高效液相色譜的日常使用和維護(hù)

1、高效液相色譜的日常使用和維護(hù)高新科技與現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，促進(jìn)了以高效液相色譜（ HPLC ）為代表的復(fù)雜樣品的分離分析和分離純化儀器的飛速發(fā)展。 HPLC 以它定量分析結(jié)果準(zhǔn)確、分析周期短、分析范圍廣、分析檢測(cè)限低等優(yōu)勢(shì)，在食品添加劑、藥物成分分析等多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜儀是一種高端檢測(cè)儀器，它精密快速，有效準(zhǔn)確檢測(cè)的同時(shí)就要求我們一定要嚴(yán)格正確使用儀器， 定期科學(xué)有效地維護(hù)儀器， 只有這樣儀器才能長(zhǎng)久持續(xù)有效使用。但是從目前實(shí)際使用情況看， 與高效液相色譜儀的應(yīng)用及產(chǎn)品技術(shù)升級(jí)的發(fā)展速度相比，其使用和維護(hù)則相對(duì)比較滯后，從而造成對(duì)儀器的濫用和對(duì)耗材不必要的浪費(fèi)。主要原因是由于

2、對(duì)于儀器使用操作者的培訓(xùn)側(cè)重于儀器的初步使用，忽略了儀器的后續(xù)培訓(xùn)及維護(hù)操作學(xué)習(xí)； 其實(shí)很多高效液相色譜都是國(guó)外進(jìn)口儀器，英文版本軟件對(duì)于大多數(shù)理工科畢業(yè)的儀器操作者也是一個(gè)障礙。筆者根據(jù)自己的工作經(jīng)驗(yàn)，以島津LC-20AT 液相色譜儀為例，闡述液相色譜儀在使用時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題及日常使用后的儀器維護(hù)基本事項(xiàng)，并對(duì)儀器使用過(guò)程中容易遇到的問(wèn)題進(jìn)行分析，提出解決方法。1、高效液相色譜儀的組成高效液相色譜儀主要是由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和色譜軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。1.1 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)主要包括溶液貯器、在線(xiàn)脫氣裝置、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置。溶液貯器用于存放符合HPLC 要求的流動(dòng)相。

3、在線(xiàn)脫氣裝置主要功能是流動(dòng)相在進(jìn)入柱子前排除氣泡。高效液相色譜柱的填料顆粒較小，通過(guò)2 5mm的色譜柱受到的流動(dòng)阻力很大，因此需要通過(guò)高壓輸液泵抽取流動(dòng)相輸送至色譜柱。高壓泵按輸液性能可分為恒壓泵和恒流泵兩種。按機(jī)械結(jié)構(gòu)又可分為液壓隔膜泵、氣動(dòng)放大泵、螺旋注射泵和往復(fù)柱塞泵四種，前兩種為恒壓泵，后兩種為恒流泵。恒壓泵可以輸出穩(wěn)定不變的壓力。在一般的分析儀器中，由于系統(tǒng)阻力不變，恒壓亦可達(dá)到恒流的效果。但是當(dāng)系統(tǒng)阻力發(fā)生變化時(shí)，輸入壓力即使不變，流量卻可隨阻力而變化。恒流泵則無(wú)論系統(tǒng)阻力如何變化都可保證其流量基本不變。在色譜實(shí)際操作中， 系統(tǒng)阻力可能隨著運(yùn)行時(shí)間的增加產(chǎn)生微小的改變，因此恒流泵比

4、恒壓泵更優(yōu)越。然而在泵和柱系統(tǒng)所允許的最大壓力下操作時(shí)，恒壓泵較為安全方便。供參考梯度洗脫裝置是采用兩種及以上不談性質(zhì)的溶劑，在分離過(guò)程中按照一定的程序設(shè)定改變流動(dòng)相組成的一種洗脫模式。通過(guò)流動(dòng)相極性的變化來(lái)調(diào)整被分離樣品的選擇因子和保留時(shí)間，可以使柱系統(tǒng)具有最佳的選擇性和最大的峰容量。梯度洗脫能夠提高分析成分之間的分離度，縮短分析周期，降低最小檢測(cè)限，提高分析精度。對(duì)于復(fù)雜混合物，特別是保留值相差較大的樣品的分離，梯度洗脫是一種極為有效的分析方法。1.2 進(jìn)樣器進(jìn)樣系統(tǒng)是將分析樣品送入色譜柱的裝置，分為手動(dòng)、自動(dòng)進(jìn)樣器兩種。手動(dòng)進(jìn)樣器配有 20100L 的定量環(huán)。1.3 色譜柱色譜柱以液體為

