植物蛋白酶提取純化工藝

1、植物蛋白酶提取純化工藝生物工程09-2班 陳福泉 學(xué)號：3090343214一、實驗?zāi)康?、了解植物蛋白酶常用的提取純化方法的基本原理和基本操作；2、掌握雙水相和反膠束萃取的原理和操作步驟；3、掌握蛋白質(zhì)含量和蛋白酶酶活的檢測方法二、實驗原理植物蛋白酶常用的提取純化方法有緩沖鹽溶液提取、初步純化的方法有有機溶劑 法、乙醇粉法、丙酮粉法、鹽析法、雙水相法、反膠束萃取法等以pH6.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為提取溶劑所得酶活力較高，最佳工藝 為：以pH6.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液25C提取2次，料液比1 ： 1;應(yīng)用硫酸鉉 鹽析及透析袋透析對粗酶液進行純化，粗酶液再以60咖酸鉉鹽析24

2、h,透析袋（14000）低溫透析12h,凍十；酶學(xué)性質(zhì)研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白為底物其最適pH值為6.0 , 30C保溫30min,酶活穩(wěn)定。三、實驗材料材料與試劑新鮮生姜、酪蛋白（化學(xué)純）、考馬斯亮藍G-250、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水 碳酸鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、硫酸鉉、丙酮等試劑均為分析純。0.01% （w/v）考馬斯亮藍 G-250溶液：將100mg考馬斯亮藍 G-250溶于50mL90%vol乙 醇中，加入85%磷酸100mL蒸僻水定容至1000mL0.5%酪蛋白溶液：稱取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸鈉溶液潤濕，再加少量 0.02 mol/L pH7.5 的磷

3、酸緩沖液稀釋，水浴中煮沸溶解，定容至 100mL四、實驗步驟方法一：生姜蛋白酶提取液制備：取定量新鮮生姜，切成小塊后加入10倍體積的 pH 6. 0, 0. 2 mol/ L磷酸緩沖液（4 e ）,于粉碎機中勻槳，8層紗布過濾后于4000rpm離心10 min,吸取上活液，加入高飽和度的（NH4） 2SO4液使鹽析體系中（NH4） 2SO4終飽和度為60% , 4000 rpm 離心15 min。收集上層不溶物，用少量pH 7. 50的 檸檬酸緩沖液溶解，在4e下對同種緩沖液透析8 h。透析液定容，即為生姜蛋白酶提 取液。方法二：生姜蛋白酶的提取 取外形完好、無機械損傷和腐爛、富含纖維的生姜，

4、 切成小塊，與磷酸緩沖液（0.03mol/L , pH7.5,內(nèi)含1 mmol/L EDTAffi 5mmol/L L-半胱 氨酸）按料液比1: 2打漿，所得漿液低速攪拌20mi n,攪拌過程中緩慢加入20% （m/v） 固體硫酸鉉，四層紗布過濾后，將姜汁 4C下靜置2h,離心（4 800rpm, 5min）去除沉淀，上活液用1.5倍的無水乙醇進行沉淀，再次離心去除上活液后收集沉淀（即粗酶）。生姜蛋白酶的反膠束萃?。涸谏鞍酌柑崛∫杭尤氲润w積的 AOT異辛烷陰離子反 膠束或CTAB庚烷/辛醇陽離子反膠束，用磁力攪拌器以200 rpm的速度進行攪拌510 min, 8000 rpm離心10 m

5、in,萃余液（下層）用考馬斯亮蘭法測定殘留生姜蛋白酶酶活 力和蛋白質(zhì)量。生姜蛋白酶的pI= 5. 4- 5. 5, 在pH 5. 4以上，用AOT異辛烷反膠束不能萃取 出生姜蛋白酶，但是卻可以萃取出71. 86%的雜蛋白。用CTAB庚烷/辛醇反膠束二次 萃取AOT異辛烷萃余液，其蛋白質(zhì)萃取率為60125%雙水相萃取將不同分子量的聚乙二醇和成相鹽按質(zhì)量比配制一系列不同濃度及pH的雙水相體系，每個雙水相體系改變一個參數(shù)。由于備用溶液黏度很高，為減少誤差， 各組分含量均以質(zhì)量分數(shù)（w）表示。加入一定量的聚乙二醇和下相鹽后用去離子水調(diào) 系統(tǒng)總質(zhì)量至20g。充分溶解后倒入60m l的分液漏斗中進行分相，

