林業(yè)生物技術(shù)課件3.原生質(zhì)體技術(shù)

1、林林業(yè)業(yè)生物技生物技術(shù)課術(shù)課件件3.3.原生原生質(zhì)質(zhì)體技體技術(shù)術(shù)2原生質(zhì)體技術(shù)的具體方法步驟？原生質(zhì)體技術(shù)的具體方法步驟？什么是原生質(zhì)體？如何獲得？什么是原生質(zhì)體？如何獲得？思考與思考與討論討論31.原生質(zhì)體的研究概況原生質(zhì)體的研究概況原生質(zhì)體原生質(zhì)體(protoplast)(protoplast)：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。一個被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體亞原生質(zhì)體(subprotoplast)(subprotoplast)：在原生質(zhì)體分離過程中，：在原生質(zhì)體分離過程中，有時會引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生有時會引起細(xì)胞內(nèi)含

2、物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核或沒有細(xì)它可以具有細(xì)胞核或沒有細(xì)胞核。胞核。 核質(zhì)體核質(zhì)體(nuclearplast)(nuclearplast)：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì) 包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原 生質(zhì)體生質(zhì)體(miniprotoplast)(miniprotoplast)。 胞質(zhì)體（胞質(zhì)體（cytoplastcytoplast）：不含細(xì)胞核而僅含有部分）：不含細(xì)胞核而僅含有部分 細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。41.原生質(zhì)體的研究概況原生質(zhì)體的研究概況原

3、生質(zhì)體植物細(xì)胞核質(zhì)體胞質(zhì)體51.原生質(zhì)體的研究概況原生質(zhì)體的研究概況1 1、18631863年，年，HansteinHanstein首次起用原生質(zhì)體首次起用原生質(zhì)體(protoplast)(protoplast)一詞。一詞。2 2、18921892年，年，KlerckerKlercker用刀片細(xì)切植物組織機械分離用刀片細(xì)切植物組織機械分離出原生質(zhì)體。出原生質(zhì)體。3 3、19601960年，年，CockingCocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。體獲得成功。4 4、19711971年，年，Takebe et al.Takebe et al.首次得到煙草

4、葉肉原生質(zhì)首次得到煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。體培養(yǎng)的再生植株。5 5、19851985年，年，F(xiàn)ujimura et al.Fujimura et al.第一例禾谷類作物水第一例禾谷類作物水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。6 6、19861986年，年，Spangenberg et al.Spangenberg et al.單個原生質(zhì)體培養(yǎng)單個原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株在甘藍(lán)型油菜上獲得成功。再生植株在甘藍(lán)型油菜上獲得成功。 61.原生質(zhì)體的研究概況原生質(zhì)體的研究概況 據(jù)統(tǒng)計，目前已有據(jù)統(tǒng)計，目前已有49個科，個科，146個屬的個屬的320多種植物經(jīng)原多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到

5、了再生植株（生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株（1993）。其趨勢仍以）。其趨勢仍以農(nóng)作物和農(nóng)作物和經(jīng)濟作物為主經(jīng)濟作物為主，但從一年生向多年生、草本向木本、高等植，但從一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物擴展。物向低等植物擴展。 在果樹上，主要集中在柑橘上，在這方面華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園在果樹上，主要集中在柑橘上，在這方面華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園林學(xué)院作了比較多的工作，獲得了種間、屬間的體細(xì)胞雜種。林學(xué)院作了比較多的工作，獲得了種間、屬間的體細(xì)胞雜種。但這些體細(xì)胞雜種再生植株在生產(chǎn)上還沒有得到應(yīng)用但這些體細(xì)胞雜種再生植株在生產(chǎn)上還沒有得到應(yīng)用。 71.原生質(zhì)體的研究概況原生質(zhì)體的研究概況再生能力再生能力細(xì)胞分

6、化細(xì)胞分化個體（胚胎）個體（胚胎）發(fā)生發(fā)生器官發(fā)生器官發(fā)生原生質(zhì)體系原生質(zhì)體系統(tǒng)統(tǒng)外源外源DNA 體細(xì)體細(xì)胞遺胞遺傳學(xué)傳學(xué)細(xì)胞生細(xì)胞生理學(xué)理學(xué)細(xì)胞融細(xì)胞融合合細(xì)胞克細(xì)胞克隆隆意義意義：1、理論研究膜的、理論研究膜的結(jié)構(gòu)與功能。結(jié)構(gòu)與功能。2、體細(xì)胞融合克、體細(xì)胞融合克服遠(yuǎn)緣雜交障礙，服遠(yuǎn)緣雜交障礙，創(chuàng)造新物種。創(chuàng)造新物種。3、理想受體導(dǎo)入、理想受體導(dǎo)入外源外源DNA。82、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離基礎(chǔ)材料準(zhǔn)備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測定原生質(zhì)體收集與純化92、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離 迄今為止，從植物體的幾乎各個部位均有成功地分離出原生迄今為止，從植物體的幾乎各個部位均有成

