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1、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(Enzyme Kinetics)TimeKm + S 化學(xué)熱力學(xué)化學(xué)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的方向反應(yīng)進(jìn)行的可能性反應(yīng)進(jìn)行的限度反應(yīng)進(jìn)行的速率反應(yīng)機(jī)制研究酶促反應(yīng)的速率以及影響反應(yīng)速 家的容和因素的科學(xué).影響反應(yīng)速率因素包括:A酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。A研究一種因素的影響時(shí),其余各因素均恒定。(一)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)速度一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下,用 單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來 表示反應(yīng)速度取其初速度,即底物的消耗量很小 (一般在5%以內(nèi))時(shí)的反應(yīng)速度底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度1.反應(yīng)速率及其測(cè)定單位時(shí)間底物濃 度減少或產(chǎn)物濃 度增加量土 2反應(yīng)分子數(shù)

2、和反應(yīng)級(jí)數(shù)反應(yīng)分子數(shù)(1)單分子反應(yīng) a nV= -dc/dt=kc(2)雙分子反應(yīng)A+BC+DV= -dc/dt二kc©X A反應(yīng)級(jí)數(shù)一級(jí)反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的一次方成正比O 速率常數(shù)與半衰期成反比,與反應(yīng)物初濃度無關(guān)二級(jí)反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的2次方(或兩種物質(zhì)的濃度的乘 積)成正比。對(duì)時(shí)間作圖,為直線,斜率為K 半衰期與初濃度成反比零級(jí)反應(yīng)反應(yīng)速率與反應(yīng)物的濃度無關(guān),為常數(shù)A平衡常數(shù)平衡:可逆反應(yīng)的正向反應(yīng)和逆向反應(yīng)仍在繼 續(xù)進(jìn)行,但反應(yīng)速率相等的動(dòng)態(tài)過程。反應(yīng)的平衡常數(shù)與酶的活性無關(guān),與反應(yīng)速率 的大小無關(guān),而與反應(yīng)體系的溫度、反應(yīng)物及 產(chǎn)物濃度有關(guān)。(二)底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度

3、的影響生成物濃度2468基質(zhì)濃度jiimole(單底物酶促反應(yīng)Juang RH (2004) BCbasics1中間絡(luò)合物學(xué)說Henri和Wurtz提出酚與底物先絡(luò)合成一個(gè)中間產(chǎn)物,然后屮間產(chǎn)物進(jìn)一步分解成產(chǎn)物和游離的酶。ES o P底物最度對(duì)酵促反應(yīng)初速度的爭(zhēng)咱圧ES 理P + EJCT中間產(chǎn)物的證據(jù) 中間復(fù)合物的直接觀察光譜改變 酶的物理性質(zhì)改變 分離結(jié)晶 酶和底物的共沉降當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比;反 應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)。八V隨著底物濃度的增高VmaxS'反應(yīng)速度不再成正比例加速;反應(yīng) 為混合級(jí)反應(yīng)。八5*當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加,達(dá)最大速度;反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)

4、30 502t-al(min產(chǎn)物生成量2 4(1) 米氏方程的提出1913 年 Michaelis 和 Mente n 推導(dǎo)了米氏方程Vmax S Km 4- SLeonor Micliaelis1875-1949Maud Menten1879-19602.單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)S:底物濃度v:不同S時(shí)的反應(yīng)速度vmax:最大反應(yīng)速度(maximum velocity)Km:米氏常數(shù)(Michaelisconstant)(2) 米氏方程的推導(dǎo)i).根據(jù)酶反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說(快速平衡)E + S 心ES 心t P + E兩點(diǎn)假設(shè)(1 ). S與E形成中間 產(chǎn)物,且建個(gè)反應(yīng)速度取決 滬 ES P+

5、E(2).S»E根據(jù)酶反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說(快速平衡)E + S 直ES 心P + EES的生成速度=K1 (E-ES) SES的分解速度=K2ES =K1 (E-ES) SK 1 E SE S =K 2 + K 1 S酶反應(yīng)速度V與ES成正比V = K 3 E S =K 3 EESK 2 / K 1 + SVmax= K3ES= K3Ev=Ks+SBriggs和Haldane提出穩(wěn)態(tài)平衡理論Briggs認(rèn)為并不總是K3«K2, ES-E+P這一步也可能速度很快,這時(shí),E, S和ES將不能處于一個(gè)平衡狀態(tài)。布氏 提出穩(wěn)態(tài)理論。E +片ES的生成量與消失量相等,故平衡時(shí)ES濃

