補陽還五湯對病毒性心肌炎模型小鼠心肌組織中MMPs和TIMPs表達的影響

1、    補陽還五湯對病毒性心肌炎模型小鼠心肌組織中mmps和timps表達的影響    秦又發(fā) 周光輝 潘春予 朱永坤 楊宇峰 蒲榮r965.1;r285.5 文獻標志碼 a 1001-0408（2019）22-3084-06doi 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.12摘 要 目的：探討補陽還五湯對病毒性心肌炎（vmc）模型小鼠心肌組織中基質(zhì)金屬酶（mmps）、組織金屬蛋白酶抑制因子（timps）表達的影響。方法：將雄性balb/c小鼠隨機分為對照組、模型組、陽性對照組卡托普利，100 mg/（kg·d）和補陽

2、還五湯低、中、高劑量組6、18、36 g/（kg·d），每組24只。除對照組外，其余各組小鼠均單次腹腔注射柯薩奇b3病毒以復制vmc模型。造模成功后，對照組和模型組小鼠均灌胃等容生理鹽水，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)30 d。觀察各組小鼠的一般情況。以病毒接種當日為0 d，分別于4、10、20、30 d時檢測小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值（hw/bw）;采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠心肌組織形態(tài)學特征，并進行心肌病理組織學評分;采用苦味酸天狼猩紅染色法觀察小鼠心肌組織中、型膠原蛋白的分布情況，并計算/型膠原蛋白比值。于30 d時，采用western blotting法檢測小鼠

3、心肌組織中mmp-1、mmp-3、mmp-9、timp-1的相對表達量，并計算mmps/timps。結(jié)果：與對照組比較，模型組小鼠出現(xiàn)煩躁、拱背、對刺激反應(yīng)減輕、體質(zhì)量減輕甚至精神萎靡等癥狀;其心肌組織可見典型的炎癥性改變和局部間質(zhì)細胞充血，并伴有大量淋巴細胞浸潤和、型膠原蛋白分布，其hw/bw（1030 d各時間點）、心肌病理組織學評分（430 d各時間點）、/型膠原蛋白比值（430 d各時間點）以及mmp-1、mmp-9的相對表達量和mmps/timps均顯著升高，而mmp-3、timp-1的相對表達量均顯著降低（p關(guān)鍵詞 補陽還五湯;病毒性心肌炎;心肌纖維化;基質(zhì)金屬蛋白酶;組織金屬蛋白

4、酶抑制因子;小鼠effects of buyang huanwu decoction on the expression of mmps and timps in cardiac tissue of viral myocarditis model miceqin youfa1，zhou guanghui2，pan chunyu1，zhu yongkun1，yang yufeng3，pu rong4（1. dept. of pharmacy， dongguan third peoples hospital， guangdong dongguan 523326， china; 2. dept. o

5、f rehabilitation medicine， dongguan third peoples hospital， guangdong dongguan 523326， china; 3. dept. of pathology， dongguan third peoples hospital， guangdong dongguan 523326， china; 4. dept. of clinical laboratory， dongguan third peoples hospital， guangdong dongguan 523326， china）abstract   o

6、bjective： to investigate the effects of buyang huanwu decoction on the expression of mmps and timps in cardiac tissue of viral myocarditis （vmc） model mice. methods： male balb/c mice were randomly divided into control group， model group， positive control group captopril， 100 mg/（kg·d）， buyang h

7、uanwu decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups 6， 18， 36 g/（kg·d）， with 24 mice in each group. except for control group， other groups were given coxsackie virus b3 once intraperitoneally to induce vmc model. after modeling， control group and model group were given constant volume of

8、 normal saline intragastrically; administration groups were given relevant medicine intragastrically; once a day， for consecutive 30 days. the general situation of mice in each group was observed. the day of inoculation was set at 0 d， heart mass to body mass ratio （hw/bw） was measured at 4， 10， 20，

9、 30 d after inoculation. the morphological characteristics of myocardium were observed by he staining， and the myocardial histopathological scores of myocardium were evaluated. the distribution of type and collagen in myocardium was observed by abcam picrosirius red staining， and the ratio of type t

10、o collagen was calculated. at 30 d， relative expressions of mmp-1， mmp-3， mmp-9 and timp-1 in cardiac tissue were detected by western blotting assay， and the ratio of mmps to timps was calculated. results： compared with control group， mice in model group suffered from irritability， arch back， allevi

