痢疾桿菌的分離與鑒定課件

1、痢疾桿菌的分離與鑒定濮陽市疾病預防控制中心許銀懷第一節(jié) 概 述Ø 志賀菌屬（Shigellae）細菌又稱痢疾桿菌， 引起人類及靈長類動物細菌性痢疾。Ø 1899年由日本人志賀首先發(fā)現(xiàn)。Ø 全球每年感染人次約為1.65億，死亡110萬，發(fā)病率、死亡率居感染性腹瀉之首位。Ø 發(fā)展中國家發(fā)病率較高，如阿根廷990.610萬、印度972.310萬；發(fā)達國家相對較低，如美國61210萬、德國2.710萬、法國0.310萬；我國上世紀5080年代發(fā)病率在46.371018.9310萬之間。Ø 近20年痢疾發(fā)病率在法定傳染病中由第一位降至第三位，但在衛(wèi)生狀況

2、不良的地區(qū)，發(fā)病率仍居高不下。Ø 人群對細菌性痢疾普遍易感，各年齡組均可受到感染，5歲以下兒童發(fā)病率最高。Ø 據(jù)估計，在臨床就診的腹瀉病人中的5%15%是志賀菌引起的，而因腹瀉死亡病例中有75%是志賀菌感染造成的。Ø 發(fā)展中國家福氏志賀菌最常見，發(fā)達國家以宋內(nèi)志賀菌為主。美國宋內(nèi)志賀菌>75%，但在男-男性行為人群仍以福氏志賀菌常見。Ø 鮑氏志賀菌最先在印度發(fā)現(xiàn)，除印度次大陸地區(qū)較為常見外，其它地區(qū)較為少見。Ø 細菌性痢疾發(fā)病有明顯的季節(jié)性，發(fā)病高峰為夏秋季，通常在79月份。 細菌性痢疾防治仍需探索、研究內(nèi)容：Ø 細菌性痢疾在不

3、同地區(qū)、不同人群的發(fā)病強度、分布特征、病原學特點缺乏全面、準確的數(shù)據(jù)；Ø 缺乏快速、簡便的病原學診斷方法，細菌性痢疾漏診和誤診現(xiàn)象普遍；Ø 志賀菌耐藥性譜的不斷擴大，細菌性痢疾抗菌治療難度加大；Ø 洗手、母乳喂養(yǎng)、安全飲水、糞便無害化處理等行之有效的干預措施的落實需要強化；Ø 目前所用痢疾菌苗免疫保護效果仍需進一步評價。第二節(jié) 病 原 學一、抗原分類 志賀菌屬細菌有菌體（O）抗原，某些新分離菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌體（O）抗原1.型特異性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分 A、B、C、D 4個群及35個抗原型。2.群特異性抗原：光滑型菌株次要抗

4、原，主要存在于B群，籍此將菌型分為多種亞型。(二)表面(K)抗原Ø 常在新分離的A、C、D群各血清型及B群的2a型、6型細菌中出現(xiàn)。Ø K抗原存在時，可阻止菌體抗原與相應免疫血清發(fā)生凝集；需經(jīng)10030分鐘加熱破壞后露出菌體抗原，與相應的免疫血清發(fā)生凝集。二、血清分群(一)A群(志賀痢疾桿菌):有12個血清型;具有K抗原菌株可阻礙O抗原的凝集;在我國常見的為2型(又稱司密斯桿菌)，1型較少見，其余各型更為罕見。(二)B群（福氏痢疾桿菌）Ø 具有型、群抗原；型抗原存在于同型菌株中；群抗原有多種，存在于B群各菌型中。Ø 近年1C（I:7）、2b（:3,4;7

