毛細管電泳分離蛋白質(zhì)的研究進展

1、    毛細管電泳分離蛋白質(zhì)的研究進展    宮紅梅摘 要 綜述了無膠篩分毛細管電泳在和蛋白質(zhì)的分離分析中的應用實例，對這種方法的前景展望及發(fā)展趨勢進行討論。關鍵詞 高效毛細管電泳；無膠篩分；蛋白質(zhì)；電滲流：o629.73 ：a ：1671-7597（2014）07-0160-01近年來，蛋白質(zhì)組學的研究進展迅速，其中研究熱點集中于蛋白質(zhì)的分離檢測與結(jié)構(gòu)鑒定上。目前有關蛋白質(zhì)的研究手段和方法較多，各有優(yōu)缺點。毛細管電泳技術(shù)具有高效、快速、樣品用量極少等特點，適合生物大分子的分析檢測。但毛細管電泳分離蛋白質(zhì)時，首先要解決的問題是蛋白質(zhì)樣品對管壁的吸附。無膠

2、篩分毛細管電泳是在緩沖溶液中添加線性高分子而不進行交聯(lián)反應，溶液中高分子之間相互交纏形成網(wǎng)孔，從而對蛋白質(zhì)等生物大分子按其大小進行篩分分離，無膠篩分的機制還不明確，存在幾種理論模型：交纏溶液理論和高分子亞濃溶液線團收縮理論，ogston、爬行和偏爬行模型和碰撞模型1。高分子溶液加入到緩沖液中，使電滲流得到抑制，同時也抑制了蛋白質(zhì)的吸附，與凝膠電泳相比，它的制備工藝相對簡單，壽命較長，操作簡便，容易清洗等優(yōu)點。傳統(tǒng)的sds-凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的分辨率低，操作繁瑣耗時，且所用藥品有毒性，毛細管凝膠電泳可以克服上述缺點，但制備工藝復雜，凝膠壽命短，填充過程中容易產(chǎn)生氣泡，影響分離。無膠篩分電泳具有更

3、多的優(yōu)點，容易填充和沖出，高分子聚合物在管中形成動態(tài)篩分網(wǎng)絡，能很好的保持操作重現(xiàn)性，而且可以抑制電滲流，減少吸附。而且可以選擇篩分介質(zhì)的種類，濃度，分子量，以適合分離不同的蛋白質(zhì)混合物。1 無膠篩分毛細管電泳的應用目前，無膠篩分體系已較多應用于低聚核苷酸、dna限制性片段、聚合酶鏈反應產(chǎn)物的分離研究領域中。郭栩等人根據(jù)實驗結(jié)果得出結(jié)論，在無膠篩分體系中，盡管影響分離的主要因素在于篩分體系本身，但柱壁的處理對dna片段的分離結(jié)果也不可忽視3。李克，袁倚盛等在硼酸緩沖溶液中加適量的peg8000作為改性劑，以非涂漬毛細管柱電泳分離人血清蛋白質(zhì)，血清樣品經(jīng)硼酸緩沖液（50 mmol/l，ph=8.

4、80）稀釋后，以0.1 mol/l的硼酸緩沖液（ph9.35，peg8000為4 g/l）為電泳介質(zhì)，在50 m×37 cm彈性石英毛細管柱（leff=32 cm）中進行電泳分離，在紫外波長200 nm處檢測，12 min內(nèi)便可完成對血清中蛋白質(zhì)的電泳分離。方法簡便、快速、峰遷移重復性好，適用于臨床常規(guī)檢驗和血中蛋白質(zhì)的研究。張振中，吳逸明等以線性高分子聚合物聚乙二醇（peg20000）作為篩分介質(zhì)，150 mmol/l tris -100 mmol/l ches（ph8.7）作為運行緩沖液，運行電壓20 kv，磷酸化酶b、牛血清白蛋白、肌動蛋白、碳酸酐酶、煙草花葉病毒外殼蛋白和胰蛋

