實驗四-玉米種子鹽溶蛋白凝膠電泳

1、實驗四實驗四 玉米種子鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定玉米種子鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定2014.1.2一、目的要求一、目的要求了解玉米種子鹽溶蛋白提取方法、電泳程序、染色和鑒別方法。二、原理和依據(jù)二、原理和依據(jù)利用不同帶電質(zhì)點在一定電場中的遷移速度不同進行分離，凝膠電泳除了電荷效應，還有分子篩效應和PH梯度等。三、材料、儀器三、材料、儀器和試劑和試劑材料：材料： 玉米種子。儀器：儀器： 電泳儀，電泳槽，離心機，離心管，1/1000電子天平或分析天平，樣品鉗，廣口瓶，移液管及移液管架，微量進樣器（1-50l），注射器等電泳用品。試劑：試劑： 丙烯酰胺（Acr），亞甲基丙烯酰胺（Bis），甲酸

2、，甲酸鈉，過硫酸銨（APS），四甲基乙二胺（TEMED），NaCl，蔗糖，甲基綠，甘氨酸，考馬斯藍R250，三氯醋酸（TCA），乙醇（96%），乙酸（99%）等。所有化試劑都需是分析級或以上等級。四、四、方法和方法和步驟步驟1溶液配制（1）凝膠溶液的配制貯備液A（分離膠貯備液）：稱取90g Acr，3g Bis，加入去離子水350ml，攪拌至完全溶解（約30min）后定容到500ml，放入棕色瓶中低溫保存。貯備液B（分離膠緩沖液）：吸取含量88%的甲酸0.427ml，稱取甲酸鈉（含2個結(jié)晶水）1.0456g，加入50ml去離子水，攪拌混勻，并定容到100ml，并調(diào)節(jié)pH至3.2，倒入棕色瓶中低

3、溫保存。貯備液C（分離膠化學聚合催化劑1%APS）：稱取2gAPS，加入100ml去離子水，攪拌至完全溶解，并定容到200ml，倒入棕色瓶中低溫保存，僅能保存倒入棕色瓶中低溫保存，僅能保存1周。周。貯備液D（濃縮膠貯備液）：稱取9.3gAcr和0.31gBis，先加入30ml去離子水，攪拌至完全溶解，再定容到50ml，倒入棕色瓶中低溫保存。貯備液E（濃縮膠緩沖液）：吸取含量為88%甲酸0.218ml，稱取甲酸鈉0.5228g，加入30ml去離子水溶解，并定容到50ml，調(diào)節(jié)pH至5.6。倒入棕色瓶中低溫保存?；蛘呦热芙饧姿徕c，然后用甲酸滴加，調(diào)節(jié)pH至5.6。貯備液F（濃縮膠聚合催化劑1%AP

4、S）：稱取1gAPS，先用60-70ml去離子水溶解，攪拌至完全溶解后定容到100ml，倒入棕色瓶中低溫保存。僅能保存1周。貯備液G（凝膠聚合加速劑TEMED）：吸取1mlTEMED，加去離子水1ml溶解，放入冰箱低溫保存。（2）樣品提取液的配制稱取0.2928g NaCl，20g蔗糖和0.04g甲基綠，加去離子水溶解，充分攪拌至溶解，定容到100ml。（稀鹽溶液）（3）電極緩沖液配制吸取含量為88%甲酸溶液8.54ml，稱取甘氨酸6.006g，先用1600ml去離子水溶解后定容到2000ml，混勻并調(diào)節(jié)pH至3.45備用，可重復使用5次（或先將甘氨酸溶解，然后滴加甲酸，調(diào)至pH3.45）。（

5、4）蛋白質(zhì)染色液配稱取1g考馬斯亮藍R250，先用95%酒精溶解至100ml，另用去離子水配制10%（W/V）的TCA溶液。使用之前吸取1%考馬斯亮藍液3.5ml于100ml的10%TCA溶液中，配成一塊凝膠板染色液。注：該染色液具有注：該染色液具有固定和染色固定和染色兩種功能。必須在放入凝膠兩種功能。必須在放入凝膠染色前再混合。染色前再混合。（5）凝膠貯備液配制貯備液編號貯備液編號分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠配比配比一塊板取液量一塊板取液量配比配比一塊板取液量一塊板取液量A515mlB13mlC26mlD11mlE11mlF22mlG80ul40ul40ul2. 操作技術(shù)（1）樣品制備：取單粒玉