5、）、3c（:6）、4c（:7,8）及4型（:-）等新型菌株出現(xiàn)。Ø 目前有6個血清型，（14個亞型及2個變種)。(三)C群(鮑氏痢疾桿菌):18個血清型。(四)D群(宋內(nèi)痢疾桿菌):僅一個血清型(、相);相(光滑型菌落)多從急性期感染病人標本中分離;相亦稱R型(粗糙型菌落)常從慢性患者或帶菌者檢出。三、屬間抗原關系 志賀菌屬與埃希菌屬的O抗原關系非常密切，有近半數(shù)的菌型與大腸埃希氏菌的某些O抗原完全相同；相同抗原菌屬間存在血清交叉凝集反應。表1 志賀菌屬與大腸埃希菌的O抗原關系 O抗原完全相同O抗原部分相同志賀菌屬大腸埃希菌志賀菌屬大腸埃希菌志賀菌屬大腸埃希菌A2 112ac A1

6、1,120C1 2,(50)A3 124 A2149C2 87ab,96A4 3588-51 A3 164C3 85A5 58 A4 88,159C4 149A12 152 A6 130C6 76B2b 147ab A7 121C9 102B3a 5444-80 A8 38,23C10 105acB4b 135 A9 144C12 7B5 129 A11 29C13 28ac,98C1 149 A12 3C15 83C4 53 B群1,2,13,16,1719,6269,73,3438-51C16 47C5 79C17 124C7 4838-69C1829,可能C8 143 

7、0;  C11 105ab    C14 32    Cl5 112ab    注： D群宋內(nèi)菌與類志賀鄰單胞菌O17抗原相同。四、菌群分布與變遷Ø 菌群分布與變遷因國家、地區(qū)、年份不同而異。Ø 40年代前A群是優(yōu)勢流行菌,60年代初幾乎銷聲匿跡，但1969-1970年突然在中美地區(qū)暴發(fā)，1972-1978年又在南亞的孟加拉國連年發(fā)生流行，繼之印度、斯里蘭卡、馬爾代夫、尼泊爾、不丹、緬甸、泰國等地區(qū)和國家受到侵襲。Ø D群從6

8、0年代起在許多工業(yè)發(fā)達國家躍居首位。Ø 國內(nèi)過去流行菌型為2a為主;近年來4、4c、5b、1a等菌型呈上升趨勢；城市D群為上升態(tài)勢。Ø 我國個別地區(qū)發(fā)現(xiàn)A1型和C18型局部暴發(fā)流行。五、溶原性Ø 噬菌體對相應的細菌具有特異性裂解作用,溫和噬菌體DNA侵入宿主細胞后，整合于宿主細胞的染色體DNA上，稱為前噬菌體；Ø 前噬菌體與宿主細胞的染色體同時復制，這個過程稱為溶原化；Ø 被感染的細菌稱為溶原性細菌。Ø 溶原性細菌對于相同的噬菌體具有免疫力，并獲得一些新的性狀，稱為溶原性轉換。 該轉換可導致福氏志賀菌型抗原和群抗原發(fā)生廣泛的變異。六、

9、變異性 (一) S-R變異Ø 志賀菌屬菌落可由光滑型變異成為粗糙型(S-R變異)，并常伴有生化反應、抗原構造和致病性的變異。Ø 在慢性痢疾病人或恢復期病人體內(nèi)，菌株可變異成為不典型菌株。部分變異菌株可通過10的膽汁肉湯培養(yǎng)發(fā)生返祖，成為典型菌株。因而在分離這類細菌時注意要反復多次地檢查。(二) 抗原變異(溶原性轉換)Ø 根據(jù)溶原性轉換變種和細胞壁多糖免疫化學分析,福氏志賀菌除 6型菌外其它型、亞型以及變種都是由一個種所產(chǎn)生的許多溶原性的變種。Ø y變種是非溶原性的前體型，當被六種不同的噬菌體溶原化后， 可以變?yōu)楦餍透Ｊ暇腶亞型或x變種，這是第一次溶原化