11、ation of stimulation response， reduction of body mass and even mental depression. typical inflammatory changes and local interstitial hyperemia were observed in the myocardium， accompanied by a large number of lymphocyte infiltration and distribution of type and collagen. hw/bw （at different time po

12、ints of 10-30 d）， myocardial histopathological score （at different time points of 4-30 d）， ratio of type and collagen （at different time points of 4-30 d）， the expression of mmp-1 and mmp-9， ratio of mmps to timps were increased significantly， while the expression of mmp-3 and timp-1 were decreased

13、significantly （pkeywords   buyang huanwu decoction; viral myocarditis; myocardial fibrosis; mmp;timp; mice心肌纖維化是病毒性心肌炎（viral myocarditis，vmc）最嚴重的并發(fā)癥，而基質(zhì)金屬蛋白酶（mmps）與組織金屬蛋白酶抑制因子（timps）失衡是引起vmc心肌纖維化的重要病理基礎(chǔ)1-2。藥理研究證實，補陽還五湯具有抑制肺纖維化3和腎間質(zhì)纖維化4的作用;同時本課題組前期研究也證實，該方對vmc模型小鼠心肌纖維化具有一定的抑制作用5，但具體的作用機制尚并不明確。為此

14、，本研究以腹腔接種柯薩奇b3病毒（cvb3）致vmc模型小鼠為對象，通過檢測其心肌、型膠原的含量以及mmp-1、mmp-3、mmp-9、timp-1蛋白的表達情況，初步探討mmps/timps在補陽還五湯抑制vmc心肌纖維化中的作用，旨在為闡明該方抗vmc心肌纖維化的機制提供依據(jù)，為尋找中藥方劑治療vmc心肌纖維化的新靶點提供參考。1 材料1.1 儀器eclipse ti-sr型倒置熒光顯微鏡、ds-u3型成像系統(tǒng)（日本nikon公司）;bx53-p型偏振光顯微鏡（日本olympus公司）;trans-blot? sd semi-dry transfer cell型垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國b

15、io-rad公司）;centrifuge5424型高速離心機（德國eppendorf公司）。1.2 藥材、藥品與試劑補陽還五湯各組方藥材顆粒均購自東莞市中醫(yī)院，包括黃芪批號：8012463，規(guī)格：24 g，顆粒當量（即顆粒劑與原藥材質(zhì)量的比值）：0.2 1、當歸尾（批號：8056523，規(guī)格：1.5 g，顆粒當量：0.25 1）、赤芍（批號：7120253，規(guī)格：1.0 g，顆粒當量：0.22 1）、地龍（批號：7106023，規(guī)格：0.3 g，顆粒當量：0.1 1）、川芎（批號：8061673，規(guī)格：0.65 g，顆粒當量：0.22 1）、紅花（批號：8040493，規(guī)格：0.48 g，顆粒

16、當量：0.16 1）、桃仁（批號：8041503，規(guī)格：0.6 g，顆粒當量：0.2 1）。卡托普利片（陽性對照，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：aas7080，規(guī)格：25 mg）;乙二胺四乙酸（edta）抗原修復液、蘇木精染液、伊紅染液、苦味酸天狼猩紅染液、ripa總蛋白裂解液、兔抗小鼠mmp-9單克隆抗體、辣根過氧化物酶（hrp）標記山羊抗兔免疫球蛋白g（igg）二抗、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）上樣緩沖液及相關(guān)試劑（武漢谷歌生物科技有限公司，批號分別為g1203、g1031、g1018、g1002、g2002、gb12132-1、gb23303、g2013、g

17、2018）;兔抗小鼠mmp-1、mmp-3、timp-1單克隆抗體艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號分別為ab137332、ab52915、ab86482;兔抗小鼠-肌動蛋白（-actin）單克隆抗體（內(nèi)參，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：af0003）;二喹啉甲酸（bca）蛋白含量測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：pc0020）;二氨基聯(lián)苯胺（dab）顯色液（美國hyclone公司，批號：35085）;mem培養(yǎng)基（美國gibco公司，批號：12571048）;其余試劑均為分析純，水為去離子水。1.3 動物spf級balb/c小鼠，雄性，4周齡，體質(zhì)量（17.2±0.84）

