白木香肉桂酸―4―羥基化酶(C4H)基因克隆和表達研究

1、白木香肉桂酸一4輕基化酶(c4h)基因克隆和表達研究收稿日期2013-10-28基金項目國家自然科學(xué)基金項目( 31000136, 81173481)；北京市自然科學(xué)基金項目(6102024)；教育部 新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(2008)；高等學(xué)校博士學(xué)科 點專項科研基金項目(20091106120009)；國家“十二五” 科技支撐計劃項目(2011bai01b07)；海南省中藥現(xiàn)代化專 項項目(2010zy001,2012zy002)；海南省重大科技研發(fā)專項(zdzx20100006)通信作者*張爭，tel: (010) 57833363, e-mail： zhangzheng321126

2、. com； *郭慶梅，教授，博士生導(dǎo)師，tel: e-mail： qmguosina. com作者簡介梁良，tel: (010) 57833363, e-mail： liangliangol1811126 com摘要對國產(chǎn)沉香的基原植物白木香aquilaria sinensis肉桂酸-4-輕基化酶基因c4h編碼區(qū)進行克隆，并 對其進行生物信息學(xué)分析和表達分析。根據(jù)已報道的白木香 傷害轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果分析獲得1條具有肉桂酸務(wù)化酶 酶保守結(jié)構(gòu)域的c4h基因序列，采用rt-pcr技術(shù)克隆得到 白木香c4h基因編碼區(qū)序列，并對c4h蛋白進行生物信息學(xué) 分析。另外，采用q

3、rt-pcr方法對c4h基因在傷害脅迫下的 表達模式進行分析。序列分析表明，所克隆的c4h基因編碼 區(qū)開放閱讀框(opening reading frame, orf)長為 1 515 bp, 編碼514個氨基酸，genbank登錄號為kf134783。qrt-pcr 實驗證明c4h基因受不同傷害處理的誘導(dǎo)，分別在8, 20 h 達到最高表達水平。白木香c4h基因的編碼區(qū)序列的分離克 隆為進一步研究c4h蛋白在白木香中黃酮及芳香族類化合物 合成途徑中的功能及表達調(diào)控奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞c4h酶；白木香；芳香族化合物；傷害 國產(chǎn)沉香為瑞香科植物白木香aquilaria sinensis(lour.

4、) gilg含樹脂的木材。作為我國傳統(tǒng)中藥，沉香有具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，用于胸腹脹 悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急1。沉香只有在健 康白木香樹受到外界傷害后才能形成2。但是，傷害誘導(dǎo) 沉香形成的分子機制一直未得到清晰揭示，制約了高效結(jié) 香技術(shù)的建立。沉香的化學(xué)成分主要為：倍半菇類、芳香族 類成分和2- (2-苯乙基)色酮3-4 o合成芳香族化合物的 苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶之一是肉桂酸-4-羥基化酶5。研究 表明，c4h在轉(zhuǎn)錄水平上的豐度和蛋白質(zhì)水平上的活性能有 效影響植物中芳香族化合物和黃酮類化合物的生物合成量 6-8 o本實驗根據(jù)已知的植物c4h的氨基酸序列進行同源 序列比對

5、，設(shè)計引物，應(yīng)用rt-pcr從白木香中克隆c4h基 因全長并進行序列分析，了解白木香c4h基因的結(jié)構(gòu)與功能, 這對從分子水平上探討白木香苯丙烷類次生代謝途徑具有 重要意義。1材料中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所溫室栽培的3年生白木 香莖誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷分別進行機械傷害（用滅菌后的刀片切 割至體積約為5 mm3的小塊）和100 nmol l1 meja （茉 莉酸甲酯）處理，于處理后2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 h取 樣，用于提取總rna,檢測c4h基因在健康和傷害后愈傷組 織中的表達差異。2方法2. 1總rna提取按照easyspin plus植物rna快速提取試劑盒（aidlab

6、, 中國）實驗操作步驟進行rna制備，制備好的總rna最終溶 解于30 u l rnase free水中，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測rna 完整性，分光光度計 nanodrop 2000c （thermo scientific, 美國）測定rna濃度。2. 2 cdna第一鏈的合成利用 takara公司的m-mlv rtase cdna synthesis kit 試 劑盒將白木香總rna反轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補鏈dna （ cdna）o 反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件及程序均按照takara公司的m-mlv rtase cdna synthesis kit試劑盒說明書進行。2.3 c4h基因的克隆從白木香轉(zhuǎn)錄組高通

7、量測序9結(jié)果中獲得1個由表達 序列標簽拼接而成的序列，經(jīng)注釋分析發(fā)現(xiàn)此片段是具有完 整開放閱讀框的c4h基因，其開放閱讀框為1515 bp,定名 為 c4h o根據(jù) genbank (http： /ww. ncbi. nlm. nih. gov) 中扌艮 道的植物c4h基因同源性較高的核昔酸序列，設(shè)計保守區(qū)簡 并引物 c4h-f : cttcttcccgacacaaaatatct 和 c4h-r : cccaaaacagtacattggacag。以白木香總rna的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為 模板，按照下列體系進行擴增：cdna3 n l, 10xpfu buffer 5 pl, dntp (2. 5 mmo

