核酸抽提經(jīng)驗及原理總結(jié)

1、核酸提取原理及經(jīng)驗總結(jié) 一、核酸 核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細胞最基本和最重要的成分。一般認為，生物進化即始于核酸，因為在所有生命物質(zhì)中只有核酸能夠自我復(fù)制。今天已知核酸是生物遺傳信息的貯藏所和傳遞者。一種生物的藍圖就編碼在其核酸分子中。核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細胞中發(fā)現(xiàn)的。他當(dāng)時稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認識其酸性后，定名為核酸。二、核酸的分類和功能 核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。這兩類核酸有某些共同的結(jié)構(gòu)特點，但生物功能不同。DNA貯存遺傳信息，在細胞分裂過程中復(fù)制，使每個子細胞接受與母細胞

2、結(jié)構(gòu)和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白質(zhì)合成中起作用，負責(zé)將DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)變成特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。 核酸的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸，核苷酸含有含氮堿基、戊糖和磷酸3種組分。堿基與戊糖構(gòu)成核苷，核苷的磷酸酯為核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脫氧核糖(核糖中2位碳原子上的羥基為氫所取代)。核酸就是根據(jù)其中戊糖種類來分類的，DNA和RNA的堿基也有所不同。下面我們看看DNA和RNA具體的差別：（一）DNA的分子結(jié)構(gòu) 1. DNA的堿基組成規(guī)律：Chargaff等根據(jù)分析各種生物及其不同組織內(nèi)DNA樣品水解液中的堿基含量的結(jié)果，得出以下

3、結(jié)論：1）同一生物不同組織的DNA樣品，其堿基成分含量相同。2）不同生物的DNA堿基成分含量不同。3）對某一生物講，其堿基成分的含量不受年齡、營養(yǎng)及環(huán)境變化等影響。 4）在同一生物的DNA堿基含量是A=T，G=C，A+G=C+T ，堿基之間的這種關(guān)系稱Chargaff法則。2. DNA分子的基本結(jié)構(gòu)：核酸分子內(nèi)單核苷酸之間的連接鍵為3',5'-磷酸二酯鍵，是共價鍵。 DNA分子的基本結(jié)構(gòu)就是許多脫氧核糖核苷酸借磷酸二脂鍵相互連接而成的多核苷酸鏈。DNA鏈中堿基 的組成和排列順序即為DNA的一級結(jié)構(gòu)。DNA的遺傳信息即儲存在DNA分子的堿基排列順序中。 .DNA分子的空間結(jié)構(gòu)：D

4、NA的二級結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，其特點為：1）兩條鏈方向相反、相互平行、主鏈?zhǔn)橇姿嵛焯擎?，處于螺旋外?cè)。2）堿基在螺旋內(nèi)側(cè)并配對存在，A與T配對的G與C配對，A與T之間二個氫鍵相連（A-T），G與C之間三個氫鍵相鏈（G-C）。3）螺旋直徑2nm，二個堿基對平面距0。34mm，10bp為一螺距，距離為3。4nm。4）穩(wěn)定因素主要是堿基之間的氫鍵和堿基對平面之間的堆積力。（二）RNA的分子結(jié)構(gòu)RNA的基本結(jié)構(gòu)是A、G、C、U四種堿基組成的核糖苷酸通過磷酸二酯鍵相鏈而成的多核苷酸鏈。 有三種主要的RNA：據(jù)其作用可分轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）、信使RNA（mRNA）和核蛋白體RNA（rRNA），它們的二級

5、結(jié)構(gòu)是單鏈局部雙螺旋，共中tRNA結(jié)構(gòu)較清楚：1. tRNA tRNA一級結(jié)構(gòu)特點是：1）核苷酸數(shù)目在70-90之間；2）含較多稀有堿基； 3）所有tRNA的3'末端均是-CCA的結(jié)構(gòu)。 tRNA二級結(jié)構(gòu)特點： 呈三葉草形，有三環(huán)四臂。其中3'的氨基酸臂是攜帶氨基酸的位置，II環(huán)又稱反密碼環(huán)，此環(huán)頂端 由3個堿基組成反密碼子，起到識別mRNA上對于密碼子的作用。2. Mrna mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，真核生物的mRNA的5'端有m7Gppp的帽子，3'末端有20-200多聚A的尾巴上述兩者之間為信息區(qū)，其中每三個相鄰堿基組成一個三聯(lián)體，代表一個氨基酸信號，即

