FGF10單克隆抗體對銀屑病皮損治療作用研究1

1、FGF10單克隆抗體對銀屑病皮損治療作用研究 課題申報書提綱一、課題概述銀屑病是一種常見的多發(fā)的受多基因控制的慢性炎癥性皮膚病，其重要組織病理學(xué)的特征性表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)過度增生，棘層增厚以及真皮血管擴(kuò)張同時伴有炎細(xì)胞浸潤為主要表現(xiàn)的皮膚病。病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，考慮與遺傳、感染、代謝障礙、內(nèi)分泌紊亂及免疫因素等有關(guān)1 。關(guān)于銀屑病的治療，目前國內(nèi)外傳統(tǒng)的治療方法主要有以下幾種：1、全身用藥，口服維甲酸，口服免疫抑制劑如環(huán)孢素、雷公藤，靜脈給與免疫調(diào)節(jié)劑等。2、光化學(xué)療法。3、外用制劑，如達(dá)力士、皮質(zhì)類固醇激素和維甲酸類外用藥等。4、中醫(yī)中藥口服和外用。

2、近幾年，基于銀屑病是以淋巴細(xì)胞異?；罨癁槭及l(fā)環(huán)節(jié)的免疫炎性疾病的理論，人們開發(fā)了多種抑制 T 淋巴細(xì)胞異?；罨彤惓；罨筢尫诺母鞣N細(xì)胞因子的藥物，迄今己出現(xiàn)了與此概念相關(guān)的 20余種用于治療銀屑病的生物制品，其作用機(jī)制涵蓋了從 T 細(xì)胞激活的起始點及各中間環(huán)節(jié)，如抑制抗原提呈細(xì)胞（APC）的抗原提呈功能、抑制 T 細(xì)胞的活化和增殖、抑制 T 細(xì)胞粘附、抑制炎癥細(xì)胞因子的生成或活性、利用細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用等2-4 。這些生物治療藥物較傳統(tǒng)的免疫抑制劑選擇性高，可通過聯(lián)合療法來發(fā)揮作用，表現(xiàn)出較好的發(fā)展前景。研究表明，活化的 T 淋巴細(xì)胞、炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及相互作用產(chǎn)生的細(xì)胞因子和炎癥介

3、質(zhì)是造成銀屑病病理生理異常的物質(zhì)基礎(chǔ)，對于這些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的異常改變，任何對銀屑病的病理生理研究和任何治療藥物必然直接或間接地涉及5。體內(nèi)和體外的研究都表明，在銀屑病形成過程中，在一些生長因子的作用下KC表現(xiàn)為異常增殖和分化，如表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子a和成纖維細(xì)胞生長因子等，其中成纖維細(xì)胞生長因子10 （fibroblast growth factors10, FGF10）對KC的異常增殖和分化可能起著重要的調(diào)節(jié)作用，郗彥萍6、7等采用組織切片免疫組化技術(shù)檢測 FGF10在尋常型銀屑病患者皮損、非皮損及正常皮膚中的分布，研究了成纖維細(xì)胞生長因子10及其mRNA在尋常型銀屑病皮損中表達(dá)

4、情況。研究結(jié)果顯示銀屑病真皮浸潤的激活的淋巴細(xì)胞可分泌一些細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于真皮成纖維細(xì)胞后，可能產(chǎn)生FGF10，后者可能對維持銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞呈持續(xù)過度增殖狀態(tài)密切相關(guān)。在尋常型銀屑病皮損中, FGF10 mRNA陽性主要表達(dá)于其表皮的基底層或棘層，以表皮的中下層表達(dá)較明顯，角質(zhì)層及顆粒層不顯示陽性表達(dá)。陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)、部分位于細(xì)胞核內(nèi)。在真皮淺層浸潤的淋巴細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中也可見陽性表達(dá)，在汗腺上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)；尋常型銀屑病非皮損處的表皮中，F(xiàn)GF10 mRNA陽性表達(dá)于表皮的中下層的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；正常皮膚FGF10mR-NA陽性僅表達(dá)于表皮的基底層細(xì)胞，且