8、l - l-l) 4 ul, taq plus (2. 5 u ul-1) 1 ul, 10 nmol 引物各 1 ul,終體積為 50 ylo 反應(yīng)程序 95 °c 5 min； 70 °c 60 s； 48 °c 60 s； 72 °c 2 min； 30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 °c延伸反應(yīng)5 min； 4 °c保 存。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將回收的目的片段回收 與pgm-t載體連接，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌top 10中， 用藍白斑篩選重組子，挑選陽性克隆的單菌落37 °c培養(yǎng) 1216 h,經(jīng)菌液驗證后選擇擴增出

9、與目的片段一致的條帶 的克隆(2個)送上海英濰捷基生物技術(shù)公司(北京測序部) 進行測序。2.4 c4h的生物信息學(xué)分析2. 4. 1 c4h蛋白的理化特性分析 基因編碼蛋白的理化性 質(zhì)預(yù)測采用expasy proteomics server提供的在線工具protparam(http/ww. expasy. ch/tools/protparam. html)10。2. 4. 2 c4h跨膜區(qū)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用tmhmm 2. 0進行 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測； 采用swiss-model ( http : /swissmodel. expasy. org/)進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析； 采用 phyre (

10、http： /www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre) 進行 結(jié)構(gòu)域的三維建模11-12 o2. 4.3進化樹分析 將c4h翻譯的氨基酸序列與ncbi數(shù) 據(jù)庫中的c4h氨基酸序列在線blast比對，通過mega4軟 件構(gòu)建neighbor-joining系統(tǒng)進化樹。進化距離的計算采 用泊松校正法，bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次13。2.5白木香c4h基因在不同傷害處理時間的表達分析實時熒光定量pcr (real-time pcr)為了明確c4h基 因在不同組織及不同傷害處理下的表達特性，利用熒光定 量pcr進行表達量的檢測。檢測白木香愈傷組織中c4h基因 在其

11、不同傷害處理及不同處理時間的表達情況。儀器釆用伯 樂的cfx96tm c1000實時pcr檢測系統(tǒng)。反應(yīng)體系為： 2xsybr premix ex taqtm 5 ml；正反向引物濃度均為0. 25 pl； cdna模板0. 3 nl；加水補足至10 pl,每個反 應(yīng)體系至少重復(fù)3次。實時pcr擴增程序如下：95 °c 30 s； 95 °c 5 s； 60 °c 20 s, 40個循環(huán)。實時pcr反應(yīng)均以三 磷酸甘油醛脫氫酶基因(gapdh)為內(nèi)參14-15 o3結(jié)果與分析3. 1白木香c4h基因的克隆根據(jù)高通量測序結(jié)果，以白木香的cdna為模板，利用 pcr方

12、法擴增獲得1個1 515 bp的基因序列，編碼504個氨 基酸，genbank登陸號kf134783。白木香c4h基因pcr擴 增結(jié)果見圖lo基因命名為c4h,將其連接pgm-t載體轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌t0p10,測序結(jié)果經(jīng)ncei的blast比對，確定其 擴增產(chǎn)物為白木香c4h基因cdna的片段。m. dl2000 dna marker； 1. pcr 產(chǎn)物。圖1白木香c4h基因的克隆fig. 1 cloning of c4h from aquilaria sinensis3.2 c4h的生物信息學(xué)分析3.2. 1 c4h蛋白的理化特性分析利用expasy proteomics server 的

13、在線軟件 protparam ( http : /www. cn. /tools/protparam. html) 對 c4h 蛋 白的理化性質(zhì)進行預(yù)測分析。推測其分子式為 c2616h4140n7220725s16,相對分子質(zhì)量 57.819 01 kda, 等電點pl 8. 78o帶正電殘基(arg+lys) 65,負電殘基 (asp+glu) 60o該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為50. 98,脂肪系數(shù) 為99. 78,親水性系數(shù)為-0. 184o3. 2. 2 c4h跨膜區(qū)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 用tmhmm2. 0預(yù)測c4h 跨膜區(qū)域。蛋白含有2個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，分別位于927位 和4

14、45463位氨基酸之間。由分析軟件建立的c4h三維結(jié) 構(gòu)模型見圖2。圖2 c4h蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測fig. 2 the 3 dimension strueture of c4h3. 2.3 c4h氨基酸序列的分子系統(tǒng)進化分析利用ncbi 在線blast工具，將c4h與genbank中18種植物的c4h蛋 白進行比對，c4h蛋白與欖樹、黃瓜等植物的c4h蛋白相似 性達90%。通過mega 4軟件采用相鄰連接法構(gòu)建c4h進化樹, 進行聚類關(guān)系分析，見圖3。3.3白木香c4h基因在不同傷害處理時間的表達分析健康的白木香只有受到外界傷害后才能產(chǎn)生沉香類物 質(zhì)。研究表明，機械傷害和化學(xué)刺激都能夠誘導(dǎo)相關(guān)