10、；Ø 一次溶原化的培養(yǎng)物，還可以發(fā)生第二次溶原化，變?yōu)楦餍透Ｊ暇腷亞型。Ø 福氏型特異性抗原、和群7,8抗原，均以y變種群3,4抗原多糖為前體型，經(jīng)溫和噬菌體溶原性轉換而來。Ø 噬菌體()7,8溶原化的結果是使群7,8抗原變?yōu)閤變種，同時群3,4抗原成為隱蔽狀態(tài)；Ø 前體型經(jīng)、溶原化結果，則是相應型抗原的產(chǎn)生，分別變?yōu)?a、5a、1a、4a等型。其中x變種、2a型和5a型還可以經(jīng)第二次的溶原化，變?yōu)?b型和5b型。Ø 群6抗原是群4抗原乙?；?6溶原性轉換）所致；型抗原為群3,4復合抗原乙?；慕Y果。福氏1a型和4a型的群4抗原乙?；蟪霈F(xiàn)

11、群6抗原，變?yōu)?b型和4b型，但此時型抗原成為隱蔽狀態(tài),僅當型抗原、消失時顯現(xiàn)。Ø 宋內(nèi)志賀菌相抗原受控于一個140Mda大質(zhì)粒，若質(zhì)粒丟失，相抗原不能合成，菌則從相轉變?yōu)橄唷?三) 毒力變異 志賀菌的2型腸毒素（ShET-2）、粘附性、侵襲力、胞內(nèi)繁殖、細胞間擴散等活性編碼基因均存在于一個140Mda的質(zhì)粒上，其表達受染色體上多個基因的調(diào)控。該調(diào)控基因的變異或大質(zhì)粒的丟失，均可造成毒菌株的毒力減弱或消失。 七、致病性(一)侵襲力：菌毛-有利于菌粘附至腸粘膜(二)毒 素： 通透性增加內(nèi)毒素 局部 作用于腸壁 粘膜炎癥、潰瘍 全身 內(nèi)毒素血癥外毒素（A群1型） 與內(nèi)毒素協(xié)同作用 加重局

12、部和全身癥狀Ø 志賀菌具有抗酸性，能順利通過胃酸屏障進入腸道，侵襲于結腸粘膜上皮細胞，引起炎癥反應。Ø 有研究表明最小感染劑量為10個CFU。Ø 產(chǎn)生的SHET1腸毒素是染色體編碼毒素，主要見于福氏志賀菌；SHET2是質(zhì)粒編碼毒素，志賀菌和侵襲性大腸桿菌均能產(chǎn)生。Ø 痢疾志賀菌可產(chǎn)生志賀毒素（ST），為染色體編碼，由1個A亞單位和5個B亞單位構成，具有腸毒性、細胞毒性和神經(jīng)毒性。第三節(jié) 實驗室分離一、標本的采集和運送(一) 標本的采集 腹瀉病人糞便標本：Ø 監(jiān)測點人員發(fā)現(xiàn)疑似病人和腹瀉病人后，立即發(fā)給病人潔凈塑料袋，要求其接取自然排出的可疑糞便

13、部分立即送檢；Ø 嬰幼、兒童則讓其父母協(xié)助其坐排于罩有干凈塑料袋的痰盂內(nèi)(要求勿混入尿液)。Ø 用2個棉拭子分別在大便中可疑部分多點蘸取并旋轉棉拭子使全部蘸滿大便（約1-2克）。Ø 將綿拭子插入裝有Cary-Blair運送培養(yǎng)基的采樣管中(注意培養(yǎng)基應埋住糞便拭子)，手接觸的棉簽尾部在管口處折斷丟棄。Ø 編號后將采樣管置4冰箱或冷藏包中保存。Ø 認真填寫腹瀉病人糞便采樣表。 監(jiān)測點/村醫(yī)需配備和更換的監(jiān)測材料:Ø 腹瀉病人糞便采樣登記表。Ø 消毒棉簽。Ø 裝有Cary-Blair運送培養(yǎng)基的采樣管(4保存可備用半年

