免疫學終結(jié)版

1、LOGO免疫學在食品分析中的應(yīng)用免疫學在食品分析中的應(yīng)用LOGO基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識 免疫學：研究自身防御，機體如何識別異物并與之發(fā)生反應(yīng)的一門科學，它在生長、遺傳、衰老、腫瘤、移植以及自身免疫病的發(fā)生上都有重要的作用。 免疫（Immunity）：指生物機體識別自身和非自身物質(zhì)，對自身物質(zhì)形成天然免疫耐受，對非自身物質(zhì)產(chǎn)生清除作用的一種生理學反應(yīng)。LOGO 近年來,國內(nèi)外許多專家學者致力于食品檢驗方法的研究,出現(xiàn)了許多快速檢驗新技術(shù),如免疫技術(shù)包括: 酶聯(lián)免疫吸附測定、放射免疫測定、免疫傳感器、阻抗測量法、生物發(fā)光法與化學發(fā)光法、熒光免疫測定、金黃色葡萄球菌A蛋白及其協(xié)同凝集試驗,核酸探針、磁性分

2、離技術(shù)等。LOGO4主要內(nèi)容3： 免疫熒光技術(shù)1 1 酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)2 2 放射免疫技術(shù)(RIA)3 3 單克隆抗體技術(shù)4 4LOGO一.免疫熒光技術(shù) （一）基本原理： 抗體與熒光素結(jié)合后，并不影響其和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，事先將待測抗原固定于載玻片上，滴加熒光標記抗體，若熒光標記抗體與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，不能被緩沖液沖掉，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光，否則熒光抗體被緩沖液沖掉，在熒光顯微鏡下觀察不到熒光。LOGO （二）抗體的熒光標記： 熒光素是一種能吸收激發(fā)光的光能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使用的有機化合物,也稱熒光色素。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(FITC

3、)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。 標記原理:利用抗體蛋白的自由氨基與FITC的異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。LOGO異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)LOGO熒光素與抗體結(jié)合方法： 透析法：適用于蛋白質(zhì)含量低、樣品體 積小的抗體溶液的標記 標記較均勻，非特異熒光較低 攪拌法：適用于蛋白質(zhì)含量較高、樣品 體積較大的抗體溶液的標記 標記時間短、效率較高，熒光 素用量節(jié)省 影響因素多，非特異熒光較強LOGO （三）標本的制作： 食品衛(wèi)生檢驗中，熒光標記抗體檢測標本的制作方法是將樣品增菌液涂在載玻片上，涂片應(yīng)薄而均勻，干燥后用化學方法固定，然后進行熒

4、光染色。LOGO直接直接法法直接熒光抗體染色法示意直接熒光抗體染色法示意圖圖 熒光素標記的熒光素標記的特異性抗體直特異性抗體直接與相應(yīng)抗原接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。反應(yīng)。（四）熒光抗體染色方法LOGO間接法特異性抗體與相特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標記的抗抗光素標記的抗抗體再與第一抗體體再與第一抗體結(jié)合結(jié)合。 間接熒光抗體染色法示圖間接熒光抗體染色法示圖 抗原抗體標記抗體光原熒光LOGO補體結(jié)合法 兩種熒光素分別標記的兩種不同的特異性抗體，與同一標本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光?？贵w補體標記抗補體抗體光源熒光LOGO （五）在食品檢驗中的應(yīng)用 免疫熒光檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)

5、生領(lǐng)域，可檢測細菌、病毒、寄生蟲等，在食品衛(wèi)生領(lǐng)域也應(yīng)用得越來越多。LOGO二.酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。 基本原理：它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定，測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）酶標記的抗原或抗體（標記物）酶作用的底物（顯色劑）LOGO 測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)仍保留其免疫活性，然后加

6、一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相再加上酶的相應(yīng)底物，即起應(yīng)底物，即起催化水解或氧催化水解或氧化還原反應(yīng)而化還原反應(yīng)而呈顏色。呈顏色。LOGO 其所生成的顏色深淺與欲測其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）也可以用分光光

7、度計（酶標儀）加以測定。加以測定。 其方法簡單，方便訊速，其方法簡單，方便訊速，特異性強。特異性強。LOGO 間接法間接法雙抗體夾心法雙抗體夾心法捕獲法捕獲法競爭法競爭法ELISA常用的操作方法LOGO間接法間接法方法方法 用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗體用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗體IgGIgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點優(yōu)點 一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。應(yīng)用應(yīng)用 常用于常用于HCVHCV抗體、抗體、HIVHIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測抗體和梅毒螺旋體抗體等的測 定。定。ELISA

