畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）動(dòng)物科學(xué)專業(yè)

1、丿 huazhong agricultural universih題目:教指導(dǎo)教師:本科畢業(yè)掄文多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析賈征學(xué)號(hào) 040801030動(dòng)物科學(xué)姓名:專業(yè):山羊褪黑激素受體1a基因hk i酶切楊利國(guó)職稱中國(guó)武漢二oo八年六月密級(jí)分類號(hào)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)論文山羊褪黑激素受體1a基因hk i酶切多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析hint i rflp of melatonin receptor 1 a(mtnria)gene and the association with the litter size traits in goat學(xué)生姓名學(xué)生學(xué)號(hào) 學(xué)生專業(yè)：動(dòng)物科學(xué) 指導(dǎo)教

2、師：教授華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院二oo八年六月摘要4abstract5前言61. 材料與方法71. 1材料71. 1. 1試驗(yàn)動(dòng)物71. 1.2實(shí)驗(yàn)材料71. 1.3主要試劑的來(lái)源71. 1.4主要儀器設(shè)備81. 1.5主要試劑的配置81. 1. 6主要分子牛物學(xué)軟件錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。1.2方法91. 2. 1.山羊基因組dna的提取91.2.2. 引物設(shè)計(jì)及其序列101.2. 3. pcr擴(kuò)增及其電泳檢測(cè)101. 2. 4.限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物以及電泳檢測(cè)121.2.5.統(tǒng)計(jì)分析132結(jié)果與分析132. 1 pcr擴(kuò)增結(jié)果132. 2酶切結(jié)果142.3褪黑激素基因頻率和基因型頻率分析結(jié)果

3、152. 4 mtnrz基因型與波爾山羊頭胎產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析152. 5 mtnrz基因型與經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析163 討論163. 1個(gè)同山羊品種基因型頻率及基因頻率差異163. 2 .ima不同基因型對(duì)波爾山羊頭胎和經(jīng)產(chǎn)羔數(shù)的影響17參考文獻(xiàn)17致謝18山羊褪黑激素受體1a基因hm i酶切多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析摘要木研究以褪黑激素受體1a基因?yàn)楹蜻x基因，分析該基因多態(tài)性對(duì)山羊產(chǎn)羔 數(shù)性狀的影響。釆用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, pcr-rflp)方法，檢測(cè)了 65只波爾山羊和51馬頭山羊褪黑激 素

4、受體1a基因h加fl酶切多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，褪 黑激素受體1a基因在波爾山羊中存在h/fl酶切多態(tài)性，而在馬頭山羊樣本小 則無(wú)多態(tài)性。在波爾山羊屮，檢測(cè)到aa、gg兩種基因型，未檢測(cè)到ag型； 其中aa基因型個(gè)體在出現(xiàn)頻率最高，為0.554, gg型為0.446； a、g等位基 因頻率分別為0.554和0.446o性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明：波爾山羊的m基因純合 型頭胎平均產(chǎn)羔數(shù)比gg基因雜合型多0. 07只，加性效應(yīng)值為0. 035,顯性效應(yīng) 值為-1.42；經(jīng)產(chǎn)羔數(shù)的aa型比gg型多0.09只；加性效應(yīng)值為0. 046,顯性效 應(yīng)值為-1.84o a等位基因可能與波爾山羊

5、產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)，該位點(diǎn)主要以加性 方式起作用。關(guān)鍵詞：山羊；繁殖性狀；褪黑激素受體；pcr-rflphint i -rflp of melatonin receptor 1 a (mtnr1a) gene and the association with the litter size traits in goatabstractin the present study, melatonin receptor i a gene (mtnr1a) was analysed to find the assocation with litter size in goat as a candidate

6、 gene hint i rflp (restriction fragment length polymorphism, rflp) of mtnr1a was found in 65 boer goats and 51 goats ma tou. no polymorphism was detected in ma tau goats - two genotypes aa, gg were found in boer goats. the frequency of aa genotype was higher than gg genotype, which were 0.554 and 0.

