生物傳感芯片界面免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究

1、    生物傳感芯片界面免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究    郭泓利+周小紅+張巖+施漢昌摘 要：近年來，具有高親和性和特異性的免疫反應(yīng)在生物化學(xué)分析、食品安全和環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用，抗體-抗原親和反應(yīng)分析方法的研究顯得尤為重要。本文基于平面波導(dǎo)生物傳感器，研究芯片界面抗體-抗原間的相互作用。通過共價(jià)結(jié)合將包被抗原結(jié)合在芯片表面，制備了可重復(fù)使用20次的免疫芯片，研究芯片表面的免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，建立芯片表面的熒光免疫動(dòng)力學(xué)方程，獲得了相應(yīng)的免疫親和參數(shù)。關(guān)鍵詞：平面波導(dǎo)；熒光免疫；動(dòng)力學(xué)分析；抗體-抗原反應(yīng)0 引言近年來，具有高親和性和特異性的免疫反應(yīng)在

2、醫(yī)學(xué)診斷、生物化學(xué)分析、食品安全和環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用1，2，抗體-抗原親和反應(yīng)的定性或定量分析方法的研究顯得尤為重要。傳統(tǒng)的分析方法有熱量測定法、電泳分析法、超速離心分析法，但這些方法僅適用于低通量分析，且結(jié)果分辨率較差。為了克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，光學(xué)生物傳感器開始應(yīng)用于免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，如spr3、bli4，5、光波導(dǎo)生物傳感器6，這些技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)數(shù)據(jù)分析，并且更加快速和靈敏7-11。本文基于平面波導(dǎo)生物傳感器建立了一種分析芯片界面抗體-抗原免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的方法。該方法研究了芯片表面包被抗原與溶液中單克隆抗體的免疫反應(yīng)，并得到了芯片界面免疫反應(yīng)的結(jié)合速率、解離速

3、率和親和常數(shù)。本文主要選取了三聚氰胺、黃曲霉素m1、磺胺二甲嘧啶和雙酚a這四種物質(zhì)的單克隆抗體-抗原反應(yīng)作為研究對(duì)象，研究了在芯片界面的免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，為基于免疫反應(yīng)的檢測研究提供了數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。1 試驗(yàn)材料和方法1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)中使用的材料主要包括如下：bsa（sigma），三聚氰胺（mel）、磺胺二甲嘧啶（sm2）、雙酚a（bpa）和黃曲霉四m1（afm1）單克隆抗體，bsa-mel，bsa-afm1，bsa-bpa，bsa-sm2，gmbs（sigma），cy5.5-nhs（ge），mts（sigma），10mm pbs，100mm pbs，h2so4，30%h2o2，sds，

4、hcl，naoh。1.2 免疫芯片的制備本試驗(yàn)利用mts和gmbs在芯片表面固定包被抗原。反應(yīng)流程如圖1所示。主要步驟如下：a.芯片表面羥基化12：將干凈的芯片浸泡在piranha溶液中（濃h2so4/ 30%h2o2體積比為3：1），在110下反應(yīng)60min；b.芯片表面硅烷化：用無水甲苯配置2%的mts溶液，將芯片置于其中反應(yīng)2個(gè)小時(shí)；c.引入偶聯(lián)基團(tuán)：首先將芯片置于無水乙醇配置的2mm的gmbs溶液中，反應(yīng)1個(gè)小時(shí)；d.包被抗原的固定：將15l0.5mg/ml被抗原滴在芯片的全反射位點(diǎn)上。在溫度為4的條件下反應(yīng)12小時(shí)后，用超純水清洗殘留包被抗原，隨后用2mg/ml的bsa溶液封閉芯片表

5、面未反應(yīng)的活性基團(tuán)。未測驗(yàn)時(shí)，免疫芯片保存于4冰箱，保持芯片表面清潔。1.3 平面波導(dǎo)生物傳感器本研究組自主研發(fā)了平面波導(dǎo)生物傳感器，該傳感器主要基于倏逝波和全內(nèi)反射熒光原理（tirf）13，14，利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝波激發(fā)芯片表面數(shù)百納米薄層內(nèi)的熒光基團(tuán)，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)，傳感器采用光纖收集熒光信號(hào)，再通過光電轉(zhuǎn)換器將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。利用平面波導(dǎo)生物傳感器定量分析目標(biāo)物質(zhì)，就必須設(shè)計(jì)巧妙的方法將目標(biāo)物質(zhì)的濃度與熒光信號(hào)的強(qiáng)弱建立正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)的關(guān)系。該生物傳感器主要由傳感元件、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、光學(xué)分析系統(tǒng)和信號(hào)處理系統(tǒng)4個(gè)部分組成，如圖2所示。1.4 實(shí)驗(yàn)方法將固定