6、度成一穩(wěn)定狀態(tài)。 反應(yīng)時(shí)間A穩(wěn)態(tài)理論的假設(shè)Briggs的酶促反應(yīng)模型:E + sES E + Pk2k4布氏提出以下假設(shè):1.反應(yīng)開始時(shí),P二0,不足已產(chǎn)生逆反應(yīng)-測(cè)定酶的反應(yīng)速度一般是測(cè)定反應(yīng)的初速度,即產(chǎn)物濃度變化在5%以內(nèi)的速度. (:!. r.: t:»- !.ii“TT-M*H間Z4m>JL» ; ”« ;««rtr' ' 0" “X " 'M .:.:.: vv ),*勺? Um hmm m»4h H M H H HBy”" ” . .rinriftTi*rPV

7、3反應(yīng)開始后仮應(yīng)立刻進(jìn)入怛態(tài)狀態(tài)拒S濃度處于穩(wěn)定狀態(tài) ES的形成速度等于其分解速度.穩(wěn)態(tài)米氏方程的推導(dǎo)E + S - -K-> ES 一心P + E游離酶 <=E-ESES生成速度=蝦(E卜ES)SES 分解速度=k2ES+ k3ES當(dāng)穩(wěn)態(tài)時(shí):ES生成速度=ES分解速度組(E-ES) <S= k2ES+ 給ES辺+ $辺+ Ey& 誇棗說無2燼盤瀚二sUJPAHAIa辺+1 1 亙丄S出專 J- n5巴ST (SWH巴)A快速平衡假說與穩(wěn)態(tài)平衡假說的實(shí) 質(zhì)區(qū)別E + S Ki > ES> P + E當(dāng)ES P+E極慢(瓦/Ki極?。r(shí),穩(wěn)態(tài)平衡基本等于快速

8、平衡當(dāng)ES P+E極慢(瓦/Ki極?。r(shí),穩(wěn)態(tài)平衡基本等于快速平衡Km =即ESt P+E是整個(gè)反應(yīng)平衡中極慢的一步K2 + K3K1 KsK1Km + SKs + S穩(wěn)態(tài)平衡=快速平衡+慢速平衡"直也4直Ki Ki Ki當(dāng)ES P+E極慢(瓦/Ki極?。r(shí),穩(wěn)態(tài)平衡基本等于快速平衡項(xiàng)目快速平衡學(xué)說穩(wěn)態(tài)學(xué)說假設(shè)酶和底物生成不穩(wěn)定復(fù)合物L(fēng)ES,酶催化反應(yīng)是經(jīng)該中間復(fù)介物完成的,即:k+1k+2E + S "J LES E + Pk.iES在反應(yīng)開始后與E及S迅速 達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡k 心=二ES的生成速率與其解離速率相 等,其濃度不隨時(shí)間而變化山爾°dr -底物濃度遠(yuǎn)高于

9、酶的濃度。Cs » CE酶量守恒Ceo=C*e+Ces產(chǎn)物生成速率dlP , K + 2C(ES) dt動(dòng)力學(xué)方程dP V皿 drKs + S円bmJSIdf© + S1Ks與心k心=I廠kf)米氏方程的討論Substrate concentration SVmax S v=Km + Sa. 當(dāng)S«Km時(shí), v=(Vmax/Km) S, 即v與S成正比b. 當(dāng)S»Km時(shí), v Vmax,即ST而v不變當(dāng)S = Km時(shí), v=l/2VmaxvS曲線:近似雙曲線.當(dāng)S«Km (S很小時(shí))即v與S成正比.當(dāng)S»Km (S很大時(shí))vVmax,

10、酶被底物飽和,v與S無關(guān).當(dāng)v =l/2Vmax時(shí),S = Km (mol/L)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的意義> Km酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度(Vmax)的一半時(shí) 的底物濃度。單位是ITIOl/l。AKm值是酶的特 征性常數(shù)。與酶 的濃度無關(guān),不 同的酶,其Km 值不同TableKm for some enzymesEnzymeSubstrateKm (mM)Catalaseh2o225Hexokinase (brain)ATP0.4D-Glucose0.05D-Fructose1.5Carbonic anhydraseHCO39Chym ot rypsinGlycyltyrosinyl glyci