7、446，respectively. the allele frequencies for a and g were 0.554 and 0.446 the results of traits association analysis showed that individuals with aa genotype had additional 0.07 average litter size at first kidding in boer goat. the additive effect value was 0.035, while the dominant effects value -

8、1.42. moreover, aa genotype had additional 0.09 average litter size for multiparity, the additive and dominant effects value were 0.046 and -1-84, respectively. allele a was possiblely positively correlated with litter size in boer goats- the additive effect was dominant at the site.key words: goat；

9、 reproductive traits； mtnr1a； pcr-rflp-jkx. 1刖5褪黑激素主要是由松果體合成的，其它合成部位還有:視網(wǎng)膜、眼眶腔的副 淚腺、唾液腺、腸的嗜鉆細(xì)胞及紅細(xì)胞，松果體把對(duì)外界光照形成的神經(jīng)信息經(jīng) 下丘腦視交叉上核轉(zhuǎn)變成體液信息一z。1褪黑激素生理功能、作用機(jī)制；褪黑激素對(duì)生殖系統(tǒng)作用的機(jī)理主要是通過(guò)光作用于視網(wǎng)膜，然后通過(guò)視網(wǎng) 膜-下視丘至視交叉上核，再經(jīng)過(guò)一系列復(fù)朵的神經(jīng)交換至頸上神經(jīng)節(jié)，其節(jié)后 交感神經(jīng)作用于松果體。松果體分泌褪黑激素，通過(guò)下丘腦一垂體性腺軸影響生 殖系統(tǒng)。褪黑激素對(duì)生殖系統(tǒng)的作用因動(dòng)物種類、生理狀態(tài)不同而表現(xiàn)出抑制、 促進(jìn)或無(wú)作用的多

10、重性(焦傳珍，2005)o多項(xiàng)研究結(jié)果表明，褪黑激素雖然對(duì) 牛、鼠類、禽等動(dòng)物和人的生殖系統(tǒng)的發(fā)育有抑制作用，但是對(duì)綿羊、山羊、鹿 等動(dòng)物則明顯表現(xiàn)出促進(jìn)作用。2. 褪黑激素受體類型、作用機(jī)制；褪黑激素受體屬于g蛋白耦聯(lián)受體家族。根據(jù)其分子生物學(xué)方法乂可分為 mtnryk、mtnrv wtnryc三種亞型(張凱等，2006)。h前在哺乳動(dòng)物中還沒(méi) 有發(fā)現(xiàn)mtnrc受體，而具有明顯季節(jié)性繁殖特征的動(dòng)物僅在垂體結(jié)節(jié)部發(fā)現(xiàn) j/w1a受體，提示垂體結(jié)節(jié)部可能是褪黑激素繁殖效應(yīng)的作用位點(diǎn)。3. 褪黑激素受體分子標(biāo)記在其它動(dòng)物屮的研究進(jìn)展冃前國(guó)內(nèi)外對(duì)綿羊m tnr1a基因已經(jīng)有所研究已經(jīng)很多了。mess

11、er等(1997)和notter等(2003)用mnll和r sa i酶分別對(duì)白面雜種羊、薩福克 羊、特克塞爾羊、柯泊華斯羊和合成系綿羊群體mtnr1a基因外顯了 2的824 bp 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，發(fā)現(xiàn)m n 1 1在5個(gè)綿羊群體屮都存在286 bp和236 bp 多態(tài)片段，r sa l都存在295 bp和290 bp多態(tài)片段。pelletier等(2000)用 m n ii限制性內(nèi)切幽消化2組發(fā)情行為有明顯差異(常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情) 的merinos d arles母綿羊以及季節(jié)性發(fā)情明顯的ile2de2france母綿羊m tnr1a 基因外顯了 2的824 bp擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)存在30

