蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)PROTEOME：PROTEin與與genOME的雜合的雜合 蛋白質(zhì)組學(xué)是研究活細(xì)胞內(nèi)基因組編碼的全部蛋白質(zhì)功能的科學(xué)。它蛋白質(zhì)組學(xué)是研究活細(xì)胞內(nèi)基因組編碼的全部蛋白質(zhì)功能的科學(xué)。它是功能基因組學(xué)的是功能基因組學(xué)的 “中流砥柱中流砥柱”，是聯(lián)系基因組序列與細(xì)胞功能的重要學(xué)，是聯(lián)系基因組序列與細(xì)胞功能的重要學(xué)科?？啤?Proteome包括了一個(gè)基因組、一種生物或一種細(xì)胞包括了一個(gè)基因組、一種生物或一種細(xì)胞/組織所表達(dá)的全組織所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。套蛋白質(zhì)。 一門交叉學(xué)科一門交叉學(xué)科 物理學(xué)物理學(xué) 數(shù)學(xué)數(shù)學(xué) 化學(xué)化學(xué) 計(jì)算機(jī)科學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué) 生物信息學(xué)生物信息學(xué) 基

2、因組基因組 轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組 蛋白組蛋白組蛋白質(zhì)組學(xué)的概念蛋白質(zhì)組學(xué)的概念雙向電泳技術(shù)、計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)和雙向電泳技術(shù)、計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù) 被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)。被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)生物學(xué)問題的生物學(xué)問題的提出提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備樣品的制備蛋白樣品的蛋白樣品的IEF和和PAGE電泳分離電泳分離圖像掃描和初步分析圖像掃描和初步分析感興趣感興趣蛋白點(diǎn)蛋白點(diǎn)的切取的切取胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋

3、圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)鑒定差異蛋白質(zhì)鑒定差異蛋白質(zhì)其它實(shí)驗(yàn)的其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步蛋白信息的初步獲得獲得蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) 亞細(xì)胞定位亞細(xì)胞定位 相互作用相互作用技技術(shù)術(shù)路路線線生物信息學(xué)生物信息學(xué)分析分析細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎蛋白沉淀蛋白沉淀蛋白溶解蛋白溶解去除雜質(zhì)去除雜質(zhì)防止蛋白水解防止蛋白水解樣品制備樣品制備第一向電泳第一向電泳 IEFIEF等電聚焦等電聚焦第二向電泳第二向電泳SDS-PAGESDS-PAGE染色染色定量定量平衡平衡選擇膠條選擇膠條IPGIPG膠條

4、膠條重泡脹重泡脹電泳電泳選擇凝膠選擇凝膠灌膠灌膠將將IEFIEF膠條膠條移至第二向移至第二向電泳電泳圖像分析圖像分析圖像采集圖像采集斑點(diǎn)檢測(cè)斑點(diǎn)檢測(cè)背景消減背景消減凝膠匹配凝膠匹配數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析樣品制備樣品制備TCA/acetoneTCA/acetone法法 取1g植物葉片，液氮冷凍研磨，加5mL含0.2%DTT和20%TCA的冷丙酮溶液勻漿，放置于-20冰箱過夜。之后4下13000rpm離心30min，棄上清液，沉淀用含0.2%的丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20冰箱沉淀1h)。最后沉淀凍干，放于-80冰箱待用。 P PEG EG 分級(jí)沉淀法分級(jí)沉淀法：由于：由于PEGPEG分子在溶液中可

5、形成網(wǎng)分子在溶液中可形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與溶液中的蛋白質(zhì)分子發(fā)生空間排斥作用，狀結(jié)構(gòu)，與溶液中的蛋白質(zhì)分子發(fā)生空間排斥作用，使蛋白質(zhì)分子凝集、沉淀。蛋白質(zhì)的分子量越大，將使蛋白質(zhì)分子凝集、沉淀。蛋白質(zhì)的分子量越大，將蛋白沉淀所需的蛋白沉淀所需的PEGPEG濃度越??；濃度越小；PEGPEG的分子量越高，沉的分子量越高，沉淀蛋白所需的濃度越低。淀蛋白所需的濃度越低。樣品制備樣品制備聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）分級(jí)沉淀法）分級(jí)沉淀法 取黃瓜葉片2 g，液氮冷凍研磨，加入10 mL預(yù)冷的MgNP-40蛋白質(zhì)提取液，混勻，4 下13000 g 離心15 min，棄沉淀，上清液加入預(yù)冷的50 % (w/v