11、ne108JV-B enzoyltyrosinamide2.5/3-GalactosidaseD-Lactose4.0Threonine dehydrataseL-Threonine5,0B物理意義:酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度 (V max)的一半時(shí)的底物濃度。C. Km除了與底物類別有關(guān),還與pH、溫度有關(guān), 不同的條件下有不同的Km值。D. Km可判斷酶的專一性和天然底物。如酶能催 化幾種不同的底物,對(duì)每種底物都有一個(gè)特 定的Km值,其中Km值最小的稱該酶的最適 底物。E. Km值近似等于ES的解離常數(shù)Ks,可表示酶 與底物之間的親和力:Km越大,親和力越小,酶的催化活性低;Km 越小,親

12、和力越大,酶的催化活性高 Km> Ks與底物親和力KiKi K2 Ki ” 川=1= K -KxK K s Ka Km是ES分解速度(K2+K3)與形成速度(K)的比值,它 包含ES解離趨勢(shì)(&/£)和產(chǎn)物形成趨勢(shì)(K3/Kj) ° Ks是底物常數(shù),只反映ES解離趨勢(shì)(底物親和力),1/Ks 可以準(zhǔn)確表示酶與底物的親和力人小。只有當(dāng)耐、>>£時(shí),&嚴(yán)心,閔此,1/Km只能近似地 表示底物親和萬的大小。底物親和力人不一定反應(yīng)速度人(反應(yīng)速度更多地與產(chǎn)物 形成趨勢(shì)K異耐有關(guān))F根據(jù)正逆反應(yīng)Km的差別及細(xì)胞內(nèi)正逆兩 相底物的濃度推測(cè)酶促

13、反應(yīng)的正逆方向。鷲樹緞韓酶的如及其相應(yīng)底H 根據(jù)Km值的大小判斷分支代謝的流向。Km可以推斷某一代謝物在體內(nèi)可能的代謝途徑:丙酮酸乳酸脫氫酶(1.7X10-5)丙酮酸脫氫酶(1.3X10-3)丙酮酸脫竣酶(1.0X10-3)乳酸乙酰CoA乙醛當(dāng)丙酮酸濃度較低時(shí),代謝走哪條途徑?jīng)Q定于 Km最小的酶。> Vmax和 l<3(kcat) Vmax不是一個(gè)常數(shù),它取決于酶的濃度,它是一個(gè)酶反應(yīng)體系的速度的極限值。Vmax=K3 E K3代表酶被底物飽和時(shí)每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換 底物的分子數(shù),稱為轉(zhuǎn)換數(shù)或催化常數(shù),(catalytic constant,Kcat)。Kcat值越大, 表示酶的催

14、化效率越高。> Kcat/Km表示酶的實(shí)際催化效率FmaxfxS KcatE SV 二二Km + SKm + SS«KinHtt2瓷皿Kcat/Km是E和S反應(yīng)形成產(chǎn)物的表觀二 級(jí)速率常數(shù),也稱為專一性常數(shù)。y l- k0Substrate Ar5h2 oll I llCHt-C-NH-CH-C-NH2Substrate BSubstrate Ccat力 catkin(mw)(屮異)0.063120.1415102.825114只有Kcat/ Km可以客觀地比較不同的 酶或同一種酶催化不同底物的催化效率(4)作圖法測(cè)定Km和Vmax Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法

15、Hanes-Woolf 作圖法 Woolf-Augustinson-Hofstee 作圖法 EisenthalCornish-Bowden 作圖法測(cè)定Km和V的方法很多,最常用的是Lineweaver-Burk的作圖法一雙倒數(shù)作圖法。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法V max SI =Km + 51 _TZ"Tyrr 1I13XJ AIZi十丄.TSFmaxsxlO 5 (M)000.400.851.251.702.00Neurospora crassa的D-絲氨酸脫水酶催化反應(yīng):CH2OH CHNH2 COOH t CH3CO COOH+NH3在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定酶的飽和曲線得到