7、功地分離出原生質(zhì)體的報道。如：幼根、下胚軸、子葉、葉片、莖的髓部、根質(zhì)體的報道。如：幼根、下胚軸、子葉、葉片、莖的髓部、根瘤、冠癭瘤、花瓣、花粉、果實組織以及由以上組織或細(xì)胞形瘤、冠癭瘤、花瓣、花粉、果實組織以及由以上組織或細(xì)胞形成的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等。成的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等。但是，不同的材料往往會造但是，不同的材料往往會造成游離的原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力有所不同，甚至?xí)绊懙狡浜蟮某捎坞x的原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力有所不同，甚至?xí)绊懙狡浜蟮呐囵B(yǎng)效果。因此，選擇適宜的材料是原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)成功培養(yǎng)效果。因此，選擇適宜的材料是原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)。的基礎(chǔ)。 葉片葉片 無菌無菌試試管苗葉

8、片管苗葉片 上胚上胚軸軸和子葉和子葉 培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)細(xì)胞胞常用的原生質(zhì)常用的原生質(zhì)體分離材料體分離材料102、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離 葉片葉片經(jīng)典材料經(jīng)典材料。 自從自從1971年年Takebe等利用煙草葉肉組織成功等利用煙草葉肉組織成功分離出原生質(zhì)體并使其再生植株以來，利用葉片分分離出原生質(zhì)體并使其再生植株以來，利用葉片分離原生質(zhì)體已被廣泛應(yīng)用。離原生質(zhì)體已被廣泛應(yīng)用。 一般可能認(rèn)為選取細(xì)胞分裂旺盛的生長點附一般可能認(rèn)為選取細(xì)胞分裂旺盛的生長點附近的嫩葉較為合適，近的嫩葉較為合適，但是，許多試驗結(jié)果表明，選但是，許多試驗結(jié)果表明，選用充分展開的成熟葉片或生理活性稍稍衰退的過熟用充分展

9、開的成熟葉片或生理活性稍稍衰退的過熟葉片，有利于原生質(zhì)體的分離及其后的培養(yǎng)。葉片，有利于原生質(zhì)體的分離及其后的培養(yǎng)。 處理：在葉片取材之前，通常先對供體植株進處理：在葉片取材之前，通常先對供體植株進行適當(dāng)?shù)母珊堤幚硎蛊涮幱谳p度的萎蔫狀態(tài)。也可行適當(dāng)?shù)母珊堤幚硎蛊涮幱谳p度的萎蔫狀態(tài)。也可以對離體葉片的切塊先進行質(zhì)壁分離，這樣分離原以對離體葉片的切塊先進行質(zhì)壁分離，這樣分離原生質(zhì)體的效果更好。生質(zhì)體的效果更好。112、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離 試管苗的子葉、胚軸以及培養(yǎng)的懸試管苗的子葉、胚軸以及培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞具有無菌、不受生長季節(jié)影響等浮細(xì)胞具有無菌、不受生長季節(jié)影響等特點。特點。 許多

10、試驗結(jié)果指出，利用試管苗作許多試驗結(jié)果指出，利用試管苗作為供體材料時，苗齡對分離原生質(zhì)體及為供體材料時，苗齡對分離原生質(zhì)體及其后培養(yǎng)的效果影響較大。另外，其后培養(yǎng)的效果影響較大。另外，培養(yǎng)培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，如果經(jīng)過多次的繼代培養(yǎng)，的懸浮細(xì)胞，如果經(jīng)過多次的繼代培養(yǎng)，常常會出現(xiàn)再生植株能力減退和遺傳上常常會出現(xiàn)再生植株能力減退和遺傳上的不穩(wěn)定性等現(xiàn)象。的不穩(wěn)定性等現(xiàn)象。 122、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離 材料預(yù)處理材料預(yù)處理對于某些植物非常重要。對于某些植物非常重要。 分離得到的原生質(zhì)體，其分離得到的原生質(zhì)體，其活力活力和和分裂頻率分裂頻率高低是影響原生高低是影響原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的質(zhì)體培

11、養(yǎng)成功的2 2個決定性的因素。個決定性的因素。 在游離原生質(zhì)體前對供體材料進行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可以在游離原生質(zhì)體前對供體材料進行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可以提高某些材料原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。提高某些材料原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。 用用黑暗黑暗處理、處理、低溫低溫處理和處理和不同光質(zhì)不同光質(zhì)照射等方法，可提高照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。理方法不同。 例如 龍膽試管苗的葉片只有用4低溫處理，甘蔗植株必須先在黑暗條件下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂。 132、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離目

12、的：目的：獲得大量完好、有活力的原生質(zhì)體。獲得大量完好、有活力的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體分離方法原生質(zhì)體分離方法機械分離法機械分離法酶解分離法酶解分離法 先將細(xì)胞放在高滲糖溶液先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微輕微質(zhì)壁分離質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機械法磨碎組球形后，再用機械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。用這種方法曾的原生質(zhì)體。用這種方法曾成功地分離出藻類原生體成功地分離出藻類原生體（Klercker,1892）。）。缺點：缺點：完整的原生質(zhì)體的完整的原生質(zhì)體的得率低，適應(yīng)的植物種類得率低，適應(yīng)的植物種類

13、有限。（基本不用）有限。（基本不用）機械分離法機械分離法142、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離 用相關(guān)酶，降解細(xì)胞之間的用相關(guān)酶，降解細(xì)胞之間的果膠質(zhì)果膠質(zhì)，使細(xì)胞分離開，使細(xì)胞分離開來，然后再降解來，然后再降解細(xì)胞壁細(xì)胞壁（纖維素和半纖維素），獲得（纖維素和半纖維素），獲得原生質(zhì)（原生質(zhì)（Cocking,1960）。）。 常用的酶制劑有：果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶常用的酶制劑有：果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶 優(yōu)點：優(yōu)點：獲得大量的原生質(zhì)體，不受植物種類的限制。獲得大量的原生質(zhì)體，不受植物種類的限制。 缺點：缺點：這些酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物這些酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過

14、氧化物酶及酚類物質(zhì)。用酶降解細(xì)胞壁，會影響所獲原生質(zhì)酶及酚類物質(zhì)。用酶降解細(xì)胞壁，會影響所獲原生質(zhì)體的活力。體的活力。 是目前獲得原生質(zhì)體的主要方法。是目前獲得原生質(zhì)體的主要方法。酶解分離法酶解分離法152、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離酶混合液：酶混合液： 酶制劑酶制劑 + 滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑 + 無機鹽類無機鹽類 + 一些其一些其它化合物它化合物 調(diào)調(diào)pH值至值至5.6左右左右 過濾除菌過濾除菌（0.220.45m）酶混合液的用量約為酶混合液的用量約為10mL/g。 162、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離常用的商品化酶制劑常用的商品化酶制劑目前，國內(nèi)國際市場上常用的商品化酶制

15、劑主要有目前，國內(nèi)國際市場上常用的商品化酶制劑主要有以下幾種，它們各具特點，可根據(jù)植物材料的性質(zhì)以下幾種，它們各具特點，可根據(jù)植物材料的性質(zhì)單獨使用或搭配使用。單獨使用或搭配使用。 (一一)果膠酶果膠酶 用于降解植物細(xì)胞之間的果膠質(zhì)。常用于降解植物細(xì)胞之間的果膠質(zhì)。常用的有離析軟化酶（用的有離析軟化酶（Pectolyase Y-23）和離析酶）和離析酶（Macerozyme）。）。Pectolyase Y-23的活性較高，的活性較高，通常用量為通常用量為0.1%0.5%。 Macerozyme 的活性稍的活性稍低，通常用量為低，通常用量為1%5%. 172、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離

16、(二二)纖維素酶纖維素酶 用于降解植物細(xì)胞壁中的纖維素。常用的用于降解植物細(xì)胞壁中的纖維素。常用的有有Cellulase Onozuka R-10和和Cellulase Onozuka RS。Cellulase Onozuka R-10幾乎為所有的游離原生質(zhì)體的研幾乎為所有的游離原生質(zhì)體的研究所采用，而究所采用，而Cellulase Onozuka RS的活性約等于的活性約等于Cellulase Onozuka R-10的的10倍。一般來說，酶的活性越倍。一般來說，酶的活性越高，它對植物細(xì)胞的毒害也越大，所以，用酶溶液處理的高，它對植物細(xì)胞的毒害也越大，所以，用酶溶液處理的時間必須相對縮短。時

17、間必須相對縮短。 (三三) 半纖維素酶半纖維素酶 用于降解植物細(xì)胞壁中的半纖維素。常用于降解植物細(xì)胞壁中的半纖維素。常用的有用的有Rhozyme HP-150，為加拿大和美國產(chǎn)，此酶主要，為加拿大和美國產(chǎn)，此酶主要用在那些細(xì)胞壁中具有半纖維素的植物種類。用在那些細(xì)胞壁中具有半纖維素的植物種類。 (四四) 崩潰酶（崩潰酶（Driselase），），是一種粗制酶，主要含纖維素是一種粗制酶，主要含纖維素酶，也含果膠酶，還混有蛋白酶和核酸酶。使用時應(yīng)注意酶，也含果膠酶，還混有蛋白酶和核酸酶。使用時應(yīng)注意濃度和處理時間。濃度和處理時間。182、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑

18、在配制酶液時，必須加入適量的在配制酶液時，必須加入適量的滲透壓穩(wěn)定滲透壓穩(wěn)定劑，以代替細(xì)胞壁對原生質(zhì)體所起的保護作用。劑，以代替細(xì)胞壁對原生質(zhì)體所起的保護作用。因為細(xì)胞壁一旦去除，裸露的原生質(zhì)體若處于低因為細(xì)胞壁一旦去除，裸露的原生質(zhì)體若處于低滲透壓的溶液中，就會立即破裂死亡。滲透壓的溶液中，就會立即破裂死亡。 甘露醇甘露醇和和山梨醇山梨醇等糖醇是最常用的滲透壓穩(wěn)等糖醇是最常用的滲透壓穩(wěn)定劑，有時也用葡萄糖。糖醇一般用于游離葉肉定劑，有時也用葡萄糖。糖醇一般用于游離葉肉等材料的原生質(zhì)體。葡萄糖則常用于游離懸浮細(xì)等材料的原生質(zhì)體。葡萄糖則常用于游離懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體。滲透壓穩(wěn)定劑的濃度因植物材料

19、胞的原生質(zhì)體。滲透壓穩(wěn)定劑的濃度因植物材料不同而異，一般為不同而異，一般為0.30.7mol/L。192、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離無機鹽類或其它化合物無機鹽類或其它化合物 在一些研究中，酶液中還加進一些無機鹽在一些研究中，酶液中還加進一些無機鹽類或其它化合物。如氯化鈣、磷酸二氫鉀、葡類或其它化合物。如氯化鈣、磷酸二氫鉀、葡聚硫酸鉀等。由于聚硫酸鉀等。由于它們可能對保護細(xì)胞膜有一它們可能對保護細(xì)胞膜有一定的作用，可提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性和活力，定的作用，可提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性和活力，防止其破裂。防止其破裂。202、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離酶法分離原生質(zhì)體的步驟酶法分離原生質(zhì)體的

20、步驟起始材料撕去下表皮反應(yīng)液轉(zhuǎn)綠反應(yīng)液轉(zhuǎn)綠是酶解成功的重要指標(biāo)，說明已有不少原生質(zhì)體游離出來。經(jīng)鏡檢確認(rèn)后應(yīng)及時終止反應(yīng)，避免脆弱的原生質(zhì)體受到更多的損害。酶解（一步法一步法）混合酶液除菌后的葉片25-30葉片為例：葉片為例：混合酶液轉(zhuǎn)綠不時輕搖切塊放入混合酶液中2-4 h212、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離概念：概念：酶解液中，有完整的酶解液中，有完整的原生質(zhì)體、原生質(zhì)體、破碎的原生質(zhì)體、破碎的原生質(zhì)體、未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞器及其未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞器及其它碎片。它碎片。同時，還含有酶及同時，還含有酶及其它不利于原生質(zhì)體培養(yǎng)、其它不利于原生質(zhì)體培養(yǎng)、再生的再生的試劑試劑。 這些在原生質(zhì)體培

21、養(yǎng)中會這些在原生質(zhì)體培養(yǎng)中會引起干擾作用，必須清除，引起干擾作用，必須清除，這一過程稱為這一過程稱為純化。純化。即從酶解液中獲得純凈原生即從酶解液中獲得純凈原生質(zhì)體的過程。質(zhì)體的過程。方法：方法：先先濾除濾除組織碎片和殘組織碎片和殘渣，再以新的滲透壓穩(wěn)定劑渣，再以新的滲透壓穩(wěn)定劑或原生質(zhì)體培養(yǎng)基或原生質(zhì)體培養(yǎng)基離心洗滌離心洗滌2-4次。次。主要方法：主要方法： 漂浮法漂浮法、界面法界面法和和沉降法沉降法等。等。完整的原生質(zhì)體酶解液酶解液酶及其它試劑。破碎的原生質(zhì)體、未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞器及其它碎片222、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離 飄浮法飄浮法：常用的飄浮劑有蔗：常用的飄浮劑有蔗糖、糖、