6、了bsa-mel、bsa-bpa、bsa-sm2和bsa-afm1的生物芯片置于平面波導(dǎo)生物傳感器的反應(yīng)池。所有反應(yīng)都在10mm pbs緩沖體系中進(jìn)行。為了獲得動(dòng)力學(xué)結(jié)合數(shù)據(jù)，通入不同濃度的抗體混合液（含有ab-mel-cy5.5、ab-afm1-cy5.5、ab-sm2-cy5.5和ab-bpa-cy5.5四種標(biāo)記熒光的抗體）與芯片反應(yīng)，獲得不同時(shí)間條件下的信號(hào)強(qiáng)度。每次反應(yīng)結(jié)束后，用0.5% sds（ph為1.9）的緩沖溶液打斷抗體和芯片表面抗原之間的化學(xué)鍵，同時(shí)保持芯片表面抗原的活性，實(shí)現(xiàn)芯片的重復(fù)使用，節(jié)省成本的同時(shí)，還能保證結(jié)果的一致性。1.5 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和親和性分析抗體和抗原的特異

7、性主要由抗原決定簇的空間位置決定?？贵w在任何一個(gè)系統(tǒng)中都有一個(gè)有限的親和性，可用解離常數(shù)kd（單位為m）來表示，kd是解離速率（kd，s-1）與結(jié)合速率（ka，m-1s-1）的比值15，16：kd=kd/ka （1）抗體與抗原的反應(yīng)關(guān)系可用以下的關(guān)系式來表示：（2）其中，agab*表示抗體-抗原復(fù)合物，ab* 表示熒光標(biāo)記的抗體，ag表示抗原。由于芯片表面質(zhì)量平衡，芯片界面免疫復(fù)合物的濃度變化速率可以表示為：（3）其中，ag指抗原的濃度（m），ab*指熒光標(biāo)記的抗體濃度（m）， 代表抗體-抗原復(fù)合物濃度的變化速率（m-1s-1）。基于平面波導(dǎo)生物傳感器的檢測原理，抗體-抗原復(fù)合物的濃度與熒光信

8、號(hào)強(qiáng)弱成正相關(guān)，因此我們可以得到熒光信號(hào)變化速率與抗體濃度、結(jié)合速率、解離速率等有關(guān)的關(guān)系式：（4）積分后可得以下關(guān)系式：（5）其中， 是cy5.5-抗體的初始濃度，rt是任意t時(shí)刻的響應(yīng)信號(hào)，rmax是最大的響應(yīng)信號(hào)值。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行積分?jǐn)M合，獲得相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)關(guān)系式和相應(yīng)參數(shù)，每個(gè)響應(yīng)值r都被重復(fù)測量3次，取其平均值用于計(jì)算模擬。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 2.1 芯片界面的熒光免疫反應(yīng)將芯免疫片置于平面波導(dǎo)生物傳感器的反應(yīng)池中，通入不同濃度的抗體混合液，記錄不同時(shí)間下的響應(yīng)信號(hào)。圖3為不同濃度的四種抗體與芯片表面抗原的隨時(shí)間變化的結(jié)合曲線。當(dāng)抗體濃度過大或者過小時(shí)，信號(hào)不會(huì)隨時(shí)間的變化發(fā)生明顯的變

9、化。高濃度時(shí)，結(jié)合反應(yīng)容易更快地達(dá)到平衡，低濃度時(shí)，則需要更長的時(shí)間來達(dá)到平衡。因此實(shí)際反應(yīng)時(shí)，濃度的選擇不可以太低，但是濃度也不宜太高，太高會(huì)大大提高檢測的成本。2.2 動(dòng)力學(xué)和親和力分析結(jié)果為了計(jì)算抗體-抗原免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，首先要剔除檢測結(jié)果中的一些異常值。為了獲得芯片表面免疫反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)ka和kd，同樣需要確定rmax值。通過改變抗體濃度，測定平衡時(shí)間（t為600s）的信號(hào)強(qiáng)度，然后通過logistic擬合可獲得理論rmax值，如圖4所示。當(dāng)芯片表面bsa-ags為0.5mg/ml時(shí)，黃曲霉素m1、雙酚a、三聚氰胺和磺胺二甲嘧啶抗體與芯片反應(yīng)可以得到的最大理論響應(yīng)值rmax分別為