12、3 bp和236 bp多態(tài)片段。季從 亮等(2003)和chu等(2003)用m n 1 i和r sa i對(duì)常年發(fā)情的小尾寒羊和 湖羊以及季節(jié)性發(fā)情的多賽特羊和薩?？搜蚬?46只綿羊m tnr1a基因外顯子2 的824 bp擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行pcr-rflp多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)m n 1 i在4個(gè)綿羊品種中 都存在303 bp和236 bp多態(tài)片段,r sa i都存在290 bp和267 bp多態(tài)片段。 在綿羊屮的研究結(jié)果表明，該基因?qū)d羊繁殖性能存在影響。但是，對(duì)于山羊， 只有對(duì)產(chǎn)絨或營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的研究，日前尚未發(fā)現(xiàn)有對(duì)山羊繁殖性能影響的相關(guān)報(bào) 道。4. 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊饬x木實(shí)驗(yàn)室滑國(guó)華等（2006）在山羊m

13、tnrik屮共發(fā)現(xiàn)7個(gè)snps,對(duì)其屮4個(gè) snps分析結(jié)果顯示:mtnr1a不同基因型對(duì)山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀有一定的影響。為進(jìn) 一步研究該基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔數(shù)性狀的影響，本試驗(yàn)選取g493a突變位點(diǎn)，采用引 入酶切位點(diǎn)方法，即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性forced pcr-rflp （polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphsim）,分析該位點(diǎn)在馬頭山羊和波 爾山羊屮的分布情況，并分析該位點(diǎn)對(duì)波爾山羊產(chǎn)羔數(shù)彩響，為山羊標(biāo)記輔助選 擇提供理論依據(jù)。1. 材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物馬頭山羊51頭，采自湖北省十堰市；

14、波爾山羊65頭，采自湖北省宜都市波 爾山羊種羊場(chǎng)。頸靜脈采血10ml/只，edta抗凝，-20°c保存。1.1.2實(shí)驗(yàn)材料1.5ml eppendorf 管、雙面板、微量移液槍（1000口1、200 口1、40 u 1、10 1、2. 5u 1）及槍頭、一次性pe塑料手套。1.1.3主要試劑的來(lái)源tagdna聚合酶購(gòu)口上海生工生物工程技術(shù)有限公司；dna限制性內(nèi)切酶力f 1購(gòu)門晶美生物工程有限公司；分子量標(biāo)準(zhǔn)loobp dna ladder和尸庭為勿如i購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù) 有限公司；三輕甲基氨基甲烷（tris）、苯酚、蛋白酶k、十二烷基硫酸鈉（sds）、w 胺、丙烯酰胺（acr

15、ylamide, acr） n_n'亞甲基丙烯酰胺（bisacrylamide） 瓊脂糖、澳化乙錠（eb）、瓊脂糖、乙二胺乙二酸二鈉鹽（edtana?）等均購(gòu)自 武漢凌飛科技有限公司。1.1.4主要儀器設(shè)備表1主要儀器設(shè)備table 1 laboratory equipment and instruments儀器設(shè)備名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家電熱恒溫水浴鍋gd120英國(guó)grant公司臺(tái)式禺心機(jī)tgl-16g上海安亭科學(xué)儀器廠梯度pcr儀t1 thermo cyler德國(guó)biometra公司冷凍離心機(jī)centrfuge 5810徳國(guó)eppendorf公司恒溫?fù)u床hs80中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠口動(dòng)

16、雙重純水蒸懈器sz-93上海亞榮?；瘍x器廠紫外分析儀uv-tv北京市新科技應(yīng)川研究所電泳槽dyy-ttt北京六-儀器廠穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳議dyy-2北京六一儀器廠手提式高壓滅菌鍋yxq-sg46-280a上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠超純水儀waterpro美國(guó)labconco公司移液器lml； 200 u1； 40 n1；10p 1； 2. 5m 1芬蘭labsystems公司1.1.5主要試劑的配置1. 1. 51用于血液樣品采集的溶液的配制1) im tris, cl儲(chǔ)備液：稱取121. 4g tris堿溶于800ml雙蒸水屮，加濃鹽酸調(diào)至 ph二8.0,定容到1000mlo高壓滅菌,室溫保存