6、為密碼子。不同mRNA具有不同的密碼順序，決定蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸排列順序（一級結(jié)構(gòu)）。3. rRNA 核蛋白體RNA，它是細胞內(nèi)含量最多的RNA：rRNA與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白體，存在于胞漿，是蛋白質(zhì) 合成的部位。三、核酸的理化性質(zhì)RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性

7、或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA 時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細胞中的糖，RNA 及無機離子等，從中分離DNA 。四、細胞裂解：（一）裂解原理在核酸提取過程中，細胞裂解是非常重要的。經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl) 等。去污劑則是

8、通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。（二） 細胞的裂解方法細菌細胞破碎方法有以下幾種：1）機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法，關(guān)于超聲波處理法，要設(shè)定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間。2）化學(xué)試劑法：用含SDS或CTAB的溶液處理

9、細胞，在一定的p H 環(huán)境和變性條件下,細胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相，p H 環(huán)境則由加入的強堿(NaOH) 或緩沖液 ( TE、STE 等) 提供，表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。；3）反復(fù)凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。4）酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶K等，都可使細胞壁破碎，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),

10、促進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 及有EDTA、尿素(14mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性,這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實驗?zāi)康膩泶_定。（三）裂解方法的評價含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的

11、作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進作用；同時，巨大的基因組DNA 是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA “纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個思路是，如果基因組 DNA與 蛋白質(zhì) “纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢，則純化時以 DNA 的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 DNA 的損失。當(dāng)然去污劑裂解方法，仍然在細胞基因組 DNA 抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡撸?jīng)濟

12、性及操作簡單很重要時?？刂坪昧呀庖?樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實現(xiàn)最簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用 PC 抽提的差一些。 高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首選。總 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì) “纏”住的問題，因為都不會對以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內(nèi)的 RNA 酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA 的抽提

13、，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。當(dāng)然有些樣品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)) ，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。 含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是 CTAB 的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產(chǎn)的純度一樣的 CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難

14、一些，同時， CTAB 的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用 65C；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低，可以試一下 37C 45C 這個相對低溫的區(qū)域。 SDS 堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的特點?？刂坪昧呀庖?菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4 靜置一段時間以及采用 4 離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中

15、加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 來實現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大質(zhì)粒 (50 kb 以上)，該方法可能會有問題。 PCR 模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非?？焖佟Ｒ舱驗椴患兓?，所以，假陰性 (即沒有擴增出來的陽性) 比例也比較高。該方法最簡單的就是反復(fù)凍融法，簡便快捷，不需任何化學(xué)試劑，凍融離心，PCR檢測就可以了。如果使用裂解法，

16、哪么最簡單的裂解液就是水，復(fù)雜一點的就會含有一些不會抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制 PCR 反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點的就會含有諸如 Chelex 100 之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因為樣品量的降低，同時意味著 PCR 的抑制物量的降低。（四）樣品與裂解液的比例 選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液

17、的比例。這個問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴(yán)肅的參考資料，都應(yīng)該會提供一個簡單的比例，如 1ml 裂解液可以用于 T mg 組織或者 C 個細胞；建議:樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實驗所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因為 1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg 樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果 (純度及得率) 沒有關(guān)系，然而，在實際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)

18、致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)，這一點務(wù)必牢記。五、核酸提取核酸提取包含樣品的提取和純化兩大步驟。提取是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。（一） DNA提取的幾種方法1 濃鹽法 ：1）利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯化納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上

19、層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來； 2）也可用0.15 MNaCL液反復(fù)洗滌細胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿-異醇法除去蛋白。兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些；3）以稀鹽酸溶液提取DNA 時，加入適量去污劑，如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA 的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑。2 陰離子去污劑法：用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA 。由于細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵

20、,所以常用陰離子去污劑提取DNA。3 苯酚抽提法： 苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA 。此時DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態(tài) 。4水抽提法：利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA淀溶于水中充分溶解于水中,離心后收集上清液。在上清中加入固體

21、氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M，加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出。然后分別用66%，80%,95%乙醇以及丙酮洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品。此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用。為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS。（二） RNA提取所有的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即）：樣品細胞或組織的有效破碎；）有效地使核蛋白復(fù)合體變性；）對內(nèi)源酶的有效抑制；）有效地將從和蛋白混合物中分離；5）對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制酶活性。1）總RNA的試劑盒快速提取 一些公司推出的總RNA提取試劑盒,該總RNA純化系統(tǒng)采用兩種著名的RNA酶抑制劑,

22、異硫氰酸弧(GTC)和-巰基乙醇,加上整個操作都在冰浴下進行,這樣就能顯著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用,將促使核蛋白復(fù)合體的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。而進一步從復(fù)合體中純化RNA,則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進入水相,這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮。進一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著異丙醇進行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機鹽，而RNA中如含無機鹽,則有可能對以后

23、操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。2）氯化鋰法提取總RNA： 本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。3 ）蛋白酶熱酚法：本方法適合于病毒RNA的提取。六、核酸純化裂解完成后，液體體系中就包括了游離的核酸、蛋白質(zhì)及其它大分子雜質(zhì)、鹽：純化就是將核酸與其它游離成分分離的過程。就個人所知，目前在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)的，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與

24、大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。使用介質(zhì)的可以分為兩類：離子交換介質(zhì)和吸附介質(zhì)。不使用介質(zhì)的也分為兩類：使用苯酚/氯仿抽提的和不使用苯酚/氯仿抽提的。（一）純化方法：下面比較一下具體的純化技術(shù)：1）經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)：細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1 體積) 混合液。依據(jù)應(yīng)用目的，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機相,核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑，預(yù)先要用STE 緩沖液飽和，因未飽和的

25、酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián);故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀，,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05.5 ，終濃度為0.3M 的NaAc 或KAc 后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷，在酸性環(huán)境中促進核酸的疏水復(fù)性。然后加入22. 5 倍體積的乙醇,經(jīng)一定時間的孵育，可使核酸有效地沉

26、淀。其他的一些有機溶劑 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于合適的緩沖液中。3） 使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就可以直接用于后續(xù)實驗。4) 密度梯度離心法：密度梯度離心也用于核

27、酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認為是純化大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì),梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。注：但是在日常實驗過程中，通常用的純化方法有主要有以下兩種，一是化學(xué)方法，即PC 抽提 + 醇沉淀；二是物理方法，即介質(zhì)純化。第一種方法是利用 PC 對裂解體系進行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實

28、現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個變體，省略了 PC 操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的 PCR。其它雜質(zhì) 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實現(xiàn)的。（二） 純化方法評價PC(P是英文酚的縮寫，C是英文氯仿的縮寫)抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)

29、，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC 抽提都會損失一部分核酸 (因為不可能將水相全部移取)，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC 抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實際上大可不必

30、如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強烈到 DNA 變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR 和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA 會斷

31、裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC 抽提的，否則核酸必定降解。高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會更好一些。 介質(zhì)純化方法

32、，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留

33、)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。（三）醇的沉淀1）沉淀的原理目的：目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)主要是鹽的分離。實際操作中，許多雜質(zhì)也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來；異丙醇進行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀

34、，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機鹽，而RNA中如含無機鹽,則有可能對以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。2）氯化鋰法提取總RNA： 本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。3 ）蛋白酶熱酚法：本方法適合于病毒RNA的提取。六、核酸純化裂解完成后，液體體系中就包括了游離的核酸、蛋白質(zhì)及其它大分子雜質(zhì)、鹽：純化就是將核酸與其它游離成分分離的過程。就個人所知，目前在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)

35、的，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。使用介質(zhì)的可以分為兩類：離子交換介質(zhì)和吸附介質(zhì)。不使用介質(zhì)的也分為兩類：使用苯酚/氯仿抽提的和不使用苯酚/氯仿抽提的。（一）純化方法：下面比較一下具體的純化技術(shù)：1）經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)：細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1 體積) 混合液。依據(jù)應(yīng)用目的，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機相,核酸則

36、被留于上層水相。酚是一種有機溶劑，預(yù)先要用STE 緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián);故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀，,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05.5 ，終濃度為0.3M 的NaAc 或KAc 后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷，在酸性環(huán)境中促進核酸的疏水復(fù)

37、性。然后加入22. 5 倍體積的乙醇,經(jīng)一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機溶劑 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于合適的緩沖液中。3） 使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫

38、下來，就可以直接用于后續(xù)實驗。4) 密度梯度離心法：密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認為是純化大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì),梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。注：但是在日常實驗過程中，通常用的純化方法有主要有以下兩種，一是化學(xué)方法，即PC 抽提 + 醇沉淀；二是物理方法，即

39、介質(zhì)純化。第一種方法是利用 PC 對裂解體系進行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個變體，省略了 PC 操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的 PCR。其它雜質(zhì) 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實現(xiàn)的。（二） 純化方法評價PC(P是英文酚的縮寫，C是英文氯仿的縮寫)抽提/醇沉淀方法，

40、是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC 抽提都會損失一部分核酸 (因為不可能將水相全部移取)，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC 抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混

41、勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強烈到 DNA 變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR 和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除

42、。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA 會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC 抽提的，否則核酸必定降解。高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度 (蛋白

43、質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會更好一些。介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開

44、的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。（三）醇的沉淀1）沉淀的原理目的：目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)主要是鹽的分離。實際操作中，許多雜質(zhì)也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，

45、單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來 (當(dāng)然，得率可能會降低)。知道這一點的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的唯一性；相反，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題 主要是純度問題時，完全可以通過調(diào)整沉淀條件來改善。最有參考價值的是 TRIzol 提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因為可以大大提高純度。2) 沉淀劑的選擇： 醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發(fā)現(xiàn)這二者對質(zhì)量有大的影響，雖然許多人“發(fā)現(xiàn)”乙醇沉淀的核酸純度

46、更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，提示結(jié)論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。結(jié)合丟失和洗滌兩個方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀 (量少，洗滌不是問題，不丟失為先)，大量核酸用乙醇沉淀 (量大，丟失不是問題，洗滌方便為先)。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過 (我?guī)缀醪皇褂玫蜏爻恋?，難道低溫沉淀比較容易出現(xiàn)鹽沉淀？)；我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml 離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊

47、，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。當(dāng)然，沉淀所用的試劑，不僅僅就乙醇和異丙醇，還有包括PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀，雖然它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。3) 沉淀溫度的選擇：如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高

48、時，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。（四）核酸的洗滌1）洗滌原理與目的： 洗滌對于整個提取過程來說，也是非常重要的。洗滌，首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時 (使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因為他來自國外，自然就有了“水土不服”的問題。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因為液體幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗。

49、唯一不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。這步，切忌不要用手甩，這樣容易將核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點，洗滌次數(shù)也要考慮增加。當(dāng)然，乙醇濃度的選擇也非常重要，一般情況，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。（五）核酸的溶解和保存1）核酸溶解：純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度TE緩沖液溶解：其中 RNA 以水為主，DNA 則多以

50、弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。2）核酸保存：基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般的我們選擇，-20 或70 保存的穩(wěn)定。如果溫度不合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導(dǎo)致的水解 (RNA 在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適

51、)。還有一個不為人重視的，就是 EP 管對核酸的影響。首先一定要堅信一點，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達到某種均衡。EP 管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當(dāng)回事?，F(xiàn)在制造 EP 管的材料遠多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP 材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠沒有研究透

52、徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。（六）核酸的濃縮應(yīng)用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。核酸濃縮的具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中1530min，取出目測平衡，04度，12000g，離

53、心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.51ml，12000g，04度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl，這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2 ）。七 核酸質(zhì)量的檢測問題將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實驗，是唯一可靠的檢測

54、方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，該方法還是非?？尚诺模浑娪具€可以用于估計核酸的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準(zhǔn)確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進行紫外和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果

55、能用于后續(xù)實驗而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實驗，也不用大驚小怪。關(guān)于紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始 (沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真，其中280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。) 。其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；調(diào)較可以使用非常純的自備核酸，也可以使用苯酚。最后，要記住讀數(shù) A230 ：A260 ：A280 = 1：2 (DNA 為 1.8) ：1 為理論上的數(shù)據(jù)，實際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了，有兩個值得商榷的觀點：如果

56、 A260/A230 > 2 就是純的，如果 A260/A280 > 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的 (具體是什么雜質(zhì)我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測定，A260/A280 > 2.0 決不提示核酸降解，原因是：那些能導(dǎo)致 A260/A280 > 2.0 的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280 實際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。純的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280 則正好是半山坡。根據(jù)曲線在

57、底和頂?shù)男甭首钚。诎肷狡碌男甭首畲蟮奶攸c，不難得出如下結(jié)論：A230 和 A260 的讀數(shù)受儀器準(zhǔn)確性的影響比較小，而 A280 受儀器準(zhǔn)確性的影響比較大。關(guān)于電泳檢測，觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙

58、錠時即可以檢測到少量的DNA。建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用 (如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一個參考 (降解的不必要測了，要測的該取多少量等)。八、核酸中雜質(zhì)的去除關(guān)于核酸分離純化階段中除去多糖、蛋白質(zhì)及不同類型核酸之間分離的一些方法，分別介紹如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學(xué)性質(zhì)與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來。除去的方法常有：取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細胞內(nèi)肝糖元大大減少。加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。在濃

59、磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機層中。以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。（2）蛋白質(zhì)的除去：由于核酸在細胞內(nèi)以核蛋白體形式存在，不論采用哪種方法提取核酸，蛋白質(zhì)都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質(zhì)是核酸分離純化不可避免的步驟。常用方法有下列幾種：加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復(fù)使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結(jié)合使用，效果更加理想。氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復(fù)使用。苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DN