10、23228m.v、45445m.v、15424m.v和15770 m.v。獲得rmax后，將圖3的結(jié)合結(jié)果除以相應(yīng)的rmax值，可以得到不同濃度條件下芯片界面免疫反應(yīng)的結(jié)合率（binding%）隨時(shí)間的變化，如圖5所示。結(jié)合率為每點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與理論擬合得到的反應(yīng)平衡時(shí)最大熒光強(qiáng)度rmax的比值，由圖中結(jié)果可知，反應(yīng)時(shí)間相同，分析物濃度越大，反應(yīng)達(dá)到平衡所需時(shí)間越短。用spr分析研究免疫動(dòng)力學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)平衡時(shí)的結(jié)合率為100%時(shí)，此時(shí)使用的初始抗體濃度通常為100kd；當(dāng)平衡時(shí)的結(jié)合率為50%時(shí)，此時(shí)使用的初始抗體濃度通常為kd；當(dāng)平衡時(shí)的結(jié)合率接近于0時(shí)，此時(shí)使用的初始抗體濃度通常為0.1kd

11、。根據(jù)此經(jīng)驗(yàn)，并且結(jié)合圖5，可以迅速選擇合適的抗體濃度用于檢測。隨后對(duì)結(jié)果進(jìn)行積分?jǐn)M合，得到類似于公式5的關(guān)系式：（6）（7）（8）表1總結(jié)了各個(gè)免疫反應(yīng)的參數(shù)a、b和動(dòng)力學(xué)參數(shù)ka，kd，kd。ab-afm1、ab-bpa、ab-mel和ab-sm2四種抗體在芯片界面的免疫反應(yīng)結(jié)合速率ka分別為0.37×106 m-1s-1，3.36×106m-1s-1，1.09×106m-1s-1和5.19×106 m-1s-1。四種抗體的芯片界面免疫反應(yīng)解離速率kd分別為0.30×10-3s-1，4.74×10-3s-1和3.60×1

12、0-3s-1和1.01×10-3s-1。而其免疫解離常數(shù)kd則分別為0.81nm，1.10nm，3.40nm和1.01nm?？梢?，ab-afm1的親和力最好，ab-mel的親和力最差。表2比較了用平面波導(dǎo)生物傳感器與elisa測量的動(dòng)力學(xué)參數(shù)kd，平面波導(dǎo)測定的kd值都高于elisa測定值。分析可能原因主要是本次試驗(yàn)測定的抗體都為熒光標(biāo)記后的抗體，熒光標(biāo)記過程會(huì)對(duì)抗體的親和性產(chǎn)生影響，而elisa測定的抗體無需標(biāo)記熒光染料。2.3 芯片界面免疫反應(yīng)的重復(fù)性能分析免疫芯片的穩(wěn)定性和重復(fù)性是影響檢測的重要指標(biāo)。由于目標(biāo)物質(zhì)通常為小分子，很難直接被固定到芯片上，因此通常將包被抗原作為識(shí)別分

13、子共價(jià)結(jié)合到芯片表面，包被抗原相對(duì)于小分子生物特性、化學(xué)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。為了實(shí)現(xiàn)芯片的重復(fù)使用，在每一次檢測結(jié)束后，采用0.5%的sds（ph為1.9）溶液清洗芯片表面，使抗體-抗原復(fù)合物解離，卻不會(huì)破壞芯片表面包被抗原的活性。從圖6結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，ab-mel結(jié)合信號(hào)為7363m.v，20次反應(yīng)測量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（r.s.d.）為2.79%；ab-bpa結(jié)合信號(hào)為20496m.v，20次反應(yīng)測量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（r.s.d.）為3.44%；ab-afm1結(jié)合信號(hào)為14386m.v，20次反應(yīng)測量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（r.s.d.）為3.25%；ab-sm2結(jié)合信號(hào)為7631m.v，20次反應(yīng)

14、測量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（r.s.d.）為4.33%。測試結(jié)果表明免疫芯片至少可以測試20次以上，并且保證沒有明顯的信號(hào)變化（變化在5%以內(nèi)）。3 結(jié)論本文基于平面波導(dǎo)生物傳感器研究了芯片界面的抗體-抗原這類具有高親和力的生物反應(yīng)間的相互作用。通過共價(jià)結(jié)合將包被抗原結(jié)合在芯片表面，制備了可重復(fù)使用20次的免疫芯片，通過熒光信號(hào)將物質(zhì)濃度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，成功地測得了濃度數(shù)據(jù)。基于理論動(dòng)力學(xué)方程，提出了適用于平面波導(dǎo)生物傳感器的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)方程及其數(shù)據(jù)分析方法，成功地獲得了黃曲霉素m1、三聚氰胺、雙酚a和磺胺二甲嘧啶四種乳品中常見污染物的抗體-抗原免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其kd分別為0.81nm，3.40nm，1.10nm和1.01nm；ka分別為0.37×106m-1s-1，1.