論TSA對甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579增殖的影響

1、論 TSA對甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579增殖的影響摘要：目的 探討曲古抑菌素A（trichostatinA， TSA）對甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579生長增殖的影響。方法分別以終濃度為25、50、 100、200、400nmol/L的 TSA作用于SW579細(xì)胞株，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化；采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT）檢測細(xì)胞的體外增殖、吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的改變。結(jié)果TSA作用后對細(xì)胞的增殖有抑制作用；吖啶橙染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有典型的凋亡小體生成；流式細(xì)胞儀分析凋亡率隨TSA濃度的升高而升高 (P ) 。結(jié)論 不同濃度的 TS

2、A可抑制 SW579細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。關(guān)鍵詞：曲古抑菌素 A 甲狀腺鱗癌細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡曲古抑菌素 A(Trichostatin A，TSA)源自鏈霉素代謝產(chǎn)物，是一種氧肟酸類非競爭性可逆的組蛋白去乙?；?(histone deacetylase ，HDAC)抑制劑，也是四大類 HDAC抑制劑的代表藥物之一。有研究表明， HDAC抑制劑 TSA和丁酸鈉均可使人結(jié)腸癌細(xì)胞系 SW1116和人直腸癌細(xì)胞系 Colo-320 的細(xì)胞周期阻滯于G1期。TSA在低于微摩爾濃度時即可通過提高 p21waf1 的轉(zhuǎn)錄阻滯細(xì)胞周期、 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以抑制胰腺癌細(xì)胞的生長， TSA還可活

3、化胰腺癌細(xì)胞系 BxPC-3和 MIA PaCa-2 中的轉(zhuǎn)化生長因子 受體 II(T RII) 。TSA可在體外抑制人肝癌細(xì)胞系 HepG2細(xì)胞增殖，使 Huh-7 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于 G0 G1期并誘導(dǎo)凋亡。另外，人們在對人類膀胱癌細(xì)胞 T24 的研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑 SAHA可誘導(dǎo) CDK抑制因子 P21/WAF1的轉(zhuǎn)錄，從而使癌細(xì)胞停止增殖，趨向分化。已有研究報道TSA對肝癌、胃癌、宮頸癌、前列腺癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤作用1，但對甲狀腺癌細(xì)胞的影響國內(nèi)外研究甚少， 對甲狀腺鱗癌尚無報道。本研究旨在探討 TSA對甲狀腺鱗癌細(xì)胞株 SW579細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

4、1 材料與方法主要試劑與儀器TSA (SIGMA公司 ) 用二甲基亞砜（ DMSO）充分溶解，配成 4×10-4mol/L的貯備液， - 20 避光保存。使用時用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。AnnexinVFITC 凋亡檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司；L15 培養(yǎng)液 (SIGMA公司產(chǎn)品 ) 按照說明用三蒸水配置，100 U/mL青霉素、 100 g/mL 的鏈霉素，調(diào)整 pH 值至， m微孔濾器無菌過濾， 4 冰箱保存。使用前加入 10% 的胎牛血清。四甲基偶氮唑藍(lán)（ SIGMA公司）；倒置顯微鏡 (JAPAN OLYMPUS TOKYO)、流式細(xì)胞儀 ( 美國貝克曼庫爾特有限公

5、司 ) 、熒光顯微鏡 (JAPANOLYMPUSTOKYO)L15 培養(yǎng)液（ SIGMA公司）； Multiskan Ascent 自動酶標(biāo)檢測儀。細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所。該細(xì)胞株在 L15 培養(yǎng)液中、飽和濕度、 37 、無 CO2 孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶底面積 80%左右時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。以 105/mL 濃度接種于 25 cm2的培養(yǎng)瓶中，24 h 待細(xì)胞貼壁后細(xì)胞處于對數(shù)生長期時給藥， 使 TSA終濃度分別為 25 、 50 、 100 、 200、400 nmol/L ，加入最大溶解劑量的 DMSO為對照組 DMSO濃度