14、)。Ø 采便塑料袋。Ø 冷藏包(應每日更換冰排) 。(二) 標本的運送Ø 采集標本后應立即通知監(jiān)測點運送標本人員，或每天分中午、下午兩次送交實驗室。Ø 如當天晚上采集，最長保存時間最好是48小時內(nèi)。二、實驗室分離技術(一)選擇分離培養(yǎng)基Ø 直接劃線分離于麥康凱（MAC）及木糖賴氨酸去氧膽酸鈉(XLD)，也可選志賀-沙門菌瓊脂(SS) 、去氧膽酸鈉硫化氫乳糖瓊脂(DHL)、去氧膽酸鈉檸檬酸鹽瓊脂(DCA)或?？祟D腸道瓊脂(HE)。Ø 但慎用SS，其可抑制志賀菌1型生長常造成漏檢。表2.志賀菌及大腸菌在選擇培養(yǎng)基上菌落生長特征選擇性培養(yǎng)基

15、志賀菌大腸埃希菌菌落顏色、形態(tài)菌落大小菌落顏色、形態(tài)菌落大小MAC無色、透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形23a，b粉紅或紅色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則34XLD粉紅或無色、透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形12a，c黃色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則23DCA無色、透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形23a粉紅色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則34HE綠色、透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形23a黃色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則34SS無色、透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形12d粉紅色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則23注：a：志賀痢疾菌1型菌落生長較??； b：不含結晶

16、紫的市售培養(yǎng)基干粉不適 于志賀菌屬的選擇分離；c：志賀痢疾菌1型在XLD上生長菌落非常細??； d：志賀痢疾菌1型常被抑制生長。木糖賴氨酸去氧膽酸鈉瓊脂（XLD)：木糖；賴氨酸5g；乳糖7.5g；蔗糖7.5g；去氧膽酸鈉2.5g；硫代硫酸鈉6.8g；檸檬酸鐵銨；酚紅。去氧膽酸鈉檸檬酸鹽瓊脂（DCA）:乳糖10g；去氧膽酸鈉1g；檸檬酸鐵1g；中性紅0.03g。 (二)病原分離Ø 用接種環(huán)多點沾取糞便標本中可疑部分,或用采樣拭子涂種，直接劃線分離選擇瓊脂平板各一塊（見示意圖4）；Ø 36培養(yǎng)1824小時。如無菌生長或接種過密應重新分離平板（可取菌苔處）（合格的分離平板菌落數(shù)&g

17、t;150個）。圖4 采樣拭子接種平板及劃線分離方法示意圖(三) 菌落生長特性Ø 志賀菌屬是需氧或兼性厭氧桿菌。Ø 經(jīng)37培養(yǎng)1824小時，形成圓形、稍凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、無色、半透明、直徑約2mm的較小菌落；Ø 相對宋內(nèi)菌的生長菌落較大、扁平，較不透明，易出現(xiàn)粗糙型菌落。Ø 志賀痢疾桿菌1型的營養(yǎng)需求比較高，必須補給15種氨基酸方能生長。(四) 生化初篩1.可疑菌落的觀察和挑選：Ø 許多細菌在選擇性培養(yǎng)基上被抑制，既不發(fā)育也未死亡，有的能長出肉眼看不見的小菌落。Ø 因而在觀察、挑取可疑菌落時應用接種針挑取菌落中心，避免接

18、觸培養(yǎng)基表面以造成污染。2.接種生化反應管：Ø 從選擇培養(yǎng)平板上挑取可疑菌落3-5個，用接種針挑取菌落中心，分別接種KIA和MIU；Ø 先接種KIA(將接種針在其斜面上劃直線，隨之插入底層,取出后再在斜面上劃密集的橫線)，不經(jīng)火焰直接穿刺接種MIU培養(yǎng)基；Ø 置36±1培養(yǎng)1620小時后觀察結果。3.生化反應鑒別：Ø KIA：斜面黃(分解乳糖產(chǎn)酸)紅(不分解乳糖)； 底部紅(產(chǎn)堿,非發(fā)酵菌)黃(分解葡萄糖或乳糖)產(chǎn)氣產(chǎn)H2S；Ø MIU：動力(M)沿接種線周圍向外擴散生長呈現(xiàn)混濁者為陽性(用未接種MIU管對比觀察)。 吲哚(I)培養(yǎng)基