5、流動(dòng)相， 以廣義的固相為固定相來(lái)進(jìn)行分析樣品的分離工作， 它是高效液相色譜儀的心臟，柱效能高、選擇性好是對(duì)色譜柱的基本要求。色譜柱按照分離模式大致可以分為：正相色譜柱和反相色譜柱。正相色譜柱通常以硅膠 (Silica) 、胺基團(tuán) (NH2,APS) 和氰基團(tuán) (CN,CPS)等極性官能團(tuán)的 ) 非極性化合物的分離，樣品一般能溶于有機(jī)溶劑。反相色譜柱通常以硅膠為基礎(chǔ) ,表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相為填料；使用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，通常為水緩沖液與甲醇、已腈等混合物；適用于大多數(shù)有機(jī)化合物，生物大、小分子，樣品一般能溶于水。以 C8、 C18 反相色譜柱為代表。1.4 檢測(cè)器檢測(cè)器、泵與色譜

6、柱是組成 HPLC 的三大關(guān)鍵部件。 檢測(cè)器是將色譜柱分離出的樣品的物理或者化學(xué)特性轉(zhuǎn)換為可以測(cè)量的電信號(hào)， 通過(guò)色譜圖記錄下來(lái)， 由色譜圖中的峰形狀判斷分離效果， 依據(jù)標(biāo)物物質(zhì)、分析樣品的色譜圖中的出峰時(shí)間、峰面積分別對(duì)樣品進(jìn)行定性、定量分析。常用的檢測(cè)器主要有紫外吸收檢測(cè)器 （ UVD ）、示差折光檢測(cè)器（ RID ）、熒光檢測(cè)器（ FD）。2、高效液相色譜儀的日常維護(hù)2.1 高效液相色譜儀器的開(kāi)機(jī)、關(guān)機(jī)注意事項(xiàng)。一切分析準(zhǔn)備工作做好后， 依次按順序打開(kāi)穩(wěn)壓電源、 高壓輸液泵、 柱溫箱、檢測(cè)器，待以上各部件自檢結(jié)束后，打開(kāi)連接儀器的電腦，啟動(dòng)工作軟件。儀器分析工作結(jié)束后，關(guān)閉工作軟件，再依

7、次按順序關(guān)閉檢測(cè)器、柱溫箱、高壓輸液泵。供參考2.2 對(duì)流動(dòng)相的要求液相色譜所用的流動(dòng)相一般為低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑與水或者緩沖溶液的混合物。為保證液相色譜儀器的正常使用，所有流動(dòng)相必須是色譜級(jí)的，且經(jīng)過(guò)過(guò)濾雜質(zhì)、排除氣泡后裝入干凈的流動(dòng)相貯存瓶中待用。流動(dòng)相的物理性能要求對(duì)分析物要有足夠的溶解能力，以利于提高檢驗(yàn)的靈敏度；流動(dòng)相的黏度要小，以保證合適的柱降壓；流動(dòng)相的沸點(diǎn)要低，以利于制備分離時(shí)樣品的回收；流動(dòng)相的溫度一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱最高使用溫度不超過(guò)60，以低于40為宜。溫度過(guò)高會(huì)加速鍵合相水解和硅膠的溶解，從而使填料性質(zhì)改變，柱塌陷，降低柱效。最低使用溫度不超過(guò) 0。流動(dòng)相的過(guò)濾所有流動(dòng)相

8、在使用前都必須經(jīng)過(guò)0.45m（或 0.22m）的有機(jī)相 /脂溶性和水相（水溶性）濾膜過(guò)濾，以除去雜質(zhì)微粒。流動(dòng)相的脫氣液相色譜所用到的流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣， 否則容易在系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生氣泡， 影響泵的工作，影響基線(xiàn)的穩(wěn)定性。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相反應(yīng)。溶解氧能與某些有機(jī)溶劑（如甲醛、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，提高背景吸收，會(huì)在梯度洗脫時(shí)造成基線(xiàn)漂移或形成鬼峰。常有的脫氣方法有以下四種：（1） 在線(xiàn)真空脫氣法把真空脫氣裝置串聯(lián)到儲(chǔ)液系統(tǒng)中， 并結(jié)合膜過(guò)濾器，使流動(dòng)相在進(jìn)入輸液泵前脫氣，此法效果較好，尤其適用于多元溶劑體系。（2） 超聲波脫氣法此法是實(shí)驗(yàn)室較常用的一種方法， 將配置好的流動(dòng)相連同容器一起放入超聲波水浴中超聲 15 至 30 分鐘。（3） 抽真空脫氣法使用微型真空泵，降壓至 0.05 0.07MPa即可出去溶解的氣體。由于抽真空會(huì)引起混合溶劑組成的變化， 故