16、下列數(shù)據(jù):20分鐘生成丙酮酸(yM)0A500.2000.2750.3150.3400.3500.360.00丙 酮 酸OnVm0.30.220.1用這些數(shù)據(jù)求絲氨酸脫水酶的表觀米氏常數(shù)。解:1、V對(duì)S作圖法:Vmax=0.36 l/2Vmax=0.18 Km=3.2xl0701234567 8 xio6 S1/vo 4o 6 5 -3.4 69 82.2.872.解2、1/v對(duì)1/S作圖法:1/SS0.205.00.1500.402.50.2000.851.170.2751.250.800.3151.700.580.3402.000.5003508.000.12503601/vT65432-

17、4-2 -10123451/S(三)pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響最適pH:酶具 有最大催化活性 時(shí)的環(huán)境pH。典型的酶速度- pH曲線是較窄的 鐘罩型曲線。Cholinesterase木辰蛋白酶Papain6PH最適pH與底物種類、濃度及緩沖液成分有關(guān)。(四)溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響III提高溫度,加快反應(yīng)速度。溫度系數(shù)Q10:溫度升高10C,反應(yīng)速度與原來的反應(yīng)速度之比,大多數(shù)酶的Q10- 般為2。提高溫度,酶變性失活。在一定范圍內(nèi),反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)對(duì)應(yīng)的 溫度祿為該酶便反應(yīng)的最適瘟度(optimumtemperature).最適溫不是酶的特征性常數(shù)。4 O一5 O3 54 O PC二7 O

18、TO少3 P二1匸壬刃殳2-在最適溫度以 上,溫度升高, 酶變性失活1 一在最適溫度以下,溫 度升高,活化分子數(shù) 増多,酶活性提高50246 S 10U噥度倬位)(五)酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響當(dāng)S» E,反應(yīng) t速度對(duì)酶濃度呈正比。; 關(guān)系式為:V=K3 E I 機(jī)理:酶濃度增加,'ES也增加,反應(yīng)速 度增加。六)激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 激活劑(activator):凡是能提高酶活性的 物質(zhì)無機(jī)離子的激活作用“金屬離子:K+、Mg2+、Zn2+NF“陰離子:Cl-、Br-有機(jī)小分子化合物的激活作用蛋白酶對(duì)酶原的激活蟲(七)抑制劑對(duì)酶活性的影響抑制作用(inhibitio

19、n):酶的必需基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)的改變 但酶未變性,而引起酶活力的降低或喪失。變性作用(denaturation):由于酶分子的次級(jí)鍵(酶分子結(jié)構(gòu))受到破壞而使酶活性下降或失活的現(xiàn)象(p234)抑制劑:不引起酶蛋口變性但能與酶分子的必需基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而引起酶活力的下降甚至喪失,能引起這 種酶活力卜降或喪失的物質(zhì)叫抑制劑. 變性劑:不專一作用于某一類化學(xué)基團(tuán),而只是破壞蛋白 分子中次級(jí)鍵的化學(xué)物質(zhì).叫變性劑.失活:是指酶活力的喪失變性劑和抑制劑均可使酶失活.抑制作用六、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(Enzyme Kinetics)(1) 抑制程度的表示方法1、相對(duì)活力相對(duì)活力分?jǐn)?shù)2、抑制率抑制分?jǐn)?shù)抑制百分?jǐn)?shù)相

20、對(duì)活力百分?jǐn)?shù)(2)抑制反應(yīng)類型疏基酶抑制劑*專一性抑制絲氨酸酶抑制劑不可逆抑制非專一性抑制抑制作用競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用可逆性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用1 不可逆抑制作用(irreversible inhibition)I以共價(jià)鍵與E活性中心上的Active site serins必需基團(tuán)結(jié)合,從而抑制酶活性。這種I不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而 恢復(fù)酶活性.常見抑制劑絲氨酸酶抑制劑毓基酶抑制劑+ HF如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。2可逆抑制作用(reversible inhibition)這類抑制劑I與酶蛋白以非共價(jià)鍵結(jié)合,弓I起酶活力降低或喪失??捎猛肝觯瑸V等物理方 法除去抑制

21、劑I而恢復(fù)酶活性。類型: -競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitive inhibition)-非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(noncompetitive inhibition) -反競(jìng)爭(zhēng)性抑制(uncompetitive inhibition)V競(jìng)爭(zhēng)性抑制抑制劑具有與底物類似的結(jié)構(gòu),競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心,并與酶形成可逆的EI復(fù)合物,阻止底物與酶結(jié)合。(a) Competitive inhibitionES競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)1. i與S結(jié)構(gòu)相似;2. i與S互相競(jìng)爭(zhēng)與酶活性中心結(jié)合;3. 抑制程度取決于i和S的相對(duì)比例;4t S,可以減少或去除抑制作用。(Km f , Vmax不變)5.排斥性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制抑制劑與酶活性

22、中的以外的基團(tuán)結(jié)合,但形成中間的 三元復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物,因此,酶的 活性降低。(c) Mixed iiyliibitionES > E + P十非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用特點(diǎn)1i與s結(jié)構(gòu)不相似;2i與S互不干擾同時(shí)與酶結(jié)合;3.抑制程度只取決于i的濃度;4.t S,不能去除抑制作用。(Km不變,Vmax | )5是一種旁若無人式的抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制才能與抑制劑結(jié)合。酶只有在與底物結(jié)合后,E+SES+I->ESI# P常見于多底物的酶促反應(yīng)中(b) LIncompetitive inliil>itionES E + PD Competitive Non-competitiv

23、e<1 UncompetitiveQp n0coorrao UOQdLlosoa pup uoranb 山 Compete for Inhibitor active siteE + S = ES-E + P+IIfEl/ binds to free E only, and competes with S: increasing S overcomes Inhibition by Zl.Different siteE + S=ES-> E + P+IInitE7+S_E7SJ binds to free E or ES complex; Increasing S can not ov

24、ercome 1 inhibit!on.E + SnESE + P+EZSI binds to ES complex only, in creasing S favors the inhibition by 7.(3)酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)逆抑制作用和不可逆抑制作用的鑒別 透析、超濾、凝膠過濾能否除去抑制劑 動(dòng)力學(xué)方法:酶濃度對(duì)反應(yīng)速度作圖,不可逆抑制劑 使直線右移,可逆抑制劑使直線的斜率下降。1 競(jìng)爭(zhēng)性抑制米氏方程的推導(dǎo)E +S 1 -ESE +Pkg+環(huán)卜2F_畫蚯EIKi為抑制劑常數(shù),即EI的解離平衡常數(shù)。Km%ES 的解離平衡常數(shù)Ef:游離酶的濃度(E):酶的總濃度:E) - 1:E J+

25、:E S ) +:E IV Smix 1- JV =K ' = K (1 + )K:+Smm K/ maxI 1 1 Ki J S與標(biāo)準(zhǔn)方程的比較當(dāng)ItO時(shí),方程還原成米氏方程。I 00 時(shí),K : oo , v > 0=K m (1 +K1心變大,而H隨I濃 度的增大而增大2、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制+ +Km 二es.£s_es% 卜血任 S ES' Km,L S E+S im-Es E+Peszezsj _血莎F顧pi卜萬KiKiEI+SKmEISEo=E + ES+ El + EISKinax _ £ + ES+£/+£SZ vES與米

26、氏方程比較max,I1 +K當(dāng)I>0maxI>00無抑制劑CTwFsi雙倒數(shù)作圖ISJ抑制程度:1 - Vo抑制程度決定于I,與底物S無關(guān)3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制E+S Km - ES E+J+IKiESIES 4/ESI L Ki £o二E十ES + ES7與米氏方程比較(變小)不同類型抑制作用的米氏方程» Competitive Non-competitive <1 UncompetitiveSOQ:oQX X a m mVmax嚴(yán)/佔(zhàn)心冷 SLmMVmax unchangedKP1 increasedS? mMVniar decreased unchangedKm KmS, mMBoth Vni3.: & Km decreasedTwo parallel lines X"他1/S表46三種可逆性抑制作用比較字作用特征無抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制與I結(jié)合的組分EE、ESESI動(dòng)力學(xué)參數(shù)表觀Km增大不變減小最大速度%不變降低降低雙倒數(shù)作圖f斜率心/ %增大增大不變£縱軸截距%不變?cè)龃笤龃? -橫軸截距一1/心增大不變減?。?)抑制劑1.不可逆抑制劑非專一性的不可逆抑制劑與酶活性中心及活性中心外某一類或幾類必需基團(tuán)

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