蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及檢測技術(shù)

1、會計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及檢測技術(shù)蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及檢測技術(shù)注：R代表不同的側(cè)鏈基團(tuán)，R不同代表不同的氨基酸氨基酸序列分析一般采用綜合的方法測定目標(biāo)制品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進(jìn)行比較。自動序列分析儀測序 其原理為Edman降解法，分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個步驟。首先在pH9.0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(PhN=C=S，PITC)和蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)處理耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的N一端第一個肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)

2、定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色譜法鑒定出降解下來的PTH-氨基酸種類，從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息。質(zhì)譜技術(shù) 質(zhì)譜所使用的測序方法是denovo測序, 是根據(jù)肽段與惰性氣體相碰撞產(chǎn)生的一系列的有規(guī)律的片段離子之間的質(zhì)量差來推斷氨基酸序列。我們可以根據(jù)肽鍵斷裂處的y離子和b離子來推測氨基酸序列從而不受翻譯后修飾和純度的限制，但是質(zhì)譜測序是有局限性的，1. 質(zhì)譜測序依賴于公共數(shù)據(jù)庫。 如果所研究的物種的基因組沒有完全被測序，或者其中部分沒有對應(yīng)的序列， 那么質(zhì)譜測序?qū)o法得出正確的鑒定。2. 我們使用的搜索引擎的打分和算法可能也會使得我們遺漏一部分的肽段和質(zhì)譜圖的匹配， 產(chǎn)

3、生假陽性結(jié)果。3. 如果有點(diǎn)突變或者未知修飾存在的話， 由于搜庫算法或者參數(shù)設(shè)置中沒有考慮到， 同樣也無法得出正確的結(jié)果。 質(zhì)譜技術(shù)還廣泛用于蛋白質(zhì)的純度鑒定、分子質(zhì)量測定、肽(質(zhì))譜分析、二硫鍵、乙?；⑻腔?、磷?；?，以及非共價結(jié)合等。-折疊-轉(zhuǎn)角-螺旋無規(guī)則卷曲鑒定方法：常用圓二色譜法(Circular dichroism,CD)血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)解析方法蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)解析方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)分析主要有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)分析主要有三大技術(shù)平臺三大技術(shù)平臺（1 1）X-X-衍射蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析衍射蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析（2 2）核磁共振波譜分析）核磁共振波譜分析（3 3）冷

4、凍電鏡技術(shù)）冷凍電鏡技術(shù) 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)X-衍射分析衍射分析 摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件、快速處理晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和減少差錯是目前蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析的兩大難題或瓶頸。是目前分辨率最高的結(jié)構(gòu)測定方法，高通量晶體結(jié)構(gòu)分析中的幾大重要環(huán)節(jié)是：數(shù)據(jù)處理與分析、重原子的定位、密度修飾、分子替換、圖形整合、模型加工和確認(rèn)。晶體結(jié)構(gòu)分析的常用軟件有SOLVE，RESOLVE等 核磁共振波譜分析核磁共振波譜分析 利用核磁共振原理，檢測分子質(zhì)量小于60k的蛋白質(zhì)，通過對其核磁共振譜線特征參數(shù)的測定來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，就是將原始資料利用傅里葉變換轉(zhuǎn)換為不同的峰值，然后采集各種不同的峰組成圖譜，并利用生物信

5、息學(xué)方法篩選出具有特定結(jié)構(gòu)特征的圖譜。 常用NMRPipe和SPARKY軟件處理這些過程，使用XEASY，DYANA和GARANT等軟件分析側(cè)鏈或骨架結(jié)構(gòu)。 冷凍電子顯微鏡技術(shù)冷凍電子顯微鏡技術(shù) 采用高壓快速液氮冷凍方法使樣品包埋在玻璃態(tài)的水環(huán)境中，使我們能夠觀察到生物大分子在天然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)；同時冷凍的速度極快，把細(xì)胞在其生理活動的某些特定時刻固定下來，顯示此時的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)而可通過不同功能狀態(tài)的瞬時構(gòu)象變化來研究生物分子的功能。冷凍電鏡獲得的是處于天然狀態(tài)下未經(jīng)染色的分子的二維投影像。將樣品進(jìn)行不同角度的傾斜所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，并依據(jù)樣品的不同特性使用不同的重構(gòu)技術(shù)獲得分子的結(jié)構(gòu)，在

6、此基礎(chǔ)上觀察多種成分的圖像變化，追蹤生物大分子的裝配及其動力學(xué)過程。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可視化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可視化 可視化分析蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，有利于從原子間相互作用的層次理解生命活動過程的信息控制機(jī)制，更加有效地揭示分子在完成其功能過程中的演化情況，了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和各種微觀性質(zhì)與宏觀性質(zhì)之間的定量關(guān)系。只要安裝蛋白質(zhì)分子圖形學(xué)軟件，并獲得所需蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，配以商業(yè)軟件或免費(fèi)的小分子圖形設(shè)計(jì)系統(tǒng)，就可開展結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的探索性工作。氨基酸序列分析一般采用綜合的方法測定目標(biāo)制品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進(jìn)行比較。自動序列分析儀測序 其原理為Edman降解法，分為耦合、切割、萃

7、取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個步驟。首先在pH9.0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(PhN=C=S，PITC)和蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)處理耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的N一端第一個肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色譜法鑒定出降解下來的PTH-氨基酸種類，從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息。 核磁共振波譜分析核磁共振波譜分析 利用核磁共振原理，檢測分子質(zhì)量小于60k的蛋白質(zhì)，通過對其核磁共振譜線特征參數(shù)的測定來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，就是將原始資料利用傅里