蛋白質(zhì)的分離純化

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化2n 發(fā)酵工程（細(xì)胞擴(kuò)增）34n 細(xì)胞工程56n 細(xì)胞工程 一些單細(xì)胞低等植物如單細(xì)胞藻類的大規(guī)模培養(yǎng)成為細(xì)胞工程的重要組成部分 獲得蛋白質(zhì)資源、營(yíng)養(yǎng)食品、精細(xì)化工產(chǎn)品等等78910111213141516溶解度溶解度鹽濃度鹽濃度Salting-out17脫水脫水脫水脫水脫水脫水帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）陰離子陰離子陽離子陽離子堿堿酸酸酸酸堿堿水化膜水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）18192021血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度飽和飽和析出析出析出析出222324252627282930

2、加壓的蛋白質(zhì)溶液濃縮的蛋白質(zhì)溶液含小分子的溶液313233 常用的層析方法凝膠過濾離子交換層析疏水層析反相層析親和層析3435類別類別 分離原理分離原理 基質(zhì)或載體基質(zhì)或載體吸附層析吸附層析 化學(xué)、物理吸附化學(xué)、物理吸附 硅膠、氧化鋁硅膠、氧化鋁 、羥基磷酸、羥基磷酸分配層析分配層析 兩溶劑相中的溶解效應(yīng)兩溶劑相中的溶解效應(yīng) 纖維素、硅藻土纖維素、硅藻土 、硅膠、硅膠凝膠層析凝膠層析 分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng) sepharose 、sephadex離子交換層析離子交換層析 離子基團(tuán)的交換反應(yīng)離子基團(tuán)的交換反應(yīng) 離子交換樹脂離子交換樹脂 、纖維素、纖維素、 葡聚糖葡聚糖親和層析親

3、和層析 分離物與配體之間有分離物與配體之間有 帶配基的帶配基的sepharose 特殊親和力特殊親和力 或或sephadex聚焦層析聚焦層析 等電點(diǎn)和離子交換作用等電點(diǎn)和離子交換作用 多緩沖交換劑（與帶有多種電多緩沖交換劑（與帶有多種電 荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的 sepharose 6B）36原理原理：以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┮晕絼┳鳛楣潭ㄏ?，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃?dòng)相。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑作流動(dòng)相。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動(dòng)相中的溶解度不同。層析時(shí)吸附的程度和在流動(dòng)相中的溶解度不同。層析時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相從固定相上流過時(shí)，各組分也就不同，

4、當(dāng)流動(dòng)相從固定相上流過時(shí)，各組分也就不同程度地被解吸，然后又再被吸附、再解吸再吸附程度地被解吸，然后又再被吸附、再解吸再吸附，從而以不同速度隨流動(dòng)相向前移動(dòng)。，從而以不同速度隨流動(dòng)相向前移動(dòng)。 載體載體 ： 硅膠硅膠 氧化鋁氧化鋁 羥基磷灰石羥基磷灰石37原理原理 （見后）（見后）基質(zhì)基質(zhì) 葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（sephadex） 瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用應(yīng)用 測(cè)定分子量測(cè)定分子量 脫鹽和濃縮脫鹽和濃縮 分離提純生物大分子分離提純生物大分子 除去熱原物質(zhì)除去熱原物質(zhì)383940用于凝膠過濾的凝膠有多種，基本結(jié)構(gòu)為內(nèi)部帶有孔洞的球狀顆粒。裝入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)，叫做凝膠

5、層析柱。待分離的混合物加在層析柱的上端，當(dāng)混合物向下移動(dòng)時(shí)，大分子不進(jìn)入凝膠的內(nèi)部孔洞，從凝膠顆粒之間移動(dòng)；而小分子不但在凝膠顆粒之間移動(dòng)，還會(huì)進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部孔洞，這樣，大分子先從層析柱底端流出，小分子晚流出。達(dá)到分離的目的。41 應(yīng)應(yīng)用用4243離子交換層析離子交換介質(zhì)是一些表面帶有電荷的顆粒，可以結(jié)合帶有異性電荷的離子。蛋白質(zhì)或核酸的分子，一般都帶有電荷，不同的蛋白質(zhì)或核酸，攜帶的電荷可能有差異，根據(jù)這些差異，進(jìn)行蛋白質(zhì)或核酸的分離。441.平衡階段平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4. 解吸附階段

6、：用梯度緩沖溶液洗脫，先解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌， 即可重復(fù)使用。即可重復(fù)使用。4512345原始緩沖溶原始緩沖溶液的反離子液的反離子46疏水層析疏水層析的介質(zhì)表面有疏水基團(tuán)，可與蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)結(jié)合，不同的蛋白質(zhì)分子結(jié)合的力量不同，也可實(shí)現(xiàn)混合物分離的目的。47484950加壓的蛋白質(zhì)溶液濃縮的蛋白質(zhì)溶液含小分子的溶液51類別類別 分離原理分離原理 基質(zhì)或載體基質(zhì)或載體吸附層析吸附層析 化學(xué)、物理吸附化學(xué)、物理吸附 硅膠、氧化鋁硅膠、氧化鋁

7、、羥基磷酸、羥基磷酸分配層析分配層析 兩溶劑相中的溶解效應(yīng)兩溶劑相中的溶解效應(yīng) 纖維素、硅藻土纖維素、硅藻土 、硅膠、硅膠凝膠層析凝膠層析 分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng) sepharose 、sephadex離子交換層析離子交換層析 離子基團(tuán)的交換反應(yīng)離子基團(tuán)的交換反應(yīng) 離子交換樹脂離子交換樹脂 、纖維素、纖維素、 葡聚糖葡聚糖親和層析親和層析 分離物與配體之間有分離物與配體之間有 帶配基的帶配基的sepharose 特殊親和力特殊親和力 或或sephadex聚焦層析聚焦層析 等電點(diǎn)和離子交換作用等電點(diǎn)和離子交換作用 多緩沖交換劑（與帶有多種電多緩沖交換劑（與帶有多種電 荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的 sepharose 6B）52原理原理：以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┮晕絼┳鳛楣潭ㄏ?，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃?dòng)相。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑作流動(dòng)相。由于各種物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動(dòng)相中的溶解度不同。層析時(shí)吸附的程度和在流動(dòng)相中的溶解度不同。層析時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相從固定相上流過時(shí)，各組分也就不同，當(dāng)流動(dòng)相從固定相