18、g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：scxk（京）2016-0006。1.4 病毒株cvb3 nancy標準株由廣州呼吸健康研究院惠贈，在hela細胞上傳代并凍融3次，病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（tcid50）為1×109個/ml。2 方法2.1 藥液的制備補陽還五湯每劑的總質(zhì)量為28.53 g（即黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁藥材顆粒各1袋，與該方處方組成一致），溶解于溫水（3040 ，下同）7.9 ml中，配制成質(zhì)量濃度約為3.6 g/ml（以顆粒劑總質(zhì)量計，下同）的藥液，再用溫水分別稀釋成1.8、0.6 g/ml的藥液，備用。2.2 分組、造模

19、與給藥所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、陽性對照組卡托普利100 mg/（kg·d），以溫水為溶劑;劑量參考相關(guān)文獻6-7設(shè)置和補陽還五湯低、中、高劑量組6、18、36 g/（kg·d），將“2.1”項下相應(yīng)質(zhì)量濃度藥液按10 ml/kg給藥;劑量參考本課題組前期研究及相關(guān)文獻3，5，8設(shè)置，每組24只。對照組小鼠單次腹腔接種不含病毒的mem培養(yǎng)基0.2 ml;其余各組小鼠均單次腹腔接種tcid50為1×109個/ml的cvb3病毒液0.2 ml（以mem培養(yǎng)基為溶劑）以復制vmc模型6，9。待模型復制成功（即小鼠出現(xiàn)煩躁、拱背，對刺激反應(yīng)減輕、

20、覓食減少和體質(zhì)量減輕，甚至精神萎靡等現(xiàn)象6，9）后，對照組和模型組小鼠均灌胃等容生理鹽水，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物;給藥體積均為10 ml/（kg·d），每日1次，連續(xù)30 d。2.3 小鼠一般情況于實驗過程中，觀察各組小鼠的一般情況，包括體態(tài)、精神、活動、對刺激的反應(yīng)、覓食和體質(zhì)量等。2.4 小鼠心肌標本的采集及處理將病毒接種當日計為0 d，分別于4、10、20、30 d時稱定小鼠體質(zhì)量（bw）后，各時間點隨機斷頸處死6只，摘取心臟，濾紙吸干后，稱定心臟質(zhì)量（hw），計算兩者比值（hw/bw，mg/g）。隨后沿左室長軸將心臟分為3份，保存，備用。2.5 心肌病理組織學檢查和心肌病

21、理組織學積分評價分別于4、10、20、30 d時采用蘇木精-伊紅（he）染色法檢測。取“2.3”項下1/3心肌組織，行常規(guī)石蠟切片（厚度約為5 m），經(jīng)he染色后，于倒置熒光顯微鏡下觀察心肌細胞的浸潤、壞死等情況。同時，每張切片隨機取5個高倍視野，計算每個視野中炎癥細胞浸潤及壞死面積（即病變面積，其病理表現(xiàn)為：細胞間質(zhì)充血，心肌細胞出現(xiàn)水腫且部分壞死崩解，血管周圍伴大量淋巴細胞浸潤）與整個視野面積的比例，并按如下標準進行心肌病理組織學積分：無病變計0分，病變面積比例75%計4分10。2.6 、型膠原蛋白檢測分別于4、10、20、30 d時采用苦味酸天狼猩紅染色法檢測。取“2.3”項下另1/3心

22、肌組織，行常規(guī)石蠟切片（厚度約為5 m），經(jīng)0.1%苦味酸天狼猩紅染液染色后，使用偏振光顯微鏡觀察（其中，型膠原蛋白呈黃紅色，排列緊密且具有較強的雙折光性;型膠原蛋白呈黃綠色，而雙折光性較弱）。每張切片選擇5個高倍視野拍照，并使用image pro plus software 6.0軟件分析、型膠原蛋白面積占整個視野面積的比例，并計算/型膠原蛋白比值（即兩者面積的比值）。2.7 相關(guān)蛋白表達情況檢測于30 d時采用western blotting法檢測。各組取“2.3”項下余下1/3心肌組織，剪碎，研磨，以ripa總蛋白裂解液1 ml在冰浴中裂解，于4 下以10 000×g離心15

23、min，取上清液采用bca法進行蛋白定量。取蛋白70 g，加至上樣緩沖液中，煮沸5 min變性，并進行sds-page電泳（濃縮膠濃度：5%，電壓：90 v;分離膠濃度：10%，電壓：120 v;電流：300 ma，時間：60 min）;電泳后轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗（稀釋度均為1 1 000），4 孵育過夜;tbst溶液清洗8 min×3次，加入二抗（稀釋度均為1 3 000），37 孵育1 h;tbst溶液清洗15 min×4次，以dab顯色顯色后，置于成像系統(tǒng)中成像并采用image j 1.48軟件處理。以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參-acti