19、變紅為陽性。 尿素(U)加0.5mlKovacs試劑，數(shù)分鐘內(nèi)表層試劑變深紅色為陽性。 表3.用克氏雙糖(KIA) 和 動力-吲哚-尿素(MIU)生化反應 初步鑒別痢疾志賀菌與其它腸道菌 菌種名稱斜面底層H2S動力吲哚尿素氧化酶痢疾志賀菌(A群)KAD福氏痢疾菌(B群)KAD鮑氏痢疾菌(C群)KAD宋內(nèi)痢疾菌(D群)KA傷寒沙門菌KA+W+大腸堿性-殊異株KA+普羅菲登斯菌KA+摩根變形桿菌KADD+雷極變形桿菌KAD+小腸結腸炎耶氏菌KAVD+氣單胞菌屬KA-+鄰單胞菌屬KA+弧菌屬KA+愛德華氏菌屬K+哈夫尼亞菌屬DA+注：K堿性反應（紅色）；A產(chǎn)酸（黃色）；產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)氣；D不定（K或

20、A）；W = 弱或遲緩 反應； 某些福氏6型產(chǎn)氣；鮑氏痢疾菌血清13和14型產(chǎn)氣；侵襲性大腸菌無動力。4.注意事項：Ø KIA管最好用棉花塞,若用螺旋帽或硅膠塞，將蓋子擰松一些,使有足夠的氧氣促進反應;Ø MIU需用橡皮膠塞蓋緊，因尿素酶反應需避開氧氣。經(jīng)46小時培養(yǎng)可先觀察MIU管尿素酶反應，若為紅色多為變形桿菌；再經(jīng)36±1過夜培養(yǎng)后觀察反應結果。Ø 當KIA出現(xiàn)AA反應時，應檢查KIA管是否塞得過緊，若太緊應將塞子松一下后，放2-3小時再觀察一次。Ø 初篩中KIA底層不產(chǎn)氣不一定分解葡萄糖不產(chǎn)氣，應用帶倒管的單糖管復核。Ø KI

21、A斜面不產(chǎn)酸不一定是乳糖陰性，應用單糖管觀察14天才能確定陰性或遲發(fā)酵。Ø ONPG(半乳糖苷酶)試驗陽性是迅速判定乳糖遲發(fā)酵的可靠方法；乳糖陰性的菌株，除耶氏菌ONPG為陽性外，其余均為陰性。Ø 若KIA斜面為黃色(酸性)，則不宜做氧化酶試驗(因氧化酶可被酸性pH所抑制，出現(xiàn)假陰性反應),此種情況應將培養(yǎng)物轉種至不含糖的培養(yǎng)基上,待生長后再做氧化酶試驗。Ø 有時MIU培養(yǎng)基表層呈紅色，應檢查穿刺線是否插到底，若已穿刺到底，培養(yǎng)基一半以上變紅則判陽性。若穿刺到底僅表層變紅，可能是細菌在有氧條件下分解蛋白胨產(chǎn)堿變色，暫不能判為陽性，應繼續(xù)培養(yǎng)觀察。五、血清鑒定

22、16; 用生化初篩符合志賀菌反應的KIA管斜面菌苔，做志賀菌玻片凝集血清凝集；Ø 陽性者在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，挑單個菌落穿刺保存到半固體保存管Ø 詳細記錄試驗結果并填寫菌種登記表。(一)方法與步驟：1.挑取KIA生化反應符合痢疾菌的培養(yǎng)物，首先用四種多價血清做玻片凝集反應(4種多價包括：A群1、2型；B群和D群)。凝集者則用B群多價、D群和A1、A2、血清分別凝集，陽性者再選用相應的群多價或單價因子血清做凝集。若多價血清不凝集，可能為C群或A群的312型，應進行C群的四種多價和A群另三種多價血清做玻片凝集。 2.福氏多價血清凝集的菌株,可先用群3,4、6和7三種因子血清檢查