22、PercollPercoll（珀可，聚乙（珀可，聚乙烯吡咯烷酮包被的烯吡咯烷酮包被的SIO2SIO2顆粒顆粒的無菌膠體懸液）、的無菌膠體懸液）、FicollFicoll（菲可（水溶性聚糖體）。（菲可（水溶性聚糖體）。采用漂浮法分離（第一次）形成的原生質(zhì)體帶原理原理：采用比原生質(zhì)體比重大的高滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面。：采用比原生質(zhì)體比重大的高滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面。方法：方法：1 1、 將含有原生質(zhì)體的酶液混勻，通過孔徑將含有原生質(zhì)體的酶液混勻，通過孔徑44-169 m44-169 m的篩網(wǎng)過濾（孔徑大小因的篩網(wǎng)過濾（孔徑大小因植物種類而異），除去組織碎片和殘渣。植物種類而異）

23、，除去組織碎片和殘渣。2 2、將濾液與高滲溶液混合，在、將濾液與高滲溶液混合，在900-4500r/min900-4500r/min下離心，棄上層碎片溶液，小心下離心，棄上層碎片溶液，小心吸取中層原生質(zhì)體。重復(fù)吸取中層原生質(zhì)體。重復(fù)2-32-3次。次。優(yōu)點優(yōu)點：可得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體。：可得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體。缺點缺點：由于高滲溶液對原生質(zhì)體常有破壞，因而完好的原生質(zhì)體少。：由于高滲溶液對原生質(zhì)體常有破壞，因而完好的原生質(zhì)體少。232、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離界面法：界面法：原理：原理：采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩相采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩

24、相的界面中。的界面中。優(yōu)點：優(yōu)點：可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時避免收可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時避免收集過程中原生質(zhì)體相互擠壓而破碎。集過程中原生質(zhì)體相互擠壓而破碎。酶解產(chǎn)物+原生質(zhì)體培養(yǎng)基(0.45mol/L甘露醇)0.45mol/L蔗糖400g，離心5min碎片帶（輕）原生體帶0.45mol/L蔗糖242、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離目測法目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動性確定：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動性確定原生質(zhì)體活力。原生質(zhì)體活力。FDAFDA法法：FDAFDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，不能（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，不能自由地穿

25、越細(xì)胞質(zhì)膜，自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DAFDA被酯酶裂解即被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)胞活性。胞活性。伊凡藍(lán)法伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使，細(xì)胞才能被染色，壞使，細(xì)胞才能被染色，因而可以通過細(xì)胞被染色與否因而可以通過細(xì)胞被染色與否確定活性。確定活性。 252、 、 原生原生質(zhì)質(zhì)體的分離體的分離影響原生質(zhì)體活力的因素影響原生質(zhì)體活力的因素

26、分離材料的分離材料的生理狀態(tài)生理狀態(tài)酶解條件酶解條件：酶活力和純度酶活力和純度濃度、酶解溫度、酶解濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓時間、酶溶液的滲透壓分離條件分離條件：純化方法、離心次數(shù)、離心速度、分離持純化方法、離心次數(shù)、離心速度、分離持續(xù)時間續(xù)時間環(huán)境條件環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響 263、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng) 無機鹽無機鹽大量元素濃度；大量元素濃度；MSMS或或B5B5中中NONO3 3和和NHNH4 4+ +的比例，應(yīng)適當(dāng)降低。的比例，應(yīng)適當(dāng)降低。CaCa2+2+濃度濃度高濃度有利于原生質(zhì)體或再生細(xì)胞的分裂。高濃度有利于原生

27、質(zhì)體或再生細(xì)胞的分裂。 有機成分有機成分維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 KM-8PKM-8P培養(yǎng)基（高國楠，培養(yǎng)基（高國楠，19751975）針對原生質(zhì)體的培養(yǎng)基。針對原生質(zhì)體的培養(yǎng)基。273、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng) 激素激素 常用的激素：常用的激素：NAANAA、IAAIAA、BABA與與2,4-D2,4-D 滲透壓滲透壓常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生質(zhì)體的滲透壓原則：原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)胞滲透壓等滲培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)

28、胞滲透壓等滲。 32.62.78.735.9051015202530354012細(xì)胞出芽率細(xì)胞分裂率 培養(yǎng)基糖醇變化對馬鈴薯原生質(zhì)體細(xì)胞分裂和出芽率的影響。培養(yǎng)基糖醇變化對馬鈴薯原生質(zhì)體細(xì)胞分裂和出芽率的影響。 1. 1. 在只含甘露醇、蔗糖和肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)在只含甘露醇、蔗糖和肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 7天；天；2. 2. 在含蔗糖、纖維二糖、葡萄糖和甘露醇、肌醇、木糖醇、山梨醇的培養(yǎng)基中培在含蔗糖、纖維二糖、葡萄糖和甘露醇、肌醇、木糖醇、山梨醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)養(yǎng)7 7天。天。 （引自周宇波等，2001）283、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng)293、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)液體

29、淺層培養(yǎng) 將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行培養(yǎng)。培養(yǎng)。 優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡單，對原生質(zhì)體的操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 缺點：缺點：是原生質(zhì)體分布不均勻，是原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進一步的生長和發(fā)育。象而影響其進一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個細(xì)胞此外，難以跟蹤觀察某一個細(xì)胞的發(fā)育情況。的發(fā)育情況。 原生質(zhì)體懸浮液（原生質(zhì)體原生質(zhì)體懸浮液（原生質(zhì)體+ +培養(yǎng)基培養(yǎng)基）30

30、3、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)固體平板培養(yǎng) 固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點的瓊固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點的瓊脂糖可在脂糖可在30 C左右融化與原生質(zhì)體混合而不影響左右融化與原生質(zhì)體混合而不影響原生質(zhì)體的生命活動。混合后的含有原生質(zhì)體的原生質(zhì)體的生命活動?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進行培養(yǎng)。 優(yōu)點：優(yōu)點：可以跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的發(fā)育情況，可以跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計原生質(zhì)體分裂頻率。易于統(tǒng)計原生質(zhì)體分裂頻率。 缺點：缺點：是操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時的溫度是操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時的

31、溫度掌握必需合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活掌握必需合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質(zhì)體不易力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質(zhì)體不易混合均勻?；旌暇鶆颉?13、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng)細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂與生長愈傷組織形成植株再生323、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng)細(xì)胞壁的再生細(xì)胞壁的再生 有活力的原生質(zhì)體在適宜的培養(yǎng)基上很快就能再生細(xì)胞壁，有活力的原生質(zhì)體在適宜的培養(yǎng)基上很快就能再生細(xì)胞壁，快的僅需快的僅需1010分鐘，多數(shù)植物在培養(yǎng)后分鐘，多數(shù)植物在培養(yǎng)后1010小時或更長時間小時或更長時間。 出芽出芽的現(xiàn)象：細(xì)胞壁形成不均勻。的現(xiàn)象：細(xì)胞壁形成不均勻

32、。 只有能形成只有能形成完好細(xì)胞壁完好細(xì)胞壁的再生細(xì)胞才能進入細(xì)胞分裂的階段。的再生細(xì)胞才能進入細(xì)胞分裂的階段。 細(xì)胞分裂和生長細(xì)胞分裂和生長 一般原生質(zhì)體培養(yǎng)一般原生質(zhì)體培養(yǎng)2 27 d7 d后開始第一次分裂，但開始第后開始第一次分裂，但開始第一次分裂的時間隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、一次分裂的時間隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。333、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng)愈傷組織形成愈傷組織形成 大多數(shù)情況下原生質(zhì)體培養(yǎng)大多數(shù)情況下原生質(zhì)體培養(yǎng)二周二周后，形成多細(xì)胞的細(xì)胞團，后，形成多細(xì)胞的細(xì)胞團，三

33、周后形成肉眼可見的小細(xì)胞克隆，大約六周后形成直徑三周后形成肉眼可見的小細(xì)胞克隆，大約六周后形成直徑1 1 mmmm的小愈傷組織。的小愈傷組織。 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)7 71010天后必需及時添加新鮮的天后必需及時添加新鮮的低滲培養(yǎng)基低滲培養(yǎng)基：1 1、提供營養(yǎng)，保持分裂；、提供營養(yǎng)，保持分裂；2 2、平衡滲透壓。、平衡滲透壓。植株再生植株再生 1 1、將原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上、將原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可一步成苗（器官和胚胎發(fā)生兩條途徑）?？梢徊匠擅纾ㄆ鞴俸团咛グl(fā)生兩條途徑）。 2 2、兩步成苗法兩步成苗法（更適合）：首先將愈傷組織培養(yǎng)于（更適合）

34、：首先將愈傷組織培養(yǎng)于含低含低濃度生長素濃度生長素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再將其轉(zhuǎn)移到分培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗。化培養(yǎng)基上分化成苗。343、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)過程原生質(zhì)體培養(yǎng)過程原生質(zhì)體原生質(zhì)體固體培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基上小愈傷組織小愈傷組織細(xì)胞團細(xì)胞團再生植株再生植株再分化再分化353、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的培養(yǎng)體的培養(yǎng) 基因型基因型 通過番茄與秘魯番茄有性雜交后對性狀分離的遺傳分析，通過番茄與秘魯番茄有性雜交后對性狀分離的遺傳分析，證明其愈傷組織的再生能力是證明其愈傷組織的再生能力是2 2個顯性基因所決定的個顯性基因所決定的(K

35、oornneef M et al.,1987)(Koornneef M et al.,1987)。ChengCheng和和Veilleux(1991)Veilleux(1991)對對芙薯芙薯(S. Phureja)(S. Phureja)原生質(zhì)體的培養(yǎng)能力也做過遺傳分析，原生質(zhì)體的培養(yǎng)能力也做過遺傳分析，并證明從原生質(zhì)體培養(yǎng)到形成愈傷組織是受并證明從原生質(zhì)體培養(yǎng)到形成愈傷組織是受2 2個獨立位點的個獨立位點的顯性基因顯性基因所控制所控制(Cheng et al., 1991)(Cheng et al., 1991)。培養(yǎng)成份培養(yǎng)成份CaCa2+ 2+ , , NHNH4+4+滲透穩(wěn)定劑滲透穩(wěn)定

36、劑培養(yǎng)密度培養(yǎng)密度：10105 5個個/ml/ml。低密度條件下，細(xì)胞代謝產(chǎn)物擴增到。低密度條件下，細(xì)胞代謝產(chǎn)物擴增到培養(yǎng)基中影響細(xì)胞內(nèi)濃度。培養(yǎng)基中影響細(xì)胞內(nèi)濃度。364、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合 374、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合PEG（聚乙二醇）融合、電融合（聚乙二醇）融合、電融合PEGPEG融合融合： PEGPEG的作用機理：的作用機理： KaoKao等認(rèn)為，由于等認(rèn)為，由于PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )分分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團的水、子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H H鍵，從而在原

37、生質(zhì)體之間鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連，進而促使形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連，進而促使原生質(zhì)體的融合；另外，原生質(zhì)體的融合；另外，PEGPEG能增加類脂膜的流動性，能增加類脂膜的流動性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 PEG PEG 誘導(dǎo)融合的特點：其誘導(dǎo)融合的特點：其優(yōu)點優(yōu)點是是融合成本低，勿需融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。種限制。 缺點：缺點：融合過程繁瑣，融合過程繁瑣，PEGPEG可能對細(xì)胞有毒害?？赡軐?/p>

38、細(xì)胞有毒害。384、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合 融合液融合液：CaClCaCl2 2 2H2H2 2O 8O 810mmol10mmol KH KH2 2POPO4 4 0.7mmol 0.7mmol 甘露醇或山梨醇甘露醇或山梨醇 0.50.51.0mol1.0mol pH 5.6 pH 5.6 誘導(dǎo)液誘導(dǎo)液：融合液融合液PEG 20PEG 204545 稀釋液稀釋液：A液（液（g/100ml）pH6.0B液（液（g/100ml）pH10.5葡萄糖葡萄糖 7.21甘氨酸甘氨酸 0.375CaCl2 2H2O 0.79NaOH 0.169394、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合P1P2P1 P

39、2混合靜止混合靜止1min.融融 合合融合液融合液加入加入PEG稀稀 釋釋洗洗 滌滌加入稀釋液加入稀釋液加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基培培 養(yǎng)養(yǎng)選選 擇擇404、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合PEG法原生法原生質(zhì)質(zhì)體體融合融合過過程：程：融合融合過程：過程：圖：圖：A B C D E F原生質(zhì)體位置：原生質(zhì)體位置：BI CI DI EI FIB C D E F B C D E F414、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合電融合法：電融合法： 原理原理：當(dāng)原生質(zhì)體以適當(dāng)?shù)娜芤簯腋』旌虾?，插入電：?dāng)原生質(zhì)體以適當(dāng)?shù)娜芤簯腋』旌虾螅迦腚姌O，接通一定的交變電場。在電場中，原生質(zhì)體極化后極，接通一定的交變電場。在電

40、場中，原生質(zhì)體極化后順著電場緊密接觸成順著電場緊密接觸成珍珠串狀珍珠串狀。此時瞬間施以適當(dāng)強度。此時瞬間施以適當(dāng)強度的電脈沖，則使原生質(zhì)體膜被擊穿而發(fā)生融合。的電脈沖，則使原生質(zhì)體膜被擊穿而發(fā)生融合。 與與PEGPEG融合比較，電融合有融合比較，電融合有三大優(yōu)點三大優(yōu)點： 不使用有毒害的試劑，作用條件溫和，不使用有毒害的試劑，作用條件溫和，不存在對不存在對細(xì)胞的毒害問題細(xì)胞的毒害問題； 融合基本上是同步發(fā)生，融合基本上是同步發(fā)生，融合效率高融合效率高； 融合技術(shù)融合技術(shù)操作簡便操作簡便。424、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合電融合儀的電融合儀的結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點： 交變電場部分交變電場部分 高頻

41、直流電擊部分。高頻直流電擊部分。434、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合a.未通未通電時電時， ，b. 在交流在交流電場電場中；中；c.給予給予高頻高頻直流脈沖直流脈沖444、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合 膜的融合膜的融合 細(xì)胞質(zhì)融合細(xì)胞質(zhì)融合: : 發(fā)生膜融合后的數(shù)小時發(fā)生膜融合后的數(shù)小時 核融合核融合: :融合可能發(fā)生在細(xì)胞間期，也可能發(fā)生融合可能發(fā)生在細(xì)胞間期，也可能發(fā)生在第一次同步分裂過程中在第一次同步分裂過程中 。454、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合由于融合的情況不同，可分為由于融合的情況不同，可分為“自體融合自體融合”和和“異體融合異體融合”兩大類。兩大類。自體融合自體融合u發(fā)生

42、在親本原生質(zhì)體自身，融合結(jié)果得到發(fā)生在親本原生質(zhì)體自身，融合結(jié)果得到“同核體同核體”。u由同核體再生的植株，其特性與親本之一由同核體再生的植株，其特性與親本之一相同。相同。464、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合異體融合異體融合由不同種的雙親原生質(zhì)體融合而得到由不同種的雙親原生質(zhì)體融合而得到“異核體異核體”。由于異核體融合形式不同，又分為不同類型。由于異核體融合形式不同，又分為不同類型。(1) 諧諧和的和的細(xì)細(xì)胞融合胞融合形成異源雙二倍體，并具有雙親全套染色體組，形成異源雙二倍體，并具有雙親全套染色體組，即雙親全套遺傳信息。即雙親全套遺傳信息。膜、質(zhì)、核均發(fā)生融合，然后同步分裂，最后形膜、質(zhì)、核

43、均發(fā)生融合，然后同步分裂，最后形成異源雙二倍體。成異源雙二倍體。這是最理想的融合。這是最理想的融合。474、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合 (2) 部分部分諧諧和的和的細(xì)細(xì)胞融合胞融合原生質(zhì)體融合時，雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，原生質(zhì)體融合時，雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，而這種排斥是非完全性的。而這種排斥是非完全性的。但仍可發(fā)生少量染色體組的重組，然后進入但仍可發(fā)生少量染色體組的重組，然后進入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株植株如大豆如大豆+煙草的體細(xì)胞雜種細(xì)胞和愈傷組織。煙草的體細(xì)胞雜種細(xì)胞和愈傷組織。484、原生、原生質(zhì)質(zhì)體的融合體的融合(3) 異胞

44、異胞質(zhì)質(zhì)體體細(xì)細(xì)胞融合胞融合除含本種之一的細(xì)胞核外，還含有異種的細(xì)除含本種之一的細(xì)胞核外，還含有異種的細(xì)胞質(zhì)，稱為異胞質(zhì)體，亦稱為胞質(zhì)，稱為異胞質(zhì)體，亦稱為“共質(zhì)體共質(zhì)體”。異胞質(zhì)體形成的原因是正常有核原生質(zhì)體與異胞質(zhì)體形成的原因是正常有核原生質(zhì)體與核丟失的核丟失的“亞原生質(zhì)體亞原生質(zhì)體”融合而成，或是異融合而成，或是異核體發(fā)育過程中，一方排斥掉另一方的細(xì)胞核體發(fā)育過程中，一方排斥掉另一方的細(xì)胞核而形成的異胞質(zhì)體。核而形成的異胞質(zhì)體。但是細(xì)胞質(zhì)是雙親的。但是細(xì)胞質(zhì)是雙親的。49(4) 嵌合嵌合細(xì)細(xì)胞融合胞融合不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融合和胞不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融合和胞質(zhì)融合后，尚未發(fā)生核融合。質(zhì)融合后，尚未發(fā)生核融合。雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細(xì)雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細(xì)胞壁，最終形成嵌合體植物。胞壁，最終形成嵌合體植物。4、原生、原生質(zhì)質(zhì)體