17、;2) 0. 5m edta (ph=8.0)：稱取 186. lg na2edta 2h20溶于800ml雙蒸水中,加入 naoh (約20g)調(diào)至ph=8.0,定容到1000ml0高壓滅菌，室溫保存;3) 10%sds：稱取50g sds加熱溶于400ml雙蒸水屮，定容至500ml o高壓滅菌， 室溫保存；4) 抗凝劑(0. 2medta)：量取200ml 0. 5m edta加入雙蒸水定容至500ml o1. 1. 5. 2用于基因組dna提取的溶液的配制1) 蛋白酶k：稱取200mg蛋白酶k溶于10ml雙蒸水，以lml分裝，-20£冷凍保存;2) 氯仿/異戊醇(24:1)：量

18、取480ml氯仿,加入20ml異戊醇,混勻；3) 3mnaac：稱取naac 3h20溶于400ml雙蒸水中，用hac調(diào)至ph二5. 2,加水定容至500ml o高壓滅菌，室溫保存；4) te緩沖液：loomm tris - cl (ph=8.0), imm edta (ph=8.0)。1. 1. 5. 3用于瓊脂糖凝膠電泳及檢測(cè)溶液的配制1) 50xtae儲(chǔ)備液:稱取242g tris堿溶于750ml雙蒸水中，加入57. lml hac、 100ml 0. 5m edta (ph=80),加水定容至 1000ml；2) 5xtbe儲(chǔ)備液：稱取54g tris堿和27. 5g硼酸溶p750ml

19、雙蒸水屮，加入20ml 0. 5m edta (ph = 8. 0),加水定容至 1000ml；3) 6x±樣緩沖液:0.25%混酚蘭，0.25%二甲苯青，15%ficoll聚蔗糖;4) 漠化乙錠(eb, 10mg/ml) :100ml雙蒸水中加入0. lg eb,攪拌使完全溶解, 轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶，錫箔包裹。1. 1. 5. 4用于聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的溶液的配制1) 30%丙烯酰胺(丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺=29:1 ) :700ml雙蒸水中加入290g 丙烯酰胺，10g甲叉雙丙烯酰胺，攪拌使完全溶解，加水定容至1000ml, 4°c 保存；2) 10%過(guò)硫酸較：稱取

20、lg過(guò)硫酸鞍溶于8ml雙蒸水，定容至10ml；3) 10%乙醇：量取50ml無(wú)水乙醇溶于450ml水中，混勻；4) 1% hn03：量取15ml濃hno,溶于985ml雙蒸水中，混勻；5) 0. 2% agn03：稱取lg agn0.3溶于500ml雙蒸水中，置于棕色試劑瓶；6) 3% na2c03 (0. 05%醛)：稱取30g無(wú)水na2c03)§于900ml雙蒸水中，加入l5ml 甲醛,定容至1000ml；7) 3% hac：量取30ml冰hac溶t970ml雙蒸水，混勻。1.2方法1.2. 1.山羊基因組dna的提冃從山羊頸靜脈采血10ml,放入裝有抗凝劑(0.5mol/led

21、tanq的離心管中, 6000r/min離心15min,棄上清，吸取口細(xì)胞沉淀(參雜少量紅細(xì)胞)于另一離心 管中；加入兩倍體積雙蒸鐳水(滅菌)，搖勻沉淀，靜置10min15min,破碎紅 細(xì)胞；6000r/min離心15min,輕輕棄去上清，留白細(xì)胞沉淀；加入ixset 5ml, 蛋白酶k (10mg/ml) 0. 1ml至終濃度200ng/ml, 10% sds 250 u 1 至終濃度0. 5%, 55°c水浴消化過(guò)夜；加入等體積飽和平衡酚輕輕搖勻，12000r/min離心15min, 輕輕吸取上層水相于另一離心管中，棄下相苯酚；重復(fù)上步；加入等體積苯酚/ 氯仿/異戊醇(25:2

22、4:1),輕輕搖動(dòng)loinin, 12000r/min離心15min,輕輕吸取上 層水相于另一離心管屮，棄下層有機(jī)相；加入等體積氯仿/異戊醇(24:1),儀 搖動(dòng)10min, 12000r/min離心15min,輕輕吸取上層水相于另一離心管中，棄下層 有機(jī)相；加入兩倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)管子，dna呈絮狀析出，用1ml 吸頭（滅菌）吸出dna沉淀，放入l5i】il離心管屮，加入預(yù)冷無(wú)水乙醇洗滌一次， 離心棄去無(wú)水乙醇，再用75%乙醇漂洗2次，小心吸去乙醇，待dna沉淀自然干燥 后,加入適量te （loou 1300u1）溶解。1.2. 2引物設(shè)計(jì)及其序列引物參考滑國(guó)華等（2008）進(jìn)行設(shè)

23、計(jì)，序列如下：上游引物：5' acgacccgaggatctattcc 3'下游引物：5' atataagtcctggggcttcagatt 3',在下游引物中引入錯(cuò)配堿基a,當(dāng)突變位點(diǎn)為g （即反義鏈為c）時(shí)，可形 成hini i （gattc）酶切位點(diǎn)；當(dāng)突變位點(diǎn)為a （即反義鏈為t）時(shí)，該酶切位 點(diǎn)缺失，由此可進(jìn)行基因型判定。1.2.3.pcr擴(kuò)增及其電泳檢測(cè)1.2. 3. 1 pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系（表2）表2 pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系（20ul）table 2 pcr amplification of the response system （20 u 1）反應(yīng)

24、體系response system反應(yīng)體積v(u1)response volume (u 1)滅菌蒸餡水14.610x buffer2mg2*1.2dntp0.2上游引物0.4下游引物0.4taq dna 聚合酶(5 u/ml )0.2模板dna1total201.2. 3.2退火溫度的優(yōu)化利用pcr機(jī)器上都有一個(gè)gradient功能，在一次pcr過(guò)程屮，對(duì)機(jī)器屮不 同位點(diǎn)的反應(yīng)采用不同的退火溫度，一般在第一次實(shí)驗(yàn)中，采用引物溶點(diǎn)上下10度設(shè)置退火溫度梯度。每個(gè)溫度梯度一個(gè)反應(yīng)，最后電泳檢測(cè)并比較各個(gè)退 火溫度的條帶效果，得到最好結(jié)果。本試驗(yàn)屮退火溫度設(shè)定為55 65°c,結(jié)果 表明

25、，退火溫度60°c時(shí)，無(wú)菲特異性帶，1=1的條帶最為清晰。1.2. 3.3 pcr反應(yīng)程序(表3)表3 pcr反應(yīng)程序table 3 pcr ampliflcation of the response term步驟stepspcr反應(yīng)條件pcrreactionconditi ons溫度temperature時(shí)間time1預(yù)變性95 °c5min2c變性95 °c30sec3c退火60 °c30sec4c延伸72 °c30sec5延伸72 °c7min6保溫16°clomin第二步至第四步循環(huán)35次。1.2. 3.4瓊脂糖凝膠

26、電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，eb染色，利用b10rad凝膠成 相系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析，記錄結(jié)果并拍照。1.2. 3. 4.1瓊脂糖凝膠電泳方法(1) 灌膠將透明膠帶粘于灌膠模槽的兩端，制成灌膠模。放入梳子。將模放于水平臺(tái) 上。取一燒杯，放入：瓊脂糖0.75 g； 1xtae 50 mlo混勻，加熱，至瓊脂糖 徹底溶解。待稍冷后，加入5ul飽和的渓乙錠，輕晃混勻，然后輕輕倒入模子。 用吸頭吸去表面小泡。待冷卻成膠。(2) 上樣電泳輕輕拔出梳子，將膠兩頭的透明膠帶揭去，移入電泳槽，點(diǎn)樣孔一側(cè)靠近操 作者，注入1xtae緩沖液，浸沒(méi)凝膠。使用微量可調(diào)采樣器取3u1d

27、na充分混 勻于適量澳酚蘭，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，并點(diǎn)3u 1 600bp marker i作 為參照。點(diǎn)樣時(shí)，加樣頭尖端插入上樣孔內(nèi)1/3高度，輕輕將樣品推入，避免刺 入前后凝膠和刺穿凝膠底部。使比重較大的樣品自然沉入上樣孔底。接上電源：陽(yáng)極遠(yuǎn)離上樣孔，陰極靠近上樣孔（dna向陽(yáng)極移動(dòng)）。開(kāi)啟電源，電壓調(diào)至100vo 2030min后檢查。1.2. 3. 4. 2成像分析利用bi0rad凝膠成和系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析，記錄結(jié)果并拍照。1.2. 4.限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物以及電泳檢測(cè)1.2.4. 1酶切反應(yīng)體系(表4)表4酶切反應(yīng)體系table 4 pcr and the am

28、ount of the components反應(yīng)體系response system反應(yīng)體積v（p1）response volume (u 1)4. 70. 310滅菌蒸諸水10x buffer/77f i限制性內(nèi)切酶pcr產(chǎn)物total將上述酶切體系置37°c水浴鍋或恒溫箱中酶切過(guò)夜。1. 2. 4. 2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)1. 2. 4. 2.1聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟不同的實(shí)驗(yàn)需要優(yōu)化聚丙烯瞅胺凝膠的交聯(lián)度和濃度，才能達(dá)到最好的實(shí)驗(yàn) 效果，木實(shí)驗(yàn)采取一下方法：1.在小燒杯中加入l&43ml雙蒸水，9. 33ml 30%丙烯瞅胺（29:1）, 7ml的5 xtbe

29、混勻；2.清洗制膠用玻璃板，烘t后用透明膠封好底邊和側(cè)邊，固定在制膠用的有機(jī) 玻璃板上；3.向小燒杯中加入245ul的10%ap, 13ul temed混勻后迅速灌膠；4.當(dāng)膠灌至離玻璃板上邊緣0.5cm時(shí)停止灌膠，插入梳了，注意梳齒下不要有 氣泡，室溫聚合1小時(shí)；凝膠聚合好后，拔出梳子，注射器吸出梳齒孔中未聚合的液體；取下玻璃板，撕下膠線，固定在電泳槽上，倒入電泳緩沖液1 xtbe；在pcr產(chǎn)物中加入1/6體積上樣緩沖液，用微量進(jìn)樣器取5ul酶切樣點(diǎn)樣， 同時(shí)點(diǎn)分子量標(biāo)記物pbr322/mspl；8.上樣完畢后，打開(kāi)電泳議以80v電泳20min,再調(diào)到120v屯泳45h。1. 2. 4. 2

30、. 2聚丙烯酰胺凝膠染色步!1. 拆下電泳裝置，剝下聚內(nèi)烯醜胺凝膠，放到一個(gè)駛料盤內(nèi)，用雙蒸水沖漂洗 2次；2. 加入500ml 10%乙醇固定液，在搖床上固定810 min,棄去反應(yīng)液；3. 加入500ml 1%hno3氧化，在搖床上輕搖810 min,棄去反應(yīng)液，用雙蒸 水漂洗2次；4. 倒入500ml 0.2%agn03銀染液，染色1530 min,棄去反應(yīng)液，用雙蒸水 漂洗2次；5. 加入500ml3%na2c03顯色液，于-搖顯色至出現(xiàn)清晰的銀染帶，迅速棄去反應(yīng)液；6. 用500ml 3%hac停止顯色；7. 將已經(jīng)染好的聚丙烯酰胺凝膠置于透射白光板上，觀察酶切反應(yīng)結(jié)果、記錄 并拍照

31、。1.2. 5統(tǒng)計(jì)分析基因頻率與基因型頻率使用軟件spss 10. 0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同基因型對(duì)產(chǎn) 羔數(shù)的最小二乘均值分析使用sas (8. 0版)glm (general linear model)軟件 包進(jìn)行，模型如下：丫誹1 二卩 +gi+pi+eijky麗為產(chǎn)羔數(shù)，卩為群體均值，&為基因型效應(yīng)，p：為胎次效應(yīng)，e,為隨機(jī) 效應(yīng)。基因效應(yīng)分析：加性效應(yīng)二(gg-aa) /2顯性效應(yīng)二ag- (aa+gg) /22結(jié)果與分析2.1 pcr擴(kuò)增結(jié)果擴(kuò)增波爾山羊和馬頭山羊基因組，產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到 的片段與預(yù)期片斷大小一致(197bp),條帶清晰(圖1),特異性高，