24、n的灰度值比值表示該蛋白的相對表達量，并計算mmps與timps相對表達量的比值（即mmps/timps）。上述試驗重復6次。2.8 統(tǒng)計學方法采用spss 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用levene法進行方差齊性檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用tukey檢驗（方差齊）或dunnetts t3檢驗（方差不齊）。p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。3 結(jié)果3.1 動物一般情況實驗過程中，模型組小鼠于造模當日死亡1只，隨后補足。接種病毒后，對照組小鼠無明顯異常，模型組和各給藥組小鼠均出現(xiàn)煩躁、拱背、對刺激反應(yīng)減輕、覓食及體質(zhì)量減輕甚至精神

25、萎靡等癥狀。經(jīng)藥物干預后，各給藥組小鼠上述癥狀均有所緩解。3.2 hw/bw4 d時，各組小鼠hw/bw組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。10、20、30 d時，與對照組比較，模型組小鼠hw/bw均顯著升高（p<0.05），詳見表1。3.3 心肌病理組織學特征及心肌病理組織學積分對照組小鼠心肌細胞排列整齊，間質(zhì)未見充血及炎癥細胞浸潤;模型組小鼠心肌組織可見典型的炎癥性改變，局部細胞間質(zhì)充血，并伴大量淋巴細胞浸潤，其心肌病理組織學積分（430 d各時間點）均顯著升高（p3.4 /型膠原蛋白比值對照組小鼠心肌細胞間隙可見少量膠原蛋白。模型組小鼠心臟細胞間隙可見、型膠原蛋白，且

26、增生粗大的型膠原蛋白反復重疊、排列無序、直徑不均勻，伴有較強的雙折射光，其/膠原蛋白比值（430 d各時間點）均顯著升高（p3.5 mmp-1、mmp-3、mmp-9、timp-1蛋白的表達與對照組比較，模型組小鼠心肌組織中mmp-1、mmp-9的相對表達量和mmps/timps均顯著升高，mmp-3、timp-1的相對表達量均顯著降低（p<0.05），詳見圖3、表4。4 討論vmc是由嗜心性病毒感染引起的急性炎癥性心臟疾病，其致病病毒以cvb3多見11。約21%的急性vmc患者會出現(xiàn)心肌纖維化并進展為擴張型心肌病，導致心力衰竭12，其病理基礎(chǔ)為膠原蛋白在心肌細胞外基質(zhì)中過度沉積，主要表

27、現(xiàn)為膠原蛋白含量升高，膠原纖維排列、構(gòu)象紊亂以及/型膠原蛋白比例改變13。、型膠原蛋白主要由心肌成纖維細胞分泌，為心臟中主要的膠原蛋白，分別約占80%和11%。已有研究指出，與型膠原蛋白比較，型膠原蛋白的抗拉力更強，而伸展性和回縮性更弱，兩者的比例決定了心臟的順應(yīng)性及僵硬程度14。mmps是一組能特異性降解細胞外基質(zhì)的ca2+、zn2+依賴性蛋白水解酶家族，其重要成員mmp-1、mmp-3、mmp-9在正常心肌組織中的含量高于其他mmps，主要降解心肌中含量較多的、型膠原蛋白6，15。timps是一組可抑制mmps活性的多功能因子家族，兩者能以1 1的比例形成mmp-timp復合體，發(fā)揮阻斷m

28、mps與底物結(jié)合、抑制mmps活性的作用，其中timp-1能抑制除mmp-2和膜型-mmp以外的大多數(shù)mmps的活性。有研究顯示，vmc急性期大量炎癥細胞因子可通過誘導mmps、抑制timps的表達來增加心肌膠原蛋白的降解，此時mmps/timps最高;vmc恢復期至慢性期，timps逐漸上調(diào)，mmps/timps持續(xù)降低，心肌膠原蛋白的降解也隨之減弱或停止，但mmps/timps仍高于發(fā)病前，表明mmps與timps平衡的失調(diào)貫穿于vmc發(fā)病的整個過程7，16-18。本研究采用腹腔接種cvb3病毒液復制小鼠vmc模型。結(jié)果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)煩躁、拱背、對刺激反應(yīng)減輕、覓食減少、體質(zhì)量減輕、

