酵母RNA 的提取、鑒定和定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)十

1、一、一、RNARNA基團(tuán)鑒定基團(tuán)鑒定二、電泳分離鑒定二、電泳分離鑒定三、光譜鑒定三、光譜鑒定四、純度鑒定四、純度鑒定實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理稀堿法稀堿法RNARNA提取方法方法與分類提取方法方法與分類硼酸硼酸干燥，稱重，計(jì)算提取率（并保存好干燥，稱重，計(jì)算提取率（并保存好RNARNA）RNARNA含量測(cè)定之一：地衣酚法含量測(cè)定之一：地衣酚法RNARNA的地衣酚法定量測(cè)定原理的地衣酚法定量測(cè)定原理RNARNA含量測(cè)定之一含量測(cè)定之一：地衣酚法測(cè)定。：地衣酚法測(cè)定。 反應(yīng)原理：當(dāng)反應(yīng)原理：當(dāng)RNARNA與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛糠醛

2、，后者與，后者與3 3，5-5-二二羥基甲苯羥基甲苯（地衣酚地衣酚 orcinolorcinol）反應(yīng)，在）反應(yīng)，在FeFe3+3+或或CuCu2+2+催化下，生成催化下，生成鮮綠色鮮綠色復(fù)合物。反應(yīng)產(chǎn)物在復(fù)合物。反應(yīng)產(chǎn)物在670 nm670 nm處有最大吸收。處有最大吸收。RNARNA濃度在濃度在20-20-250g/ml250g/ml范圍內(nèi)，光密度與范圍內(nèi)，光密度與RNARNA濃度成正比。濃度成正比。max=670 nmA A、核糖鑒定、核糖鑒定： RNAH2SO4100 管管 號(hào)號(hào) 試試 劑劑0 01 12 23 34 45 5標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)RNARNA溶液溶液（mlml）(100g/ml)(

3、100g/ml)0 00.40.40.80.81.21.21.61.62.02.0蒸餾水（蒸餾水（mlml）2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.40 0地衣酚試劑地衣酚試劑（mlml）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0（2 2）樣品的測(cè)定）樣品的測(cè)定準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取0.1 g0.1 g提取的酵母提取的酵母RNARNA，放入小燒杯中，加少，放入小燒杯中，加少量蒸餾水調(diào)成糊狀，溶解，若不溶，則滴入少量量蒸餾水調(diào)成糊狀，溶解，若不溶，則滴入少量5%-6%5%-6%氨水助溶，調(diào)氨水助溶，調(diào)pHpH至至7.07.0，小心轉(zhuǎn)移到，小心轉(zhuǎn)移到25

4、ml25 ml容量瓶中，容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，混勻。取用蒸餾水定容到刻度，混勻。取1.0 1.0 mlml樣品液樣品液稀釋稀釋4040倍倍后，分別取后，分別取2 2份份2.0 ml2.0 ml的稀釋液，加入的稀釋液，加入2.0 ml2.0 ml的地衣的地衣酚試劑，混勻，與標(biāo)準(zhǔn)曲線的各管同時(shí)置酚試劑，混勻，與標(biāo)準(zhǔn)曲線的各管同時(shí)置沸沸水浴中加水浴中加熱熱4545分鐘，冷卻，測(cè)定分鐘，冷卻，測(cè)定O.D 670670。100/mlgmlg待測(cè)液中制品的濃度待測(cè)液中測(cè)得的濃度nRNARNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸組分，含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸組分，加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸銀、地衣

5、加硫酸煮沸可使其水解，用硝酸銀、地衣酚和定磷試劑可分別鑒定嘌呤堿、核糖和酚和定磷試劑可分別鑒定嘌呤堿、核糖和磷酸組分。磷酸組分。 A、嘌呤鑒定、嘌呤鑒定：嘌呤嘌呤 嘌呤銀化物嘌呤銀化物（白色或紅棕色）（白色或紅棕色）AgNO3RNAH2SO4100操作方法操作方法取兩支離心管，向第一支管中加入取兩支離心管，向第一支管中加入2 ml2 ml樣品溶液和樣品溶液和2 ml2 ml蒸餾水。第二支管中加入蒸餾水。第二支管中加入2 2 mlml樣品溶液和樣品溶液和2 ml2 ml沉淀劑?；靹颉３恋韯??；靹颉?在冰浴中放置在冰浴中放置3030分鐘，然后離心分鐘，然后離心1010分鐘，分鐘，30003000轉(zhuǎn)

6、轉(zhuǎn)/ /分鐘。分鐘。 從各管中取出從各管中取出0.25 ml0.25 ml上清液，用蒸餾上清液，用蒸餾水定容到水定容到25 ml25 ml。 于于260nm260nm處測(cè)定其處測(cè)定其光吸收光吸收值（值（OD1OD1、OD2OD2）RNARNA吸收光譜曲線。吸收光譜曲線。劑i 1 1、推入黑體遮光預(yù)熱、推入黑體遮光預(yù)熱2、 在在 “T” 位置位置調(diào)調(diào) “0”3、在在 “T” 位置調(diào)位置調(diào) “100”4、按到、按到 “A” 位置測(cè)定位置測(cè)定UV-2000醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖1. 1. 濾紙橋?yàn)V紙橋 2. 2. 電泳槽電泳槽 3. 3. 醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素薄膜

7、4. 4. 電泳槽膜支架電泳槽膜支架 5. 5. 電極室中央隔板電極室中央隔板（1）市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在151530s30s內(nèi)迅速潤(rùn)濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜內(nèi)迅速潤(rùn)濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳。均勻可用于電泳。（2 2）醋酸纖維素薄膜電泳常選用）醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6pH8.6巴比妥巴比巴比妥巴比妥鈉緩沖液，其濃度為妥鈉緩沖液，其濃度為0.050.050.09mol/L0.09mol/L。選擇何種濃。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過(guò)低，則區(qū)度與樣品和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過(guò)低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快，區(qū)帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過(guò)高，則帶泳動(dòng)速度快，區(qū)帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過(guò)高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過(guò)于集中，不易分辨。區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過(guò)于集中，不易分辨。（3 3）點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液