6、待分相完成后加入 3m l的生姜蛋白酶粗酶液。將分液漏斗封口，反復(fù)倒置23m i n，每分鐘1015次，將體系各組分充分混合均勻后，室溫下靜置分相2h,使體系上下相分離完全。資料表明，P E G-緩沖鹽雙水相萃取生姜蛋白酶的最佳萃取條件為：P E G分子量為4000, P E G濃度為20%，磷酸緩沖液的p H值為6.5 ,濃度為10%,生姜蛋白酶上 相酶活力回收R和純化倍數(shù)P F可達279.05%和1.86 生姜蛋白酶活力測定繪制標準曲線配制各取6支刻度試管，分別加入0. 4、0. 8、1.2、1.6、2. 0、2. 4 g牛血 活白蛋白2滴1:1 HCl,及3 mL考馬斯亮蘭G-250液，

7、室溫下顯色30 min后用蒸僻水 定容至10 mL,于595 nm下測定。匾5。以蛋白質(zhì)質(zhì)量為橫坐標，OD595為縱坐標繪制標 準曲線。其線性回歸方程為：Y= 01019X- 0. 001 。蛋白質(zhì)濃度測定取定量蛋白溶液，加入pH= 6. 0的磷酸緩沖液3 mL, 3 mL考馬斯亮蘭G-250液 及2滴1:1 HCl,室溫下顯色30 min后用蒸8留水定容至10 mL,于595 nm下測定OD95, 根據(jù)標準曲線或線性回歸方程計算蛋白質(zhì)含量。生姜蛋白酶活力各取0. 2 mol/ L 、pH= 6. 0的磷酸緩沖液3 mL,分別加入0. 2%牛血活白蛋白溶 液2 mL及1 mL生姜蛋白酶溶液，于

8、60 e下反應(yīng)15 min,反應(yīng)完成后 加入2滴1B1 HCl以終止反應(yīng)，對照則在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量1B1 HCl以阻止反應(yīng)發(fā)生。加入3 mL考馬斯亮蘭G- 250液顯色30分鐘后定容至10 mL分別 于分光光度計上測定 OD595以反應(yīng)前后OD595差表示生姜蛋白酶活力。以每分鐘內(nèi)每 mL蛋白酶提取液水解1 kg牛血活白蛋白為生姜蛋白酶的活力單位。生姜蛋白酶活力=（酶反應(yīng)液O底5-空白0園）/ mL 酶液 min- 1,即g牛血活白蛋白/ mL - min- 1。1. 安裝夾心式垂直板電泳槽：目前，夾心式垂直板電泳槽有很多型號，雖然設(shè)置略有 不同，但主要結(jié)構(gòu)相同，且操作簡單，不易

9、泄漏。同學(xué)們可根據(jù)具體不同型號要求進行 操作。主要注意：安裝前，膠條、玻板、槽子都要潔凈十燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。2. 配膠：根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度3. 制備凝膠板：（1）分離膠制備：按表配制20ml 10%分離膠，混勻后用細長頭滴管將凝膠液加至長、 短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸僻水，沿長玻璃板板壁緩慢 注入，約3 4mm高，以進行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界 線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸僻水，再用濾紙條吸去多余水分。（2）濃縮膠的制備：按表配制10ml 3淤縮膠，混勻后用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚 合的

10、分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處,輕輕將樣品槽棋板插入濃縮膠內(nèi)， 避免帶入氣泡。約30min后凝膠聚合，再放置20-30min。待凝膠凝固，小心拔去樣品 槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將 pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、 下貯槽中，應(yīng)沒過短板約0.5cm以上，即可準備加樣。4. 樣品處理及加樣各標準蛋白及待測蛋白都用樣品溶解液溶解，使?jié)舛葹?.51mg/mL沸水浴加熱3分鐘，冷卻至室溫備用。處理好的樣品液如經(jīng)長期存放，使用前應(yīng)在沸水浴中加熱1分鐘， 以消除業(yè)穩(wěn)態(tài)聚合。一般加樣體積為 1015 L （即210 g蛋白質(zhì)）。如樣品較稀， 可增加加樣體積。用微量

11、注射器小心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所 有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。5. 電泳將直流穩(wěn)壓電泳儀開關(guān)打開，開始時將電流調(diào)至10mA待樣品進入分離較時，將電流調(diào) 至20- 30 mA當藍色染料遷移至底部時，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。拔掉固定板， 取出玻璃板，用刀片輕輕將一塊玻璃撬開移去，在膠板一端切除一角作為標記，將膠板 移至大培養(yǎng)皿中染色。6. 染色及脫色將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色1h左右，用蒸僻水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋 白區(qū)帶活晰，即用直尺分別量取各條帶與凝膠頂端的距離。計算1. 相對遷移率mR胃羊品遷移距離（cn /染料遷移距離（cm）2. 以標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標準曲線，根據(jù)待測樣品相對遷 移率，從標準曲線上查出其分子量。五、注意事項1. 不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-S膠電泳法測定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測出的分子量是不可靠的。包括：電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的 蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1,它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響， 它的分子量是21,000,但SDS褫膠電泳測定的結(jié)果卻是 35,000。因此，最好至少用兩 種方法來測定未知樣