5、表達(dá)較弱。FGF10 mRNA檢測陽性率在皮損組與正常皮膚組、非皮損組與正常皮膚組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，而在皮損組與非皮損組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),三組間半定量結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 FGF10mRNA在銀屑病的顆粒層、角質(zhì)層中表達(dá)為陰性，在表皮的下層陽性率較高，從而對KC產(chǎn)生明顯的促增殖作用。 因此， FGF10 mRNA 在銀屑病KC異常增殖中起重要的作用。國外學(xué)者Kovacs等8的研究也表明，銀屑病皮損中激活的淋巴細(xì)胞能刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生KGF和FGF10，其結(jié)果是維持角質(zhì)形成細(xì)胞呈持續(xù)過度增殖的狀態(tài)。郗彥萍與K

6、ovacs所報道的FGF10在尋常型銀屑病皮損中的檢測結(jié)果基本一致。以上學(xué)者的研究結(jié)果均表明 FGF10 在銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增生、分化中起重要作用，參與其發(fā)病過程。目前公認(rèn)銀屑病是由CD4+Th1淋巴細(xì)胞和多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的自身免疫紊亂性疾病9,生物制劑以阻斷不同的免疫環(huán)節(jié)為靶點,治療中重度銀屑病療效顯著。歐美國家已廣泛應(yīng)用于銀屑病等免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病,展示了顯著的療效及良好的安全性 10。如：抗CD20抗體（利妥昔），治療天皰瘡，Kirby等用其與甲氨蝶吟聯(lián)合治療頑固的斑塊型銀屑病取得了滿意的效果；抗IgE抗體治療特應(yīng)性皮炎以及其他相關(guān)的過敏性疾病都有較好的療效；抗IL-8單克隆抗

7、體能夠一直銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增生，東蕪宏遠(yuǎn)逸士生物技術(shù)藥業(yè)有限公司研制生產(chǎn)了抗人白細(xì)胞介素-8（IL-8）單克隆抗體乳膏。因此，這種新方法受到大家的廣泛關(guān)注，特別是近年隨著基因工程抗體技術(shù)的飛速發(fā)展, 抗體療法從實驗研究逐漸向臨床應(yīng)用過渡, 在銀屑病的治療中展示出良好的前景。目前國內(nèi)郗彥萍等采用組織切片免疫組化技術(shù)檢測FGF10在尋常型銀屑病患者皮損、非皮損及正常皮膚中的分布。結(jié)果表明，尋常型銀屑病皮損、非皮損中FGF10的陽性檢測結(jié)果均明顯高于對照組，說明FGF10在銀屑病KC異常增殖中起重要的作用。國外研究學(xué)者Kovacs等研究結(jié)果顯示：銀屑病皮損中激活的淋巴細(xì)胞能刺激成纖維細(xì)胞

8、產(chǎn)生FGF10，從而維持KC呈持續(xù)過度增殖的狀態(tài)。這些提示了，成纖維細(xì)胞釋放的 FGF10可能對銀屑病的KC增值具有重要的作用，參與其發(fā)病過程。目前國內(nèi)所見FGF10單克隆抗體研究的文獻(xiàn)報道為本實驗室本項目組成員發(fā)表。國外，F(xiàn)GF10單克隆抗體應(yīng)用于銀屑病方面也未見報道。我們擬采用FGF10的單克隆抗體作為藥物對患處組織中高表達(dá)的FGF10進(jìn)行拮抗，從而阻斷或緩解角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，達(dá)到對銀屑病的治療目的。本項目已經(jīng)獲得校內(nèi)青年啟動基金2萬元的資助，項目已經(jīng)啟動，開展了一些前期工作，我們將已獲得的高純度FGF10蛋白與弗氏佐劑充分乳化作為免疫抗原，免疫BALB/c小鼠后，將脾臟中的免疫淋巴B細(xì)

9、胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，并對融合細(xì)胞所分泌抗體的特異性進(jìn)行篩選。經(jīng)過3次亞克隆，獲得1株可穩(wěn)定分泌抗FGF10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G6，并對雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體特性進(jìn)行了分析，經(jīng)復(fù)蘇及多次傳代后雜交瘤細(xì)胞株仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，其產(chǎn)生抗體亞類為IgG1。細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價達(dá)到1:3200；誘生小鼠腹水的抗體效價為1:25600；2G6腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨方法純化后，蛋白質(zhì)含量為3.71mg/mL；腹水經(jīng)純化后抗體效價為1:12800。本研究目前完成了FGF10單克隆抗體的制備、鑒定及純化，這為下一步實驗的順利進(jìn)行準(zhǔn)備了必需的材料，為項目的深入研究奠定了基礎(chǔ)。在以上研究背景

