rapd技術(shù)鑒

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