23、,根據(jù)因子血清凝集反應再依次選用可能的型因子血清做凝集。在群因子血清中凝集反應可能的血清型3，467+-1a，2a，2b，4a，5a，6，y+-1b，3b，4b+-+2b-+3a-+-3c-+1c，2b，4c，5b，x-4，63.最近幾年出現(xiàn)的新的血清型抗原式，目前世界上并沒有統(tǒng)一；分離較多的國家多沿用此抗原式。部分我們國家近年出現(xiàn)的。 抗原式血清型 :-4 :74c :63c :71c :3,4；72b4.若四種多價血清凝集,與相應的群血清均不凝集,且菌落較粗糙，應考慮宋內(nèi)相(R相)菌?？捎盟蝺?nèi)菌相（粗糙型）血清做凝集反應。5.每次均需要做鹽水凝集對照試驗；尤其當發(fā)現(xiàn)較脆或較粘稠的菌落時，鹽

24、水對照可排除自凝菌。6.屬于本地區(qū)未報道或極少見的志賀菌型，應慎重報告并送上一級實驗室或國家級實驗室復核確認。(二) 特別處理：一般通過血清學試驗，可鑒定到群、型或亞型，但遇到不典型志賀菌（與相應的血清不凝集或凝集不完全）時，可做如下處理：Ø 取可疑菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，3618小時培育后,挑取數(shù)個菌落做玻片凝集,如不凝繼續(xù)傳代，也可用瓊脂斜面與肉湯替換傳代，一般經(jīng)510代后，有些菌恢復其凝集力，否則可排除志賀菌。有些新鮮分離的培養(yǎng)物(A、C、D群各血清型及B群的2a型、6型)生化符合志賀菌反應，但與志賀菌屬診斷血清不發(fā)生凝集，應考慮可能存在K抗原而阻止分型血清與菌體O抗原發(fā)生凝

25、集，處理方法如下：Ø 取待檢菌純培養(yǎng)菌一滿接種環(huán)于0.51ml生理鹽水中制成濃厚菌液，置于100水浴中煮沸30分鐘，冷至室溫后再用診斷血清進行玻片凝集。(三) 交叉凝集反應：1. A3與動力+/-、產(chǎn)氣量少大腸菌存在交叉凝集；2. F1、F1c、F4、F4b與動力+/-、產(chǎn)氣量少的大腸菌存在交叉凝集；3. F4a與深紅沙雷菌存在交叉凝集；4. F4c、x變種與蜂房哈夫尼亞菌屬存在交叉凝集；5. C17與克雷伯菌屬存在交叉凝集；6. 宋內(nèi)I相菌株與類志賀鄰單胞菌存在交叉凝集，注意用氧化酶試驗加以鑒別。表6 福氏志賀菌型和亞型的型抗原和群抗原鑒別表型和亞型型抗原群因子血清凝集3，467，

26、81a1b1c2a2b（）3a3b3c44a4b4c5a5b6（）x變種y變種注：凝集；不凝集；（ ）個別菌株系陰性反應。六、鑒別試驗 Ø 雖然經(jīng)血清學證實、初步生化鑒定符合可基本定為志賀菌,但因部分志賀菌型與EIEC部分血清型有密切的抗原關系，而且EIEC同樣具有侵襲力(可使豚鼠角膜試驗陽性),因此需做相關鑒別試驗。表7 志賀菌屬與具有相關抗原的EIEC生化鑒別表鑒別菌型鑒別試驗甘露糖吲哚蔗糖乳糖動力EIEC O112ac:K66+/-/+-志賀2型（A2）-+-鮑氏1型（C1）+-鮑氏15型（C15）+-鑒別菌型鑒別試驗甘露糖吲哚醋酸鹽產(chǎn)氣動力EIEC O124:K72+(+)+/-+/-志賀3型（A3）-鮑氏17型（C17）+-鑒別菌型鑒別試驗甘露糖吲哚鳥氨酸產(chǎn)氣動力EIEC O136:K78+/-+/-志賀3型（A3）-鮑氏1型（C1）+-鑒別菌型鑒別試驗甘露糖吲哚粘液酸產(chǎn)氣動力EIEC O152:K+/-志賀12型（A12）-鑒別菌型鑒別試驗甘露糖吲哚醋酸鹽檸檬酸鹽動力EIEC O164: