實驗六植物組織基因組DNA的提取與分析CTAB法學習教案

1、會計學1實驗實驗(shyn)六植物組織基因組六植物組織基因組DNA的提取的提取與分析與分析CTAB法法第一頁，共13頁。2 （1）掌握植物組織中DNA提取(tq)的原理和方法。 （2）掌握DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法一、實驗(shyn)目的第1頁/共12頁第二頁，共13頁。二、實驗(shyn)原理 通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。 CTAB, SDS等離子型表面(biomi

2、n)活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。第2頁/共12頁第三頁，共13頁。二、實驗(shyn)原理 再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。 上清液中加入異丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于雙蒸水或TE溶液中，即得植物總DNA溶液。 之后(zhhu)可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到較純的DNA制劑。第3頁/共12頁第四頁，共13頁。 CTAB法流程圖：植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌異丙醇沉淀DNA

3、溶液第4頁/共12頁第五頁，共13頁。6三、儀器(yq)和試劑1、儀器： 恒溫(hngwn)水浴鍋、高速離心機、水平電泳槽、電泳儀。2、試劑： 液氮、CTAB提取緩沖液、氯仿:異戊醇（24:1）、異丙醇、70%乙醇、TE緩沖液、上樣緩沖液（0.5%溴酚藍+40%蔗糖）、1TAE電泳緩沖液。第5頁/共12頁第六頁，共13頁。四、實驗(shyn)步驟稱取0.1g植物幼苗加入適量液氮充分研磨，全部轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中加入0.5ml CTAB提取緩沖液，充分混合均勻65水浴10min，其間緩慢顛倒3次加入0.5ml氯仿:異戊醇，上下顛倒充分混勻12000r/min離心10min將上層水相移入另一新離

4、心管加0.5ml預冷異丙醇，-20冰浴30min12000r/min離心10min棄上清，沉淀用0.5ml70%乙醇懸浮棄上清，加20LTE溶解沉淀，即得DNA溶液12000r/min離心10min1、DNA的提取(tq)第6頁/共12頁第七頁，共13頁。8四、實驗(shyn)步驟2、DNA電泳(din yn)檢測（1）1%瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入30mL 1TAE緩沖液，在微波爐中加熱，反復加熱、振蕩2-3次，使瓊脂糖充分融化。待凝膠冷卻至60左右，倒入插入梳子的凝膠板中（避免產(chǎn)生氣泡），讓凝膠自然凝固。（2）待凝膠凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右搖晃，以免破壞膠面及加樣孔，小心將凝膠

5、和膠床放入電泳(din yn)槽中，加樣孔靠近陰極的一端。第7頁/共12頁第八頁，共13頁。9四、實驗(shyn)步驟2、DNA電泳檢測（3）上樣電泳：將20LDNA樣品溶液和5L上樣緩沖液混勻后，上樣，100V穩(wěn)壓電泳檢查，根據(jù)指示劑遷移的位置(wi zhi)，判斷是否中止電泳。切斷電源后，再取出凝膠。（4）照膠、拍照：將凝膠泡在EB溶液（注意：EB溶液為劇毒物，需帶上一次性手套拿取凝膠）中10min左右，進入暗室，使用凝膠成像系統(tǒng)照膠并拍照。第8頁/共12頁第九頁，共13頁。10五、實驗(shyn)結果與分析 1 2 3 4圖1 植物組織基因組DNA提取結果 將凝膠圖片打印(d yn)出來，需要說明：1、小組點樣孔號；2、DNA質(zhì)量分析。第9頁/共12頁第十頁，共13頁。第10頁/共12頁第十一頁，共13頁。121、在DNA抽提過程中造成DNA分子斷裂的主要因素有哪些？2、本實驗中所用到下列試劑（CTAB、氯仿、異丙醇、75%乙醇）的作用(zuyng)各是什么? 七、思考題第11頁/共12頁第十二頁，共13頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結會計學。第1頁/共12頁。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。CTAB, SDS等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離(yul)出來。棄上清，加20LTE溶解沉淀