8、ELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法LOGO間接法測抗體間接法測抗體- -E EE EE EE EE EE EE EE EE ELOGO雙抗體夾心法雙抗體夾心法方法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色。酶標抗體，加底物顯色。應(yīng)用：應(yīng)用： 二價或二價以上的較大分子抗原測定二價或二價以上的較大分子抗原測定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCGHCG等等ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法LOGO競爭法競爭法原理原理：類似檢測抗原的競爭法類似檢測抗原的競爭法 應(yīng)用應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒核

9、心抗體( (HBcAbHBcAb) )和乙型肝炎和乙型肝炎病毒病毒e e抗體抗體( (HBeAbHBeAb) )的檢測的檢測 。ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法LOGO捕獲法捕獲法原理：原理：抗人抗人IgMIgM鏈抗體包被，捕獲待測標本中鏈抗體包被，捕獲待測標本中IgMIgM類抗類抗體。加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體。加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體體 ，底物顯色。，底物顯色。應(yīng)用：應(yīng)用：病原體急性感染診斷中的病原體急性感染診斷中的IgMIgM型抗體，甲型抗體，甲型肝炎型肝炎HAV-HAV-IgMIgM抗體，乙型肝炎病毒核心抗體，乙型肝炎病毒核心HBc-HBc-I

10、gMIgM抗體。抗體。ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法LOGOELISA ELISA 法在食品安全檢測中的應(yīng)用法在食品安全檢測中的應(yīng)用 1.動物性食品中藥物殘留檢測 近年來動物性食品藥物殘留問題更加突出。食品中獸藥殘留主要包括抗生素類、磺胺藥類、呋喃藥類、抗球蟲類、激素藥類和驅(qū)蟲藥類藥物。目前國內(nèi)應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測藥物殘留研究取得較大進展。 瘦肉精是現(xiàn)在肉制品中的一種常見的添加劑,可致癌變或直接影響人體健康,是一種2-腎上激素受體激動劑,化學名為鹽酸克倫特羅。 ELISA法應(yīng)用于瘦肉精檢測靈敏度高,成本低,前處理簡單且快速。LOGO 2.食品中農(nóng)藥殘留的測定 農(nóng)藥殘留是指農(nóng)

11、藥使用后殘存于食品(農(nóng)副產(chǎn)品)中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。 目前，農(nóng)殘已成為我國人民膳食的主要食品安全問題，也是影響我國農(nóng)產(chǎn)品出口的一個重要因素。 可用ELISA檢測的農(nóng)藥殘留種類包括: 1.有機磷農(nóng)藥2.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥3.有機氯類農(nóng)藥。LOGO 3.食品中生物毒素的檢測食品中生物毒素的檢測 生物毒素是其產(chǎn)生菌在適合產(chǎn)毒的條件下所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。在食品加工時雖然經(jīng)加熱、烹調(diào)等熱處理, 但所產(chǎn)生的毒素結(jié)構(gòu)一般不能被破壞,所以食品中生物毒素也日益受到關(guān)注。黃曲霉毒素是一種致毒性和致癌性很強的真菌毒素, 各國都嚴格限制其在食品中的含量。 1977 年, La Well 首

12、次采用了 ELISA 法來檢測黃曲霉毒素，建立了直接競爭ELISA法檢測黃曲霉毒素B1。隨后,美國學者朱繁生教授、英國學者Morge教授改進了直接法并建立了間接競爭ELISA法。LOGO 4.食品中病原微生物的檢測 食品安全問題中,首要問題是微生物污染。檢 測微生物的方法很多,常規(guī)的微生物學檢驗方法試劑繁雜、檢驗周期長,遠不能適應(yīng)實際需要,而ELISA法很好的彌補了這一缺陷,用ELISA法可檢測食品中沙門氏菌、大腸桿菌等微生物,其中通過制備單克隆抗體分析食品中細菌的ELISA技術(shù)研究最多,檢測結(jié)果準確可靠。LOGO 5.轉(zhuǎn)基因食品的檢測 轉(zhuǎn)基因食品的安全性是最近有關(guān)食品安全性研討的熱點。由于其