6、米種子，在單粒樣品磨碎儀上粉碎后，收集到1.5ml離心管中，按約1 1的量用洗瓶或滴管加入樣品提取液，搖勻，放置5min后，再搖一次，5000rpm離心15min，取上清液點樣。在做玉米品種測定時，可不用離心，自然沉降30min后，取上清液即可，該樣品浸提在冰箱中進行更好。點樣后樣品可放入冰箱中保存兩天，再電泳時，只需將樣品重新?lián)u動一次就行。一般加樣30-50ul。（2）凝膠制備:電泳槽準備：垂直板夾芯電泳槽安裝比較簡便，先將玻璃裝入橡膠封條中，然后插入有機玻璃制成的電泳槽中，擰緊螺栓，固定好成膠模。此步操作要注意玻璃板必須洗干凈，而且要干燥，手指不能接觸玻板表面，操作時可戴細紗手套用或用手拿

7、住玻板棱，另外，膠模在電泳槽中要放水平，位置合適，以防漏水。配膠：從冰箱中取出凝膠貯備液，根據(jù)電泳槽的大小，按表4中的比例取出一定體積的分離膠各貯備液混勻，同樣取出濃縮膠溶液，混勻，G液先不加入液先不加入，將各貯備液再放回冰箱。注意注意取貯備液用的移液管要分別使用，不能混用取貯備液用的移液管要分別使用，不能混用。封底縫：為了使膠和下槽相通，成膠模下邊有一條底縫，灌制分離膠前必須先將底縫用膠封住，根據(jù)底縫大小，取適量分離膠混合液，加入適量G液（用微量注射器加入），然后迅速搖勻，沿下槽玻板外壁倒入，將底縫封住。將電泳槽在實驗臺面上振動一下，使底縫封平。對于多個電泳槽的封底縫可用同時進行。一般5-1

8、0min，分離膠就會聚合將底縫封住。灌分離膠：封底后，用濾紙條插入兩玻板之間，吸去因成膠而析出的水，從分離膠混合液中取出一塊板的膠量，按比例加入G液，迅速搖勻，將電泳槽傾斜，將分離膠混合液倒入兩玻板之間達一定高度（距玻板上邊約1.0-1.5cm）。灌膠過程中注意不能產(chǎn)生氣泡，如出現(xiàn)氣包可用細不銹鋼絲快速挑出。灌膠后，用預先準備好的注射器注水封住膠面，水封的動作必須要輕，不能沖壞膠面，當水封后，分離膠和水層間有一界面，等一下界面消失，再出現(xiàn)界面時表明凝膠已成，此時倒出封水，用濾紙吸干，注意濾紙不能接觸膠面。灌濃縮膠：取適量濃縮混合液，按比例加入G號溶液，迅速搖勻，灌入電泳槽中，插好事先準備的樣品

9、刷，用夾子夾住。該膠聚合很快，故動作要快，樣品梳要插平。加樣：濃縮膠聚合后，倒入電極緩沖，上槽電極緩沖液面要高于短玻板，然后小心拔出樣品梳，用微量進樣器吸取20-30ul玉米蛋白提取液的上清液依次在樣品槽中點樣，每點一個樣要清洗微量進行器。電泳：點樣完畢，將電源線正極接上槽，負極接下槽將電源線正極接上槽，負極接下槽，接通冷卻水，打開電泳儀電源開關(guān)，采用穩(wěn)壓方式，調(diào)節(jié)電壓300-600V。注意電源正負極不能接反，電泳開始后，觀察電泳情況，剛開始甲基綠在濃縮膠中會濃縮成一條細線，進入分離膠后，甲基綠開始擴散電泳至槽底部距膠底部邊緣0.5-1.0cm處時，關(guān)閉電泳儀（一般電泳時間為1.0-1.5h）。卸板：卸板：倒出電極緩沖液，擰松固定螺桿，將玻璃板和密封膠帶一同取出，卸下密封膠帶，用不銹鋼刀小心撬開玻板，如發(fā)生粘板，用長針頭注射器一邊注射水一邊剝離，剝離完后將凝膠板倒入染色液中，用刷子將膠板完全按入染色液中。染色：染色：該染色方法快速，本底不著色，一般染10-30min就可觀察譜帶，完全染色則需要4h以上的時間。該染色液中考馬斯亮藍R250呈懸浮狀，在染色過程中會沉集在膠板和染色盤底，可重復使用。洗板：洗板：將染好的膠板用鏟子鏟出，放在白瓷磚上。若膠面沉集有染料，影響結(jié)果觀察，可用刷子沾取0.5%（W/V）的洗衣