32、滿足后續(xù) 分析要求。6200b p100bp600bp500bp400bp300b pm 12345圖1 pcr擴(kuò)增結(jié)果注：m, marher i loobp dna ladder； 1、2、3 為波爾山羊 dna 擴(kuò)增產(chǎn)物；4、5、6為馬頭山羊dna擴(kuò)增產(chǎn)物fig. 1 agarose gel electrophoresis of pcr productm, 1-3, 4-6: loobp dna ladder, pcr product of ?goat, pcr product of ?goat2. 2酶切結(jié)果利用限制性內(nèi)切iw hini i對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，使用8%的聚丙烯酰胺

33、凝膠(29： 1)電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。在197 bp的擴(kuò)增片段在118bp處存在另一 力?f i酶切位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生118 bp和79bp片段，其中波爾山羊在118處的酶切位點(diǎn)存在多態(tài)性，酶切位點(diǎn)的存 在與缺失產(chǎn)生2種基因型，分別命名為aa和gg:aa ( 118bp/118bp )、gg(118bp /79bp ),酶切圖譜見(jiàn)圖2 ；而馬頭山羊在118處的酶切位點(diǎn)則無(wú)多 態(tài)性，基因型均為aa型。酶切圖譜見(jiàn)圖3。1 2 34 5 67 8 9 10 11 m118bp90bp79bp67bp147bp123bp110bp圖2波爾山羊酶切圖譜注：m, pbr322/msp 1 marher； 11

34、3為酶切產(chǎn)物條帶fig.2 genotypes of the m tnr1a fragment defined by pcr-rflp123456 m118bp160bp147bp123bp110bp90bp圖3馬頭山羊酶切圖譜注：m, pbr322/msp 1 marherl8為酶切產(chǎn)物條帶fig.3 genotypes of the m tnr1a fragment defined by pcr-rflp2.3褪黑激素基因頻率和基因型頻率分析結(jié)果分析兩種山羊品種的褪黑激素基因型頻率發(fā)現(xiàn)，在該酶切位點(diǎn)，馬頭山羊只 岀現(xiàn)aa基因型，波爾山羊雖然出現(xiàn)兩種基因型，但aa型頻率高于gg型。在所 檢測(cè)

35、的兩個(gè)群體中，a等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因。表6山羊mtnrlk基因hint i酶切基因型和基因頻率分布表table 6 genotype and allele frequencies of hint i -rflp for the goat m tnra gene品種breed數(shù)量n基因型genetypegenetype frequency等位基因頻率allele frequency波爾山羊65aagg0. 5540.446a 0.554g 0.446基因型頻率馬頭山羊 51aa1a 12.4 mtnr1a基因型與波爾山羊頭胎產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析由表7可知，波爾山羊的aa基因純合型頭胎平均產(chǎn)羔數(shù)

36、比gg基因雜合型多0.07只，加性效應(yīng)值為0.035,顯性效應(yīng)值為-1.42。研究表明：波爾山羊的a 等位基因可能與山羊頭胎產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)，該位點(diǎn)主要以加性方式起作用。表7波爾山羊mtnrk基因型對(duì)頭胎產(chǎn)羔數(shù)性狀的最小二乘均值及基因效應(yīng)分析table 7 least squares means and allele substitution effects for litter size at first kidding in boar goat品種breed數(shù)量n基因型genetype最小二乘均值土標(biāo)準(zhǔn)誤加性效應(yīng)additiveeffec顯性效應(yīng)dominanteffectsleas tme

37、ans土 standardsquareserroraa1.4545 ±0.5222波爾山羊65gg1. 3846 ±0.50640. 035-1.422. 5 mtnrk基因型與經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析由表8可知，波爾山羊的aa型經(jīng)產(chǎn)羔數(shù)比gg型多0.09只；加性效應(yīng)值為 0. 046,顯性效應(yīng)值為-1.84。結(jié)果表明：a等位基因可能與波爾山羊產(chǎn)羔數(shù)呈正 和關(guān)，該位點(diǎn)主要以加性方式起作用。表8波爾山羊mtnr a基因型對(duì)經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)性狀的最小二乘均值及基因效應(yīng)分析table 8 least squares means and allele substitution effec