5、白酶抑制劑達到基線分離。隨peg相對分子質(zhì)量的不同peg的性質(zhì)發(fā)生改變，相對分子質(zhì)量大小決定了其鏈的長短及篩孔徑的大小，也就決定了被分離的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量范圍。因此選定合適的peg，優(yōu)化實驗參數(shù)是實驗的關鍵工作。在實驗中應根據(jù)趙京山，溫進坤等人建立了檢測微量蛋白質(zhì)方法，電泳緩沖液為含有30 g/l peg 20000硼酸鹽緩沖液150 mmol/l，ph10.0，骨橋蛋白標品的倍比稀釋，依次經(jīng)ngsce方法檢測，確定所建方法的靈敏度及峰面積和opn濃度之間的關系；利用回收實驗，根據(jù)opn的濃度和峰面積計算回收率。結(jié)果表明，該無膠篩分毛細管電泳的方法能滿足檢測微量蛋白質(zhì)的需要3。garcia

6、-ruiz等4分離牛乳清蛋白（-乳清蛋白和-乳球蛋白（a+b）和大豆蛋白時使用的是羥乙基甲基纖維素/尿素體系。rumbo等5同樣用無膠篩分體系成功分析50多種結(jié)構(gòu)相似、理化性質(zhì)接近的麥膠蛋白。bean等通過比較幾種不同的篩分介質(zhì)在sds-ce中的分離效果，建立了簡捷，快速，重現(xiàn)性好的分離小麥蛋白的方法。somerville等6用無膠篩分體系實現(xiàn)了臨床應用的糖細胞集落刺激因子（g-csf）的異構(gòu)體的分離。2 影響因素及控制zeta電勢是影響電滲流的主要因素，緩沖液性質(zhì)、毛細管表面特性都與電勢大小密切相關。同時，zeta電勢與擴散層厚度成正比，而擴散層厚度又與電解質(zhì)濃度的平方根倒數(shù)成正比，所以，緩

7、沖溶液的組成、酸堿度、毛細管內(nèi)壁表面的活化狀態(tài)以及環(huán)境溫度成為影響電滲流的間接因素，此外，當其他條件一定時，電場強度也影響電滲流的大小。控制方法有改變緩沖液的特性，對柱表面進行處理，外加徑向電場。分離酸性蛋白質(zhì)時，采用ph7-10的緩沖體系，可以減少蛋白質(zhì)對管壁的吸附。不同的緩沖離子類型會對電滲流以及蛋白質(zhì)樣品有不同的作用，硼酸-硼砂緩沖溶液和tris-hcl緩沖溶液的分離能力優(yōu)于磷酸鹽緩沖液，能得到較好的峰形和較快的遷移時間；分離體系的ph值對分離度及柱效有很大影響，要根據(jù)樣品蛋白質(zhì)的性質(zhì)選擇合適的ph值。緩沖溶液中通過添加篩分介質(zhì)，運行緩沖溶液的粘度變大，需要增長進樣前緩沖液沖洗平衡毛細管

8、的時間。通過進樣后的加壓分析研究，發(fā)現(xiàn)分離結(jié)果并未得到實質(zhì)改善，原因尚未明確，需要進一步實驗驗證；添加適當比例的有機溶劑如甲醇，可以減小溶液粘度，降低焦耳熱，從而改善峰形，添加比例增大時，峰形變差，遷移時間延長。3 結(jié)束語毛細管電泳分離蛋白質(zhì)具有其高效、快速、樣品量少、溶劑量少等特點，但對于實際蛋白質(zhì)研究還存在一些問題，如吸附問題、分辨率問題、復雜組分的干擾等。各種新的分離模式和探索正在進行中。毛細管電泳無膠篩分蛋白質(zhì)的研究目前在國內(nèi)外的報道還不太多，而篩分機理還不明確，因此進一步的研究十分有意義。目前的研究主要是在篩分介質(zhì)的選擇和分離條件上的改進，建立更多的分離模式，使其具有實用性，并用于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學研究有著廣闊的發(fā)展前景。參考文獻1丁文靜，許旭.基于纖維素衍生物的毛細管無膠篩分電泳及其應用j.分析科學學報，2004，20（2）：204-209.2周欣.高分子材料在無膠篩分毛細管電泳中的應用j.醫(yī)學綜述，2006，12（7）：437-438.3郭栩，余勝兵.毛細管無膠篩分電泳涂漬柱的制備和性能考察j.分析化學，1996，24（7）：853-857.4李克，袁倚盛.高效毛細管區(qū)帶電泳法分離人血清蛋白質(zhì)的研究j.色譜，2000，18 （2）：152-154.5張