15、物質(zhì)的 產(chǎn)生3-4 o為了研究c4h基因的表達是否受這些因素的調(diào) 節(jié)，本實驗采用熒光定量pcr的方法對c4h在不同處理下不 同時間點的表達量進行了分析，見圖4。本研究采用qrt-pcr 分別檢測未處理組對照組、機械傷害及100 umol l-l meja 分別處理(2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 h)后c4h基因的表 達情況，結(jié)果顯示c4h基因在新鮮愈傷組織中表達量較低， 在meja處理下，c4h基因的表達緩慢升高，20 h時達到最 高表達水平，而后緩慢下降，但仍然高于健康中的表達水平; 機械傷害對c4h基因的誘導(dǎo)強度明顯強于meja處理，表達 在8 h時到最大，然后急劇下降。

16、c4h序列來自genbank數(shù)據(jù)庫；圖中數(shù)字為自舉檢驗置信值(1 000個重復(fù))。圖3植物c4h氨基酸序列系統(tǒng)進化樹fig. 3 phylogenetic analysis of c4h amino acidsequence圖4機械傷害和meja處理后c4h的表達情況fig. 4 expression profile of c4h after mechanical and meja wounds4討論肉桂酸-4-務(wù)基化酶(c4h)是植物苯丙烷代謝通路中的 第2個酶，該酶在植物細胞中的含量可以影響黃酮、木質(zhì)素 及芳香族類物質(zhì)的合成等多條代謝支路16 o逆境脅迫下， 植物可通過調(diào)節(jié)一系列合成相關(guān)酶

17、基因的轉(zhuǎn)錄水平從而影 響其黃酮類和芳香族類的合成和積累13,其中就包括c4ho ryan等7在矮牽?；ㄖ械难芯堪l(fā)現(xiàn)，uv-b脅迫處理下，c4h 等基因表達量的增加使得植物組織中總黃酮含量增加。baek 等17在黑莓中發(fā)現(xiàn)，黃酮積累量與c4h表達量在果實發(fā)育 的不同時期表現(xiàn)了同步增加或減少的變化趨勢。liu等18 發(fā)現(xiàn)k離子缺乏誘導(dǎo)的菊花中c4h等基因的表達量減少，造 成了該部位黃酮含量的降低。植物中有多個參與苯丙烷類代 謝途徑的p450酶類，其中c4h作為苯丙烷類代謝途徑的第1 個p450,其一級結(jié)構(gòu)中與肉桂酸結(jié)合的特異氨基酸殘基以及高級結(jié)構(gòu)(二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu))所形成的活性中心口袋 19,使

18、其在結(jié)構(gòu)和功能上與其他p450區(qū)別開來13 o此 外，植物黃酮的生物合成一般定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上，由一系 列特定的黃酮合成相關(guān)酶組成的多酶復(fù)合體連續(xù)合成并轉(zhuǎn) 運到特定的亞細胞結(jié)構(gòu)中20 o c4h的n-末端的膜錨定信號 基(signal-anchor sequence),使其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上, 參與苯丙烷類代謝途徑中多酶復(fù)合體的亞細胞定位和內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)上電子鏈的化學(xué)傳遞21。芳香族化合物是沉香藥材的重要有效成分之一 22-23,解析其生物合成途徑是 闡明結(jié)香機制和建立高效結(jié)香技術(shù)體系的分子基礎(chǔ)。高通量 測序技術(shù)是非模式藥用植物基因挖掘的有效手段，課題組前 期對白木香進行了轉(zhuǎn)錄組分析，從中得到大量關(guān)

19、鍵合成酶基 因片段3, 9。本研究根據(jù)測序得到的c4h基因的轉(zhuǎn)錄本信 息，成功從白木香中克隆了一個c4h基因的全長cdna并對 其進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，c4h和其他植物中已經(jīng) 鑒定的c4h具有較高的同源性及相類似的理化特性，說明 本研究克隆的c4h屬于c4h基因家族。健康的白木香不能產(chǎn) 生沉香，只有受到傷害后才能被誘導(dǎo)產(chǎn)生，用典型的機械 傷害及meja處理2種方法處理健康的愈傷組織，檢測c4h 基因的表達，發(fā)現(xiàn)c4h基因顯著受這2種傷害的誘導(dǎo)，該結(jié) 果初步揭示了 c4h基因在沉香形成中的可能作用。參考文獻1 中國藥典一部s1.2010： 172.2 張爭，楊云，魏建和，等白木香結(jié)香機制

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