29、精神萎靡等癥狀，心肌細胞可見明顯炎癥性改變及大量淋巴細胞浸潤，其hw/bw（1030 d各時間點）、心肌病理組織學積分（430 d各時間點）、/型膠原蛋白比值（430 d各時間點）、mmp-1和mmp-9的相對表達量以及mmps/timps均顯著升高，而mmp-3和timp-1的相對表達量均顯著降低。這提示小鼠vmc病程以炎癥性改變?yōu)橹?，并逐漸出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象，模型復制成功。但上述結(jié)果與李秀清等19研究結(jié)果不同的是，本研究中mmp-3在vmc模型小鼠心肌組織中的表達明顯降低，推測可能與本研究檢測的是vmc恢復期（30 d）mmp-3的表達有關(guān)，但尚需進一步研究予以證實。補陽還五湯出自清代名醫(yī)王清

30、任的醫(yī)林改錯，由生黃芪120 g、當歸6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g、地龍3 g組成，是治療氣虛血瘀證的代表方劑。其中，黃芪為君藥，味甘、性溫，具有補氣升陽、固表止汗、消腫生肌的功效;當歸為臣藥，具有補血的作用，有祛瘀而不傷好血之妙;川芎為佐藥，性溫、味辛，具有活血行氣、祛風止痛的功效;紅花、桃仁為佐藥，用量較少，但卻有活血化瘀之效;地龍為使藥，可通經(jīng)活絡(luò);諸藥合用，共奏補氣活血通絡(luò)之功，主要用于治療心腦血管梗死性疾病20-22。有臨床研究顯示，補陽還五湯可改善慢性阻塞性肺疾病合并肺間質(zhì)纖維化患者的肺功能，延緩肺組織纖維化23-24?，F(xiàn)代藥理研究證實，補陽還五湯可通

31、過抑制轉(zhuǎn)化生長因子1（tgf-1）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（erk）信號通路來發(fā)揮抑制肺間質(zhì)和腎間質(zhì)膠原纖維增殖，達到拮抗組織纖維化的目的3-4，13。為此，本研究以卡托普利作為陽性對照藥物（該藥具有較好的抑制vmc心肌纖維化的作用6），初步探討了不同劑量補陽還五湯對vmc模型小鼠相關(guān)指標的影響。結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組小鼠煩躁、拱背等一般情況以及心肌組織纖維化癥狀均有不同程度的改善，其hw/bw各給藥組1030 d各時間點（補陽還五湯低劑量組除外）、心肌病理組織學評分（各給藥組1030 d各時間點）、/型膠原蛋白比值（陽性對照組和補陽還五湯高劑量組410 d各時間點以及各給藥組2030

32、d各時間點）以及心肌組織中mmp-1（陽性對照組和補陽還五湯高劑量組）、mmp-9（各給藥組）的相對表達量和mmps/timps（各給藥組）均顯著降低，而mmp-3（陽性對照組和補陽還五湯低、高劑量組）和timp-1（各給藥組）的相對表達量均顯著升高。這提示補陽還五湯可降低vmc模型小鼠的hw/bw，改善其心肌病理組織學積分，抑制、型膠原蛋白增生，改善心肌組織中mmps/timps失衡狀態(tài)。但這種作用并非完全隨用量劑量的增大而增強，特別是對mmp-3、mmp-9、timp-1等蛋白表達的影響，其具體原因還需進一步研究予以明確。綜上所述，補陽還五湯可通過抑制心肌膠原蛋白增生，調(diào)節(jié)mmps、tim

33、ps的表達，改善vmc模型小鼠心肌mmps/timps的失平衡狀態(tài)等途徑來發(fā)揮對vmc心肌纖維化的抑制作用。但該方在調(diào)控mmps/timps平衡的分子機制和信號通路上仍不明確，有待后續(xù)研究予以完善。參考文獻 1 翟淑波，劉仕成，孫景輝.病毒性心肌炎的發(fā)病機制、診斷和治療j.實用兒科臨床雜志，2010，25（22）：1762-1764. 2 王娟，程志清.基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑與病毒性心肌炎心肌纖維化j.中國心血管雜志，2007，12（6）：476-479. 3 楊晗，王飛，楊昆.補陽還五湯對博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺組織erk表達的影響j.中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（4）：1727-

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