6、小于 %(V/V)，對細(xì)胞生長無影響 。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)在藥物處理后 48 h 后取出培養(yǎng)瓶，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并拍攝記錄細(xì)胞形態(tài)。MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率取對數(shù)生長期的細(xì)胞按1×105/L接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔200 L，實驗組分別加入不同濃度的TSA20 L ( 終濃度分別為 25、50、100、200、400 nmol/L) ，對照組加入最大溶解劑量的DMSO，每組設(shè) 8 個平行孔。 置于 37 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，作用48 h后，每孔加入20 l MTT 液(5 g/L，以PBS緩沖液配制 ) ，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，棄上清，每孔再加入二甲基亞

7、砜 (DMSO)150 L，震蕩 10 min，用 DG-3033型酶聯(lián)免疫檢測儀測定 490 nm吸光度 (A) 值。用下面的公式計算抑制率。抑制率 ( )=(1- 實驗組 A 值/ 對照組 A)×100%。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況取對數(shù)生長期的細(xì)胞按1×106/L 接種于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， TSA作用48 h后，取出培養(yǎng)板，去除培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞2 3 次， 95%酒精固定1520 min ，倒出酒精后用PBS再洗，加入1%冰醋酸作用30 秒，倒出冰醋酸用PBS洗，用 %的吖啶橙染色 15 min，倒出吖啶橙，用PBS洗后置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。流

8、式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率不同濃度組的 TSA作用 48 h 后，取出培養(yǎng)瓶，去除培養(yǎng)液，加入 2 mL 消化液消化 1 min 左右，加入 5 mL 培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，記數(shù)后收集細(xì)胞于離心管中， 1 000 rmp 離心 5 min ，參照試劑盒說明，用 4 預(yù)冷的 PBS洗細(xì)胞 2 次，將細(xì)胞重懸于 250 L BindingBuffer ，調(diào)節(jié)其濃度為106/mL，取 100 L 的細(xì)胞懸液于 5 mL 流式管中，加入 5 L AnnexinV FITC 和 10 L、20 g/mL PI ，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng) 15 min，加入 400 L PBS 后上流式細(xì)胞儀檢測

9、。統(tǒng)計學(xué)處理實驗所得數(shù)據(jù)以±s 表示，應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，P具有顯著性意義， P具有極顯著性意義。2結(jié)果TSA 對細(xì)胞形態(tài)特征的影響不同濃度 TSA作用于 SW579細(xì)胞后，與對照組相比，細(xì)胞生長速度變慢，在對照組中成多角形及梭形的細(xì)胞經(jīng)TSA處理后可見細(xì)胞貼壁延遲、回縮， TSA 的濃度越高，回縮越明顯；再增加TSA濃度至在 800 nmol/L 時，細(xì)胞大部分都回縮成球形， 細(xì)胞很快死亡， 如圖 1 所示。 A對照組 BTSA 濃度為 25 nmol/LCTSA 濃度為 100 nmol/LDTSA 濃度為 400 nmol/L 圖 1倒置顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)

10、（×100）SW579細(xì)胞生長抑制率檢測結(jié)果TSA 各濃度組細(xì)胞生長抑制率見表1。表1TSA 對 SW579細(xì)胞生長抑制率的影響 TSA終濃度表示與對照組相比，P； #表示與前一組相比， PSW579細(xì)胞株經(jīng)不同濃度TSA作用后，各組細(xì)胞抑制率隨著藥物濃度的升高而升高（ P），說明 TSA可抑制細(xì)胞生長，且呈劑量依賴性。熒光顯微鏡下細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng) TSA處理的各組細(xì)胞均可見染色質(zhì)的濃集和邊集，核膜出芽及凋亡小體等現(xiàn)象；TSA濃度越高，染色質(zhì)的濃集和邊集越明顯，核膜出芽及凋亡小體越多，如圖2 所示。A對照組 BTSA 濃度為 25 nmol/LCT

11、SA 濃度為 100nmol/LDTSA 濃度為 400 nmol/L圖 2 熒光顯微鏡下細(xì)胞的凋亡（× 200） 細(xì)胞凋亡率的檢測結(jié)果該細(xì)胞株經(jīng)不同濃度 TSA作用后，與對照組相比， 各組細(xì)胞凋亡率顯著升高，并隨著 TSA濃度的升高而升高， P，如表 2 所示。表 2不同濃度 TSA作用下的細(xì)胞凋亡率表示與對照組相比， P； #表示與前一組相比， P3討論近年的研究顯示 2，表觀遺傳修飾調(diào)控基因表達(dá)主要包括DNA的甲基化和組蛋白乙?；?。近幾年，人們才對組蛋白乙?；臋C(jī)理有所理解。 HDAC抑制劑主要是通過改變組蛋白的乙?；潭葋砀淖?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)， 從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的作用，其主要生

12、物效應(yīng)包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、 細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。TSA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的組蛋白去乙?；敢种苿?3，能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長， 誘導(dǎo)其細(xì)胞分化和凋亡， 但具體作用機(jī)制還尚未完全明確。MTT是評價細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，本研究中通過MTT、熒光顯微鏡與流式細(xì)胞儀的檢測方法從抑制細(xì)胞生長增殖與促進(jìn)凋亡的角度來觀察 TSA對 SW579 細(xì)胞株的作用情況。結(jié)果顯示：在 25400 nmol/L 濃度范圍內(nèi)，隨著 TSA濃度的升高，細(xì)胞生長抑制率和凋亡率均明顯升高， 且呈劑量依賴性， 顯微鏡下觀察與對照組相比，細(xì)胞生長速度變慢，在對照組中成多角形及梭形的細(xì)胞經(jīng) TSA 處理后可見

13、細(xì)胞貼壁延遲、回縮， TSA 的濃度越高，回縮越明顯；熒光顯微鏡下各組細(xì)胞均可見染色質(zhì)的濃集和邊集， 核膜出芽及凋亡小體等現(xiàn)象； 當(dāng) TSA濃度達(dá)到 400 nmol/L 時，細(xì)胞生長抑制率可達(dá) %，凋亡率幾近 50%，在熒光顯微鏡下也可見明顯的凋亡特征，但再提升 TSA濃度至 800 nmol/L 時，細(xì)胞幾近死亡。本實驗結(jié)果表明， TSA對 SW579細(xì)胞株抑制增殖作用可能主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而起作用的，且最適濃度在 25400 nmol/L 范圍內(nèi)。 Greenberg VL 等研究表明4TSA能抑制甲狀腺癌細(xì)胞株生長、 促進(jìn)其凋亡，阻滯細(xì)胞周期于 G1和 G2/M 期，同時增加 p2

14、1(Cip1/WAF1) 及 p27 Kip1 的表達(dá)，抑制 cyclins A 、 B 的表達(dá)。其作用是通過激活 caspase 級聯(lián)反應(yīng)，阻滯細(xì)胞周期及抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶活性來實現(xiàn)的。 Zarnegar R 等 5用曲古抑菌素 A 觀察 3 種甲狀腺癌細(xì)胞株 TPC-1、XTC-1、 FTC-133131I 的攝取，發(fā)現(xiàn)能明顯提高 NISmRNA的表達(dá)，并且同時 PDSmRNA轉(zhuǎn)錄減少。增加了放射性碘在腫瘤的滯留， 碘攝取增強(qiáng)。 另有研究表明6，組蛋白去乙酰酶抑制劑亦能在顯著增加 NIS mRNA的表達(dá)的同時，增加 5脫碘酶，從而增加甲狀腺癌細(xì)胞的攝碘，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的再分化。有

15、關(guān) TSA對甲狀腺鱗癌 SW579細(xì)胞株生長增殖及細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。【參考文獻(xiàn)】1 Alao JP，LamEW，Ali S，et deacetylaseinhibitortrichostatinA repressesestrogen receptoralpha-dependenttranscriptionand promotesproteasomal degradationof cyclinD1 in humanbreast carcinoma celllines J .Clin Cancer Res ，20XX，10(23) ： 8094-8104.E，Wolffe

16、specific gene repression J.Eur J Biochem，2Ballestar20XX，268(1) ： 1-6.3 Curtin M ，Glaser deacetylase inhibitors：the Abbott experience J .Curr Med Chem ，20XX，10(22) ：2373-22.4 Greenberg VL，Williams JM，Cogswell JP，et al. Histone deacetylase inhibitors promote apoptosis and differential cell cycle arrest inanaplastic thyroid cancer cellsJ.Thyroid ，20XX，11(4) ：315-325.5 Zarnegar R ， Brunaud L ，Kanauchi H ，et the effectiveness ofradio