10、啟示下，我們用雜交瘤技術(shù)制備FGF10單克隆抗體（FGF10 McAb），擬利用HaCaT細(xì)胞體外培養(yǎng)，研究FGF10以及FGF10 McAb對HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)引起的增殖、抑制、細(xì)胞周期、凋亡改變，模擬銀屑病KC增殖,以求進(jìn)一步明確FGF10及FGF10 McAb在銀屑病表皮過度增殖機(jī)制的作用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入觀察FGF10 McAb對小鼠及豚鼠銀屑病模型的治療作用 ，最終確認(rèn)這一新的藥物靶點，為研究銀屑病新的生物治療奠定基礎(chǔ)。主要參考文獻(xiàn)：1 Szell M, Bata-Csorgo Z, Koreck A, et al. Proliferating keratinocytes ar

11、e putative sources of the psoriasis susceptibility- related EDA+ (extra domain A of fibronectin) on cofetal fibronectin. J In-vest Dermatol 2004;123:537-546.2 COTTLIEBAB.Psoriasis:immuno-pathology-and-immunomodulation.DermatolClin,2001,19:649-657.3 KREUGER G,ELLIS C N.Psoriasis-recent advances in un

12、derstanding its pathogenesis and treatment.J Am Axad Dermatol,2005,53:S94-S1004 MAN Xiao-yong, ZHENG Min (滿孝勇,鄭敏).Advances in pathogenesis of psoriasis.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版),2006,35(6):673-677.(in Chinese)5 顏文飛,孫國均,鄭敏.角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子與銀屑病的關(guān)系.國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊,2001,27(1):10-

13、126 郗彥萍,于春水,譚升順,周艷，張磐諫.成纖維細(xì)胞生長因子10在尋常型銀屑病皮損中的檢測.中國皮膚性病學(xué)雜志,2006,20(11):671-674.7 郗彥萍,于春水,譚升順,周艷，張磐諫.成纖維細(xì)胞生長因子10mRNA在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá).第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2007,28(2):150-153.8 KovacsM, FalchiG, CardinaliS, eta.l Immunohistochemical analysis of keratinocyte growth factor and fibrblast growth factor 10 expression in ps

14、oriasis.Exp Dermato,l 2005, 14(2): 130-137.9 Griffiths CE.The immunological basis of psoriasis.J Eur A cad Demato l V enereol.2003,17(Suppl 2):1-510 李紅，周瀾華.銀屑病的生物治療新進(jìn)展.中國皮膚性病學(xué)雜志.2010，24（9）：863-864.二、課題的目標(biāo)與任務(wù)1課題目標(biāo)與任務(wù)需求分析本項目總體目標(biāo)：擬用雜交瘤技術(shù)制備FGF10單克隆抗體，擬利用HaCaT細(xì)胞體外培養(yǎng)，研究FGF10以及FGF10 McAb對HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)引起的增殖、抑制、

15、細(xì)胞周期、凋亡改變，模擬銀屑病KC增殖,以求進(jìn)一步明確FGF10及FGF10 McAb在銀屑病表皮過度增殖機(jī)制的作用。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步深入觀察FGF10 McAb對小鼠及豚鼠銀屑病模型的治療作用 ，以 FGF10單克隆抗體作為藥物對患處組織中高表達(dá)的FGF10進(jìn)行拮抗，從而阻斷或緩解角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，達(dá)到對銀屑病的治療目的。最終確認(rèn)這一新的藥物靶點，為研究銀屑病新的生物治療奠定基礎(chǔ)。2課題目標(biāo)與任務(wù)解決的主要技術(shù)難點和問題分析制備FGF10單克隆抗體,研究FGF10以及FGF10 McAb對HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)引起的增殖、抑制、細(xì)胞周期、凋亡改變，模擬銀屑病KC增殖,以求進(jìn)一步明確FGF

16、10及FGF10 McAb在銀屑病表皮過度增殖機(jī)制的作用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入觀察FGF10 McAb對小鼠及豚鼠銀屑病模型的治療作用,采用FGF10單克隆抗體作為藥物對患處組織中高表達(dá)KGF-2進(jìn)行拮抗，從而阻斷或緩解角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，達(dá)到對銀屑病的治療目的。最終確認(rèn)這一新的藥物靶點，為研究銀屑病新的生物治療奠定基礎(chǔ)。三、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)與優(yōu)勢1國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)、知識產(chǎn)權(quán)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀及預(yù)期分析單克隆抗體素有“生物導(dǎo)彈”之稱，利用單克隆抗體靶向病變組織活細(xì)胞上表面抗原已成為理想的靶向治療方法。其特點是在局部阻斷損害皮膚的自身免疫反應(yīng)，而避免影響全身免疫系統(tǒng)的正常功能。目前已有多種有報道的單克隆

17、抗體藥物應(yīng)用于皮膚病等治療，如：抗CD20抗體（利妥昔），治療天皰瘡，Kirby等用其與甲氨蝶呤聯(lián)合治療頑固的斑塊型銀屑病取得了滿意的效果；抗IgE抗體治療特應(yīng)性皮炎以及其他相關(guān)的過敏性疾病都有較好的療效；抗IL-8單克隆抗體能夠抑制銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增生，東蕪宏遠(yuǎn)逸士生物技術(shù)藥業(yè)有限公司研制生產(chǎn)了抗人白細(xì)胞介素-8（IL-8）單克隆抗體乳膏。因此，這種新方法受到眾多研究者的廣泛關(guān)注，特別是近年隨著基因工程抗體技術(shù)的飛速發(fā)展, 抗體療法從實驗研究逐漸向臨床應(yīng)用過渡, 在銀屑病的治療中展示出良好的前景。2課題申請單位及主要參與單位研究基礎(chǔ)（已有的研究開發(fā)經(jīng)歷，科技成果、科研條件與研究開

18、發(fā)隊伍現(xiàn)狀等）（1）本項目研究基礎(chǔ)本項目組將KGF-2蛋白與弗氏佐劑充分乳化作為免疫抗原，免疫BALB/c小鼠后，采用50%的PEG4000為細(xì)胞融合劑，將脾臟中的免疫淋巴B細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，后用間接ELISA方法對融合細(xì)胞所分泌抗體的特異性進(jìn)行篩選。經(jīng)過3次亞克隆，獲得1株可穩(wěn)定分泌抗KGF-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G6。具體如下：(1)免疫效果經(jīng)過3次腹部皮下多點注射免疫，4只小鼠均產(chǎn)生抗FGF10抗體。抗血清的效價達(dá)到1:3200，符合細(xì)胞融合的要求，取脾融合（見表1、圖1）。表1 小鼠血清抗體效價測定結(jié)果抗體稀釋倍數(shù) 鼠1 鼠2 鼠3 鼠41:800 1.873

19、1.802 1.922 1.8271:1600 1.464 1.397 1.492 1.4131:3200 1.072 0.983 1.207 1.138 空白對照 0.058 0.056 0.058 0.057 陰性對照 0.202 0.207 0.204 0.202 圖1 經(jīng)免疫后小鼠的脾臟 圖2 融合后第7天生長狀態(tài)(2) ELISA條件的確定通過棋盤滴定法的篩選，摸索了間接ELISA檢測方法檢測血清效價的最佳條件。FGF10抗原包被濃度：500ng/mL；1%BSA的PBST溶液做為封閉液；酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)：1:2000。(3) 細(xì)胞融合結(jié)果進(jìn)行了3次細(xì)胞融合，第一次融合率較低，第二、

20、三次融合的融合率依次有所提高；經(jīng)間接ELISA篩選，第三次融合后得到陽性細(xì)胞株28株，共得到陽性細(xì)胞株41株。經(jīng)過對融合陽性孔連續(xù)3次克隆篩選，最后陽性率100%的雜交瘤細(xì)胞中選出最好的細(xì)胞傳瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，最終得到1株能夠穩(wěn)定分泌抗FGF10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G6。細(xì)胞生長狀況見圖2；細(xì)胞融合結(jié)果見表2。表2 細(xì)胞融合率及陽性率融合次數(shù) 分裝孔數(shù) 克隆生長數(shù) 融合率 陽性孔數(shù) 陽性率1 288 12 4.2% 2 16.7%2 384 67 17.4% 11 16.4% 3 288 98 34% 28 28.6%(4) 單抗亞類的鑒定按照試劑盒說明，利用抗原介導(dǎo)的ELISA法檢測雜交瘤細(xì)

21、胞株2G6的亞類類型，見表3，結(jié)果表明該抗體為IgG1型 。表3 單抗亞類鑒定細(xì)胞株 IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG32G6 0.081 0.172 0.121 0.101 0.120 0.103(5) 抗體腹水及純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果腹水及純化后腹水經(jīng)SDS-PAGE分析(圖3)顯示，未純化的樣品雜蛋白帶較多，純化后的單克隆抗體有明顯的兩條帶，分別為抗體的輕鏈和重鏈。說明腹水經(jīng)純化后絕大部分雜蛋白被除去。利用Maker（97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3KDa）中的標(biāo)準(zhǔn)蛋圖3 腹水SDS-PAGE結(jié)果1. Marker 2、3. 未純

22、化的腹水純化后腹水 4、5. 純化后腹水白在凝膠中的相對遷移與分子量的關(guān)系做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對遷移率，縱坐標(biāo)為分子量的對數(shù)。用Excel進(jìn)行曲線擬合并求回歸方程。將2G6分泌抗體的重鏈和輕鏈在凝膠中的相對遷移率代入回歸方程。分別計算出其分子量，再根據(jù)IgG中重鏈和輕鏈的比例關(guān)系，計算得出2G6分泌抗體分子量約為161KDa。（2）工作條件 工作基礎(chǔ)：本項目申請人主要從事生物制藥相關(guān)工作，主要研究方向為抗體免疫、細(xì)胞生物活性。目前主持該方面的省級基金1項，主持校內(nèi)啟動基金1項，并同時參與國家級省級項目2項，發(fā)表文章8篇，課題組已經(jīng)成功制備了FGF10單克隆抗體并進(jìn)行了鑒定及純化，并

23、發(fā)表相關(guān)文章2篇，因此工作基礎(chǔ)較好，完全有能力完成該項工作。 技術(shù)準(zhǔn)備：本項目組人員長期以來，從事生長因子研究工作。本項目申請人所在課題組依托于工程研究中心，主要以生物反應(yīng)器及新型藥物的基礎(chǔ)研究、應(yīng)用開發(fā)、工程轉(zhuǎn)化為主，主要開展各種成纖維細(xì)胞生長因子的研究工作。本項目申請人所從事專業(yè)為細(xì)胞生物學(xué)，熟練掌握單克隆抗體制備技術(shù)、Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等分子生物學(xué)方法，為本項目的順利實施積累了可行的技術(shù)和方法。因此工作基礎(chǔ)好，完全有能力完成該項工作。 儀器設(shè)備：本課題依附于工程中心，在分子生物學(xué)與動物細(xì)胞培養(yǎng)方面，經(jīng)歷幾年的建設(shè)， 投入了2000萬元購置了大批國外先進(jìn)設(shè)

24、備，其基礎(chǔ)設(shè)施方面達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平。目前中心已具備了分子生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)的常規(guī)和現(xiàn)代儀器設(shè)備，包括PCR儀、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、高速低溫離心機(jī)、超低溫冰箱、超凈工作臺、凝膠成像系統(tǒng)等，并具備實驗條件良好的細(xì)胞培養(yǎng)室。為本實驗的順利完成提供了實施保障。動物實驗部分在團(tuán)隊的合作單位某大學(xué)動物中心進(jìn)行，銀屑病模型制備方法已經(jīng)成熟，為確保實驗的準(zhǔn)確，本項目分別選用小鼠和豚鼠，分別用不同的方法制作銀屑病樣皮炎的動物模型，觀察FGF10 McAb膏劑對銀屑病皮損的治療作用。目前的實驗條件能夠保證本實驗的順利進(jìn)行。 人員配備： 本課題組配備了與本項目研究有關(guān)的從事細(xì)胞生物

25、學(xué)、動物免疫學(xué)、生物技術(shù)等方面的專業(yè)人員和研究生，人員結(jié)構(gòu)合理，有能力完成本項目所擬定的研究內(nèi)容。 動物實驗部分：在吉林大學(xué)動物中心進(jìn)行，銀屑病模型制備方法已經(jīng)成熟，為確保實驗的準(zhǔn)確，本項目分別選用小鼠和豚鼠，分別用不同的方法制作銀屑病樣皮炎的動物模型，觀察FGF10 McAb膏劑對銀屑病皮損的治療作用。目前的實驗條件能夠保證本實驗的順利進(jìn)行。四、任務(wù)分解與考核指標(biāo)1課題研究內(nèi)容、技術(shù)路線和創(chuàng)新點(1)課題的研究內(nèi)容 通過雜交瘤技術(shù)，建立穩(wěn)定分泌 FGF10 McAb雜交瘤細(xì)胞株將FGF10蛋白與弗氏佐劑充分乳化作為免疫抗原，免疫BALB/c小鼠后，采用50%的PEG4000為細(xì)胞融合劑，將脾

26、臟中的免疫淋巴B細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，后用間接ELISA方法對融合細(xì)胞所分泌抗體的特異性進(jìn)行篩選。經(jīng)過3次亞克隆，獲得可穩(wěn)定分泌抗FGF10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。 FGF10 McAb的大量生產(chǎn)及純化及鑒定，得到高親和力的FGF10 McAb將雜交瘤細(xì)胞懸浮后置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后用上述同樣的方法轉(zhuǎn)入50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞凍存。采用小鼠腹水法大量制備單克隆抗體。 研究 FGF10及FGF10 McAb對HaCaT細(xì)胞增殖的影響HaCaT細(xì)胞是正常突變的永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株,許多生物學(xué)特性與原

27、代KC相同,Finch等學(xué)者也都采用HaCaT細(xì)胞株研究銀屑病的病理生理改變,模擬銀屑病KC增殖。本研究也采用這種方法，觀察被干預(yù)后HaCaT細(xì)胞的增殖、分化和凋亡情況。a MTT法檢側(cè)FGF10對HaCaT細(xì)胞增殖的影響文獻(xiàn)報告銀屑病FGF10表達(dá)增高，本實驗擬用作FGF10為誘導(dǎo)劑，檢測FGF10對HaCaT細(xì)胞增殖作用，從體外實驗層面研究FGF10對HaCaT細(xì)胞增殖的影響,并在實驗中確定FGF10作為增殖誘導(dǎo)劑在后繼研究中的最佳誘導(dǎo)濃度。b MTT法檢測FGF10 McAb 對HaCaT細(xì)胞增殖的影響文獻(xiàn)報告銀屑病FGF10表達(dá)增高，本實驗擬用作FGF10 McAb為拮抗劑，檢測FGF

28、10McAb對HaCaT細(xì)胞增殖抑制作用，從體外實驗層面研究FGF10對HaCaT細(xì)胞增殖抑制的影響,并在實驗中確定FGF10McAb作為拮抗劑在后繼研究中的最佳誘導(dǎo)濃度。 研究 FGF10 McAb對銀屑病動物模型的治療作用a 小鼠銀屑病模型的建立：觀察FGF10抗體膏劑對雌激素期小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響。選取體重2030 g 的ICR 小鼠32 只（由某大學(xué)實驗動物中心提供），給雌性小鼠腹腔注射己烯雌酚, 連續(xù)3 d, 0.2 mg/次, 1 次/d, 使小鼠陰道上皮處于雌激素期。第4 天將小鼠分為4組進(jìn)行實驗, 每組8 只, 第1 組為空白對照組, 第2組為陽性對照( 維A 酸乳膏

29、) 組, 第3 組為KGF2抗體膏劑低劑量組, 第4 組為KGF2抗體膏劑高劑量組。于每日晨8:00 開始局部給藥。連續(xù)3 d。于末次給藥當(dāng)天上午9:00 給每只小鼠腹腔注射秋水仙堿2 mg/kg 體重, 使細(xì)胞有絲分裂周期停滯于有絲分裂中期, 便于計數(shù)。6 h 后斷頸殺死小鼠, 切取陰道組織, 用10%福爾馬林溶液固定, 石蠟包埋, HE 染色。在光鏡下, 計數(shù)300 個基底細(xì)胞中的有絲分裂數(shù), 折算出每100 個基底細(xì)胞中的有絲分裂數(shù), 為有絲分裂指數(shù), 比較各組小鼠陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)。b 豚鼠銀屑病模型的建立： 豚鼠銀屑病模型的建立：觀察FGF10抗體膏劑對鹽酸普萘洛爾所致豚鼠耳

30、部皮膚銀屑樣皮損模型的影響。取鹽酸普萘洛爾5g，以50 %乙醇為溶劑,使藥物溶解, 加入Azone （氮酮）丙二醇5ml 作為復(fù)合促進(jìn)劑, 加入PVPK30（聚乙烯基吡咯烷酮均聚物）5g 為成膜材料,補(bǔ)加50 %乙醇至100ml ,制備鹽酸普萘洛爾乳搽劑。取體重350450g 豚鼠38 只,雌雄各半,隨機(jī)分成空白組10 只,模型組28只。模型組每只動物用玻璃棒以5 %鹽酸普萘洛爾乳搽劑涂左側(cè)耳廓皮膚(0.3g/cm2) ,每日2 次,連續(xù)2 周。末次給藥后殺死正常組和模型組各4 只豚鼠分別取左側(cè)耳廓皮膚標(biāo)本,甲醛固定,HE 染色,光鏡觀察,以此評價造模質(zhì)量。將模型組剩余的24 只豚鼠隨機(jī)分成4

31、 組,即模型組、陽性藥對照組、FGF10膏劑低劑量組、KGF2抗體膏劑高劑量組。模型組不用任何藥物,作為皮損模型自然恢復(fù)對照組;用藥2周后,取豚鼠左側(cè)耳廓皮膚,用10 %福爾馬林固定,石蠟包埋,HE 染色,觀察耳部皮膚角質(zhì)層、顆粒層、棘細(xì)胞層、基底細(xì)胞層的變化, 并在光學(xué)顯微鏡下( ×400) 用測微尺測表皮厚度,然后換算成實際厚度(用mm 表示) ,進(jìn)行各組間差異性比較。真皮浸潤細(xì)胞(單一核及多形核) 密度(個/ ×400 視野) :隨機(jī)測定真皮10 個高倍視野內(nèi)的炎性細(xì)胞數(shù),算出平均值。基底細(xì)胞有絲分裂數(shù)(個/ ×400 視野) :隨機(jī)測定基底層10個高倍視野

32、內(nèi)的基底細(xì)胞有絲分裂數(shù),算出平均值。(2) 技術(shù)路線通過雜交瘤技術(shù)，建立穩(wěn)定分泌 FGF10 McAb雜交瘤細(xì)胞株FGF10 McAb凍存、鑒定、擴(kuò)大培養(yǎng)、腹水制備、純化MTT法檢側(cè)FGF10及FGF10 McAb對HaCaT細(xì)胞增殖的影響研究 FGF10 McAb對銀屑病動物模型的治療作用探明FGF10 McAb對小鼠及豚鼠銀屑病模型的治療作用 ，最終確認(rèn)這一新的藥物靶點，為研究銀屑病新的生物治療奠定基礎(chǔ)。的過度增殖，達(dá)到對銀屑病的治療目的。最終確認(rèn)這一新的藥物靶點，為研究銀屑病新的生物治療奠定基礎(chǔ)。小鼠銀屑病模型的建立豚鼠銀屑病模型的建立 (3) 創(chuàng)新點選題新穎,屬科學(xué)前沿目前公認(rèn)銀屑病是

33、由CD4+Th1淋巴細(xì)胞和多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的自身免疫紊亂性疾病。生物制劑能靶向性阻斷T淋巴細(xì)胞活化,阻斷特異的細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng),在歐美國家已廣泛應(yīng)用于銀屑病等免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病,展示了顯著的療效及良好的安全性。這種新方法受到大家的廣泛關(guān)注，特別是近年隨著基因工程抗體技術(shù)的飛速發(fā)展, 抗體療法從實驗研究逐漸向臨床應(yīng)用過渡, 在銀屑病的治療中展示出良好的前景。目前本項目為首次應(yīng)用FGF10 McAb制備外用劑型；國內(nèi)外尚無FGF10McA治療銀屑病的相關(guān)研究的報道。具有重要的理論意義和應(yīng)用前景郗彥萍與Kovacs等學(xué)者的研究結(jié)果均表明 FGF10 在銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增生、分化中起重要作用，參與其發(fā)病過程。擬采用FGF10 單克隆抗體作為藥物對患處組織中高表達(dá)的FGF10進(jìn)行拮抗，從而阻斷或緩解角質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，達(dá)到對銀屑病的治療目的。這為使用抗體藥物治療銀屑病提供了新的思路。尤其值得重視的是，由于鼠源單克隆抗體因其存在明顯的免疫原性，通常只能用做檢測試劑和蛋白純化材