38、ts for litter size in multiparous boar goat基因型genetype最小二乘均值土標(biāo)準(zhǔn)誤least squares means±standarderror加性效應(yīng)additiveeffects顯性效應(yīng)dominanteffectsaagg1.8827±0. 58711.7905 ±0.59880. 046-1.843討論3. 1不同山羊品種基因型頻率及基因頻率差異利用熒光原位雜交方法和遺傳連鎖分析方法，褪黑激素受體1a已經(jīng)在綿羊 等多種動(dòng)物屮得到精細(xì)定位。并有多個(gè)研究結(jié)果表明，褪黑激素受體1a基因與 綿羊的繁殖性狀有著緊密的

39、關(guān)聯(lián)。在本研究所檢測(cè)的兩個(gè)山羊群體中，基因型頻 率及基因頻率存在較大差異。木研究結(jié)果顯示：馬頭山羊是aa基因型純合群體, 而波爾山羊屮存在aa和gg兩種基因型。這可能與兩個(gè)品種的育成史有關(guān)。馬頭 山羊是湖北省木地品種，長(zhǎng)期閉鎖選育，湖北馬頭山羊具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快、繁 殖率高等特點(diǎn)，其全年均可發(fā)情，母羊一年產(chǎn)2胎，年產(chǎn)羔率428%,平均窩產(chǎn) 羔數(shù)2. 14頭，馬頭山羊繁殖力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全國(guó)其它地方良種山羊品種(楊利國(guó)， 2004)。波爾山羊是引入品種，平均窩產(chǎn)羔數(shù)為193頭，低于馬頭山羊。這也與 木研究結(jié)果符合，木研究結(jié)果顯示aa基因型頭胎和經(jīng)產(chǎn)羔數(shù)均大于gg型 而馬 頭山羊群體均為m基因型。3.

40、2 mtnrk不同基因型對(duì)波爾山羊產(chǎn)羔數(shù)的影響木研究結(jié)果顯示：在山羊樣本中，無(wú)論是頭胎還是經(jīng)產(chǎn)山羊，褪黑激素受體 1a不同的基因型對(duì)性狀的影響表現(xiàn)都為aa>gg,由于受到樣本含量限制，該差 異并未達(dá)到顯著水平，但是該結(jié)果初步揭示褪黑激素受體1a基因可能與山羊繁 殖性狀相關(guān)，而該基因是否能夠作為分子標(biāo)記應(yīng)用于山羊繁殖性狀標(biāo)記輔助選 擇，則需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量，增加品種個(gè)數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)1滑國(guó)華.山羊繁殖性狀五個(gè)候選基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分 析.碩士學(xué)位論文武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書(shū)館，20062吳偉生抑制素基因作為山羊多胎性侯選基因的研究.碩士學(xué)位論文武 漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書(shū)館，2

41、0063周文然，儲(chǔ)明星，孫少華等.小尾寒羊高繁殖力候選基因inha的研究.農(nóng) 業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007, 15(1)： 32-364陳桂芳，李齊發(fā)，強(qiáng)巴央宗等.四藏耗牛和黑白花奶牛生長(zhǎng)激素基因alu 1多態(tài)性的比較研究.畜牧與獸醫(yī)，2002, 35： 115儲(chǔ)明星，程篤學(xué)，劉文忠褪黑激素受體1a基因外顯子2與小尾寒羊高繁 殖力的關(guān)聯(lián).安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 35 (1) : 1246王林楓光照和埋植褪黑激素對(duì)內(nèi)蒙古白絨山羊含氮物質(zhì)分配和產(chǎn)絨性能 的影響及調(diào)控的研究.碩士學(xué)位論文.內(nèi)蒙古：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書(shū) 館，20047閆守慶，王慧芳，祝萬(wàn)菊.藍(lán)狐與銀狐褪黑激索受體1a基因的克隆及序列 分析.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008, 35： 38季從亮，儲(chǔ)明星，陳國(guó)宏.4個(gè)綿羊品種褪黑激素受體la基因第二外顯 子pcrrflp分析.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003, 4 (22) : 29 郭