13、安全性還在爭議之中, 許多國家都有嚴格的法規(guī)來管理轉(zhuǎn)基因食品。這就需要對轉(zhuǎn)基因食品進行檢測。ELISA 法就是通過檢測某些特定的轉(zhuǎn)基因表達蛋白,以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分, 或間接檢測轉(zhuǎn)基因表達的目的蛋白質(zhì)。LOGOELISA試劑盒LOGO三三. .放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)(RIA)(RIA)基本原理： 應(yīng)用放射性同位素標記待測物，形成標記抗原。以一定量的標記抗原，與各種不同量的非標記待測物和一定濃度的特異性抗待測物抗體相互作用，其反應(yīng)遵照質(zhì)量作用定律，標記待測物與非標記待測物競爭抗待測物抗體的結(jié)合部位，產(chǎn)生不同的結(jié)合率。當標記的待測物與抗待測物抗體的量保持一定時，則標記的

14、待測物與抗待測物抗體形成的復合物的多少就反映了待檢物的含量。LOGO放射性同位素標記的抗原高質(zhì)量的特異性抗體高純度的標準品緩沖液放射免疫分析的必備條件LOGODiagram固相放射免疫固相放射免疫測定測定1.1.抗體的包被抗體的包被2.2.抗原抗體反抗原抗體反應(yīng)。應(yīng)。3.B3.B、F F分離。分離。4.4.放射性強度放射性強度的測定。的測定。液相放射免疫液相放射免疫測定測定1.1.抗原抗體反抗原抗體反應(yīng)應(yīng)2.B2.B、F F分離技分離技術(shù)術(shù)3.3.放射性強度放射性強度的測定。的測定。放射免疫 測定法LOGO放射免疫技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用放射免疫技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用 放射免疫法分析由于靈敏度高

15、，特異性強，精密度高，特別適應(yīng)于蛋白質(zhì)、激素和多肽的精確定量測定。 放射免疫技術(shù)由于可以避免假陽性，適宜于陽性率較低的大量樣品檢測，對水產(chǎn)品、肉類產(chǎn)品、果疏產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量的檢測中廣泛應(yīng)用。 還可檢測經(jīng)食品傳播的細菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲及小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)。如南京農(nóng)業(yè)大學用放射免疫測定牛奶中的天花粉蛋白。LOGO四四. .單克隆抗體單克隆抗體 基本原理：單克隆抗體技術(shù)是應(yīng)用細胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性,它既具有 B 淋巴細胞合成專一抗體的特性,也有骨髓瘤細胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性,用這種來源

16、于單個融合細胞培養(yǎng)增殖的細胞群,可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。LOGO單克隆抗體制備的簡易過程過程B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導融合B-B細胞B-瘤細胞瘤-瘤細胞選擇培養(yǎng)雜交瘤細胞（ B-瘤細胞）克隆化培養(yǎng)抗體檢測雜交瘤細胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體LOGOLOGO單克隆抗體在食品檢測中的應(yīng)用單克隆抗體在食品檢測中的應(yīng)用 單克隆抗體在食品檢測中最大的優(yōu)點是特異性強，不易出現(xiàn)假陽性。在食品檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。目前人們已制備出各種經(jīng)食品傳播和引起食物中毒的細菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生蟲、農(nóng)藥、獸藥、激素等的單克隆抗體并建立的檢測方法。 磺胺二甲嘧啶和克倫特羅(瘦肉精)這兩種藥物

17、被歐美各國和我國列為獸藥殘留控制重點，國內(nèi)研究出了用于動物性食品中磺胺二甲嘧啶檢測的單克隆抗體試劑盒和克倫特羅殘留檢測的多克隆試劑盒。 單克隆抗體技術(shù)可對農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥和激素殘留快速檢測，在10min中內(nèi)快速檢測有機磷類、氨基甲酸酯類、有機氯類及激素類的殘留量。LOGO參考文獻參考文獻1任亞妮,車振明. 免疫標記技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用J. 中國調(diào)味品,2010,03:34-36. 2韓婷,陳紅兵. 免疫分析技術(shù)在食品農(nóng)殘藥殘檢測方面的應(yīng)用J. 江西食品工業(yè),2008,03:32-34.3李軍生,葉云,梁超香,何仁. 免疫檢測技術(shù)在食品檢驗中的應(yīng)用J. 廣西工學院學報,2005,01:23-26. 4洪葵. 免疫學技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用J. 食品科學,1996,12:3-6. 5郎需龍,劉文森,王興龍. 免疫學技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用J. 肉類工業(yè),2009,05:33-35. 6肖韡,買娜,王旭峰,常錚. 酶聯(lián)免疫吸附法在植物性食品安全檢測中的應(yīng)用J. 食品科學,2006,12:920-923. 7馬頎,任珊,許美玉. 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用J. 食品科技,2008,01:200-204. 8彩鴻翔,魯曉翠,侯玉澤,李卓洋,劉宣兵. 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用