6、) PEG儲(chǔ)備液，使PEG終濃度為8 %，冰浴30 min，2000 g離心10 min，所得沉淀為F2；上清液繼續(xù)加入預(yù)冷的50 % PEG儲(chǔ)備液，使PEG終濃度分別為16 %，冰浴30 min，13000g離心15 min，所得沉淀為F3；上清液繼續(xù)加入預(yù)冷的50 %(wv) PEG儲(chǔ)備液，使PEG終濃度為24 %，冰浴30 min，13000g離心15 min，所得沉淀為F4；上清液加入4倍體積的TCA/丙酮溶液，4 下20000g離心15 min，得到的沉淀部分為F5，棄上清液。 所得的F1、 F2、F3、 F4、 F5分別用TCA丙酮溶液和80 % 丙酮溶液洗滌至色素完全去除，最后沉

7、淀凍干，放于-80 冰箱待用。消除蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)之間的相互作用，增強(qiáng)蛋白質(zhì)在其消除蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)之間的相互作用，增強(qiáng)蛋白質(zhì)在其pI值處的溶解性值處的溶解性。 兼性離子型去污劑：兼性離子型去污劑：CHAPS，濃度，濃度2-4%；SB3-10 、ASB-14 非離子型去污劑：非離子型去污劑：NP-40 和和Triton-X-100 陰離子型去污劑：陰離子型去污劑：SDS，濃度低于，濃度低于0.25%離液劑也稱變性劑，主要為尿素（也稱變性劑，主要為尿素（urea）和硫尿（）和硫尿（Thiourea），破），破壞蛋白分子間形成的氫鍵，防止由氫鍵引起的蛋白質(zhì)聚集及壞蛋白分子間形成的氫鍵，防止由氫鍵引起的

8、蛋白質(zhì)聚集及蛋白遷移中二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。蛋白遷移中二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。表面活性劑增加樣品溶解性的手段 代替鹽離子，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，吸附高濃度尿素代替鹽離子，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，吸附高濃度尿素在溶液中形成的氰酸鹽離子，在溶液中形成的氰酸鹽離子， 離心時(shí)還有助于核離心時(shí)還有助于核酸的沉淀。酸的沉淀。 IPG buffer3-10 或或 pH5-8和和pH8-10按按2: :1混合?；旌?。 還原劑 主要是斷裂蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸（主要是斷裂蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸（Cys）殘基之）殘基之間形成的二間形成的二 硫鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性。硫鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性。 -巰基乙醇巰基乙醇 DTT 濃度濃度20-100mm

9、ol/L TBP (非巰基還原劑，三丁基膦非巰基還原劑，三丁基膦)，濃度，濃度2mmol/L 載體兩性電解質(zhì)Reagent9.5M Urea, 2M Thiourea1% DTT, 2mM TBP4% CHAPS0.2% Carrier ampholytes0.25% Tween 2010mM PMSF10% Glycerol0.0002% Bromophenol blueddH2O裂解液蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)濃度檢測(cè) Bio-Rad RC DC Protein Assay Bio-Rad RC DC Protein Assay 微離心管檢測(cè)方法微離心管檢測(cè)方法 BradfordBradford

10、檢測(cè)法檢測(cè)法 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250G-250法法 LowryLowry檢測(cè)法檢測(cè)法+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 101-D Isoelectric Focusing Theory第一向等電聚焦操作步驟第一向等電聚焦操作步驟1.1. 從從-20-20冰箱取出保存的冰箱取出保存的IPGIPG預(yù)制膠條（預(yù)制膠條（7cm pH3-107cm pH3-10），），室溫放置室溫放置1010分鐘。分鐘。2. 2. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入

11、樣品。在槽兩端各。在槽兩端各1cm1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。3. 3. 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPGIPG膠條上的保護(hù)層。膠條上的保護(hù)層。IPG膠條的長度膠條的長度分析型的上樣量分析型的上樣量（銀或（銀或SYPRO Ruby染色）染色）制備型的上樣量制備型的上樣量（考馬斯亮藍(lán)染色）（考馬斯亮藍(lán)染色）7 cm10-100ug蛋白

12、蛋白200-500ug蛋白蛋白11cm50-200ug蛋白蛋白250-1,000ug蛋白蛋白17cm100-300ug蛋白蛋白1-3mg蛋白蛋白R(shí)eadyStripTM IPG膠條的長度膠條的長度上樣體積上樣體積7 cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul4. 4. 分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPGIPG膠條膠面朝下置于聚膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+ +）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊

13、密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。5. 5. 在每根膠條上覆蓋在每根膠條上覆蓋 2-3m2-3mL L 礦物油，防止膠條水化過程礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條

14、，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。6. 6. 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。7.7.聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第二向聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGESDS-PAGE電泳電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，否則將膠條置于樣品水化盤中，-70-70冰箱保存。冰箱保存。1 1、配好的尿素儲(chǔ)液必須馬上使用，或用、配好的尿素儲(chǔ)液必須馬上使用，或用mixed-bedmixed-bed離子離子交換樹脂，清除長時(shí)間放置時(shí)尿素溶液中形成的氰酸鹽交換樹脂，清除長時(shí)間放置時(shí)尿素溶液中形成的氰酸鹽，預(yù)防蛋

15、白質(zhì)的甲?；?。，預(yù)防蛋白質(zhì)的甲?；?。2 2、將水化上樣緩沖液分裝后再儲(chǔ)存于、將水化上樣緩沖液分裝后再儲(chǔ)存于-20-20。用時(shí)，只。用時(shí)，只要解凍需要量，其余繼續(xù)儲(chǔ)存。水化上樣緩沖液一旦溶要解凍需要量，其余繼續(xù)儲(chǔ)存。水化上樣緩沖液一旦溶解不能再冷凍。解不能再冷凍。3 3、將水化上樣緩沖液加入蛋白樣品中，終溶液中、將水化上樣緩沖液加入蛋白樣品中，終溶液中ureaurea的的濃度需濃度需6.5M6.5M。4 4、等電聚焦溶脹緩沖液和樣品溶液中都要加入兩性電解、等電聚焦溶脹緩沖液和樣品溶液中都要加入兩性電解質(zhì)，它能夠幫助蛋白質(zhì)溶解。質(zhì)，它能夠幫助蛋白質(zhì)溶解。等電聚焦注意事項(xiàng)等電聚焦注意事項(xiàng)5 5、膠條

16、最少需要經(jīng)過、膠條最少需要經(jīng)過1111小時(shí)的溶脹。即使看上去所有的小時(shí)的溶脹。即使看上去所有的緩沖液都已經(jīng)被吸收，也一定要確保膠條在槽中溶脹充分緩沖液都已經(jīng)被吸收，也一定要確保膠條在槽中溶脹充分的時(shí)間。只有在的時(shí)間。只有在IPGIPG凝膠的孔徑已經(jīng)溶脹充分后，才可以吸凝膠的孔徑已經(jīng)溶脹充分后，才可以吸收大分子量蛋白質(zhì)，否則大分子量蛋白質(zhì)無法進(jìn)入膠條。收大分子量蛋白質(zhì)，否則大分子量蛋白質(zhì)無法進(jìn)入膠條。 6 6、如果在等電聚焦過程中，聚焦盤中還有很多的溶液沒、如果在等電聚焦過程中，聚焦盤中還有很多的溶液沒有被吸收，留在膠條的外面，這樣就會(huì)在膠條的表面形成有被吸收，留在膠條的外面，這樣就會(huì)在膠條的表

17、面形成并聯(lián)的電流通路，而在這層溶液中蛋白質(zhì)不會(huì)被聚焦。這并聯(lián)的電流通路，而在這層溶液中蛋白質(zhì)不會(huì)被聚焦。這就會(huì)導(dǎo)致蛋白的丟失或是圖像拖尾。為了減少形成并聯(lián)電就會(huì)導(dǎo)致蛋白的丟失或是圖像拖尾。為了減少形成并聯(lián)電流通路的可能性，可以先將膠條在溶脹盒中進(jìn)行溶脹，然流通路的可能性，可以先將膠條在溶脹盒中進(jìn)行溶脹，然后再將溶脹好的膠條轉(zhuǎn)移到聚焦盤中。在轉(zhuǎn)移過程中，要后再將溶脹好的膠條轉(zhuǎn)移到聚焦盤中。在轉(zhuǎn)移過程中，要用濕潤的濾紙仔細(xì)地從膠條上吸干多余的液體。用濕潤的濾紙仔細(xì)地從膠條上吸干多余的液體。 等電聚焦注意事項(xiàng)等電聚焦注意事項(xiàng)7 7、帶上手套用鑷子去除、帶上手套用鑷子去除IPGIPG膠條上的保護(hù)層。將

18、膠條上的保護(hù)層。將IPGIPG膠條仔細(xì)的置于溶膠條仔細(xì)的置于溶脹緩沖液上，膠面朝下，確保整個(gè)膠面都能被浸濕。脹緩沖液上，膠面朝下，確保整個(gè)膠面都能被浸濕。8 8、在樣品溶液中加入痕量的溴酚藍(lán)對(duì)觀察溶脹過程很有幫助。在覆蓋、在樣品溶液中加入痕量的溴酚藍(lán)對(duì)觀察溶脹過程很有幫助。在覆蓋礦物油之前，可以讓膠條先吸收礦物油之前，可以讓膠條先吸收1 1小時(shí)的液體。小時(shí)的液體。IPGIPG膠條上一定要覆蓋礦膠條上一定要覆蓋礦物油，否則緩沖液會(huì)蒸發(fā)，使得溶液濃縮，導(dǎo)致尿素沉淀。作為防止緩沖物油，否則緩沖液會(huì)蒸發(fā)，使得溶液濃縮，導(dǎo)致尿素沉淀。作為防止緩沖液蒸發(fā)的預(yù)防措施，礦物油必須緩緩地加在每個(gè)槽內(nèi)，確保完全的

19、覆蓋住液蒸發(fā)的預(yù)防措施，礦物油必須緩緩地加在每個(gè)槽內(nèi)，確保完全的覆蓋住每一根膠條。每一根膠條。9 9、不同的樣品需要的、不同的樣品需要的volt-hoursvolt-hours不同。當(dāng)聚焦過程無法達(dá)到最高電壓不同。當(dāng)聚焦過程無法達(dá)到最高電壓時(shí)，只要最后能達(dá)到總的時(shí)，只要最后能達(dá)到總的volt-hoursvolt-hours，且，且7cm7cm膠條電壓不低于膠條電壓不低于30003000伏，伏，11cm11cm膠條電壓不低于膠條電壓不低于50005000伏，伏，17cm17cm膠條電壓不低于膠條電壓不低于70007000伏，也能對(duì)樣品伏，也能對(duì)樣品進(jìn)行充分的聚焦。進(jìn)行充分的聚焦。等電聚焦注意事項(xiàng)

20、等電聚焦注意事項(xiàng)1010、為使樣品進(jìn)入膠的效率增加，采用、為使樣品進(jìn)入膠的效率增加，采用50V50V低電壓溶脹；繼續(xù)以低電低電壓溶脹；繼續(xù)以低電壓梯度（壓梯度（200V200V，500V500V，1000V1000V各一個(gè)小時(shí)）進(jìn)行電泳，最后達(dá)到各一個(gè)小時(shí)）進(jìn)行電泳，最后達(dá)到10000V10000V進(jìn)行聚焦。進(jìn)行聚焦。1111、處理預(yù)制、處理預(yù)制IPGIPG膠條時(shí)，一定要始終帶著手套。注意預(yù)防角蛋白污膠條時(shí)，一定要始終帶著手套。注意預(yù)防角蛋白污染。染。1212、水化上樣緩沖液的成分由不同的樣品決定。、水化上樣緩沖液的成分由不同的樣品決定。1313、每根膠條蛋白質(zhì)的總上樣量由特定的樣品，膠條的、

21、每根膠條蛋白質(zhì)的總上樣量由特定的樣品，膠條的pHpH范圍，及最范圍，及最終的檢測(cè)方式?jīng)Q定。終的檢測(cè)方式?jīng)Q定。1414、所有含尿素的溶液加熱溫度不超過、所有含尿素的溶液加熱溫度不超過3030，否則會(huì)發(fā)生蛋白氨甲酰，否則會(huì)發(fā)生蛋白氨甲?；?，使蛋白質(zhì)化，使蛋白質(zhì)pIpI值偏移。值偏移。等電聚焦注意事項(xiàng)等電聚焦注意事項(xiàng)1515、主動(dòng)水化過程，會(huì)幫助大分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)入膠條，但會(huì)丟失部、主動(dòng)水化過程，會(huì)幫助大分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)入膠條，但會(huì)丟失部分小分子量蛋白。分小分子量蛋白。1616、當(dāng)樣品中含鹽量較高時(shí)，建議選用慢速升壓。當(dāng)樣品中含鹽量一、當(dāng)樣品中含鹽量較高時(shí)，建議選用慢速升壓。當(dāng)樣品中含鹽量一般時(shí)，選

22、用線性升壓。當(dāng)樣品中含鹽量很少時(shí)，可以選用快速升壓，這般時(shí)，選用線性升壓。當(dāng)樣品中含鹽量很少時(shí)，可以選用快速升壓，這樣可以節(jié)省聚焦時(shí)間。樣可以節(jié)省聚焦時(shí)間。1717、雖然儀器中每根膠條的極限電流可以設(shè)為、雖然儀器中每根膠條的極限電流可以設(shè)為9999 A/A/根。但一般根。但一般7cm7cm膠膠條的極限電流不超過條的極限電流不超過3030 A/A/根，根，17cm17cm膠條的極限電流不超過膠條的極限電流不超過5050 A/A/根，最根，最好也在好也在3030 A/A/根以下。根以下。1818、可以在聚焦盤的兩端電極處搭上鹽橋，這可以幫助除鹽。但需注、可以在聚焦盤的兩端電極處搭上鹽橋，這可以幫助

23、除鹽。但需注意的是，鹽橋必須是濕潤的但水不能太多，必要時(shí)需用濾紙吸去多余的意的是，鹽橋必須是濕潤的但水不能太多，必要時(shí)需用濾紙吸去多余的水份。保持鹽橋與電極的緊密接觸。水份。保持鹽橋與電極的緊密接觸。1919、程序設(shè)置中的除鹽步驟，可根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置，如果樣品中、程序設(shè)置中的除鹽步驟，可根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)置，如果樣品中含鹽量較高可設(shè)置多步除鹽，并加長除鹽時(shí)間。但這種方法只能除去很含鹽量較高可設(shè)置多步除鹽，并加長除鹽時(shí)間。但這種方法只能除去很少量的鹽離子，所以最好是在上樣前，對(duì)樣品進(jìn)行除鹽處理。少量的鹽離子，所以最好是在上樣前，對(duì)樣品進(jìn)行除鹽處理。等電聚焦注意事項(xiàng)等電聚焦注意事項(xiàng)+pH 3p

24、H 7.5pH10pH 3pH 7.5pH10chargesize2-D Theory1 1、配制、配制10%10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml80ml凝膠溶液，每塊凝膠溶液，每塊凝膠凝膠40ml40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm1cm的的空間，用空間，用MilliQMilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整，聚合平整，聚合3030分鐘，一般凝膠與上方液體分層后，表明凝分鐘，一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。膠已基本聚合。2 2、待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的、

25、待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQMilliQ水、乙醇或水、乙醇或水飽和正丁醇，用水飽和正丁醇，用MilliQMilliQ水沖洗。水沖洗。3 3、從、從-20-20冰箱中取出的膠條，先于室溫放置冰箱中取出的膠條，先于室溫放置1010分鐘，分鐘，使其溶解；使其溶解；4 4、配制膠條平衡緩沖液、配制膠條平衡緩沖液I I。第二向第二向SDS-PAGESDS-PAGE電泳操作步驟電泳操作步驟5 5、在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上、在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQMilliQ水浸濕，擠水浸濕

26、，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。6 6、將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠、將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入條的槽中加入5ml5ml膠條平衡緩沖液膠條平衡緩沖液I I。將樣品水化盤放在水。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃平搖床上緩慢搖晃1515分鐘。分鐘。7 7、配制膠條平衡緩沖液、配制膠條平衡緩沖液IIII。8 8、第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中、第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉

27、或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液的膠條平衡緩沖液I I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液膠條平衡緩沖液IIII，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃1515分鐘。分鐘。9 9、用濾紙吸去、用濾紙吸去SDS-PAGESDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。下，短玻璃板

28、朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。1010、將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。、將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。1111、將、將1010電泳緩沖液，用量筒稀釋電泳緩沖液，用量筒稀釋1010倍，成倍，成1 1電泳緩電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。1212、第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的、第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液膠條平衡緩沖液IIII。并用濾紙吸取多余的平衡液。并用濾紙吸取多余的平衡液。1313、將、將IPGIPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在一端使膠面完全浸末在1

29、 1電泳緩沖液中。然后將膠條膠面電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。1414、將放有膠條的、將放有膠條的SDS-PAGESDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。點(diǎn)瓊脂糖封膠液。1515、用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將、用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、。注意不

30、要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。面的支撐膜，不要碰到膠面。1616、放置、放置5 5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。1717、在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠、在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。轉(zhuǎn)移至電泳槽中。1818、在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，、在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm5mA/gel/17cm）或低電壓，）或低電壓，待樣品在完全走出

31、待樣品在完全走出IPGIPG膠條，濃縮成一條線后，再膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm20-30mA/gel/17cm），待），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。1919、電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝、電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。2020、進(jìn)行染色。、進(jìn)行染色。 高靈敏度高靈敏度 寬的定量線性范圍寬的定量線性范圍 低毒安全低毒安全 對(duì)環(huán)境無不良影響對(duì)環(huán)境無不良影響 兼容質(zhì)譜分析兼容質(zhì)譜

32、分析 目前的技術(shù)沒有完全符合上述要求的，從事雙向電泳的目前的技術(shù)沒有完全符合上述要求的，從事雙向電泳的實(shí)驗(yàn)室需要應(yīng)用不只一種的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)室需要應(yīng)用不只一種的檢測(cè)方法。膠上蛋白質(zhì)的檢測(cè)考馬斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)染色 1.1.用去離子水清洗凝膠兩次，每次用去離子水清洗凝膠兩次，每次10min10min，以去除，以去除SDSSDS。 2.2.固定：固定：5050乙醇乙醇/10/10冰醋酸冰醋酸/ /的水溶液，至少的水溶液，至少30min,30min,可過夜?？蛇^夜。 3.3.染色：染色液為染色：染色液為4545甲醇甲醇/10/10冰醋酸冰醋酸/0.25/0.25G-250G-250溶液過濾所得，將

33、凝膠浸泡后染色至少溶液過濾所得，將凝膠浸泡后染色至少2h2h。 4.4.脫色：多次更換脫色液（脫色：多次更換脫色液（2525乙醇乙醇/8/8冰醋酸溶液冰醋酸溶液）直至背景脫凈。）直至背景脫凈。 5.5.保存：用保險(xiǎn)膜包裹，可存一個(gè)月?；蛎撋笤诒４妫河帽ｋU(xiǎn)膜包裹，可存一個(gè)月。或脫色后在- -8080下保存。下保存。Molecular Imager FX Pro Plus MultiImager System Fluorescent and storage phosphor imaging 488 nm, 532 nm, and 635 nm laser excitation sourcesGS

34、-800 Calibrated DensitometerReflectance and transmittance modes30 x 40 cm scanning areaVersaDoc Imaging System CCDbased UV/visible, fluorescence,and chemiluminescent imaging凝膠成像與計(jì)算機(jī)圖像分析凝膠成像與計(jì)算機(jī)圖像分析PROTEOME：PROTEin與與genOME的雜合的雜合 蛋白質(zhì)組學(xué)是研究活細(xì)胞內(nèi)基因組編碼的全部蛋白質(zhì)功能的科學(xué)。它蛋白質(zhì)組學(xué)是研究活細(xì)胞內(nèi)基因組編碼的全部蛋白質(zhì)功能的科學(xué)。它是功能基因組學(xué)的是功能基因組學(xué)的 “中流砥柱中流砥柱”，是聯(lián)系基因組序列與細(xì)胞功能的重要學(xué)，是聯(lián)系基因組序列與細(xì)胞功能的重要學(xué)科。科。 Proteome包括了一個(gè)基因組、一種生物或一種細(xì)胞包括了一個(gè)基因組、一種生物或一種細(xì)胞/組織所表達(dá)的全組織所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。套蛋白質(zhì)。 一門交叉學(xué)科一門交叉學(xué)科 物理學(xué)物理學(xué) 數(shù)學(xué)數(shù)學(xué) 化學(xué)化學(xué) 計(jì)算機(jī)科學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué) 生物信息學(xué)生物信息學(xué) 基因組基因組 轉(zhuǎn)