基因編輯技術(shù)和原理PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1基因編輯技術(shù)和原理基因編輯技術(shù)和原理 什么是基因編輯技術(shù)？ 基因編輯是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上， 在這位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo) DNA 片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變， 又修改并編輯了原有的基因組， 真正達(dá)成了“編輯基因”。第1頁/共22頁 基因編輯的研究背景 傳統(tǒng)的動(dòng)物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，經(jīng)歷漫長(zhǎng)的培育過程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進(jìn)展。第2頁/共22頁 基因編輯原理 現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性 DNA 雙鏈斷裂激活細(xì)胞天然的修

2、復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接和同源重組修復(fù) 兩條途徑。第3頁/共22頁 1.非同源末端連接（NHEJ ）是一種低保真度的修復(fù)過程，斷裂的DNA 修復(fù)重連的過程中會(huì)發(fā)生堿基隨機(jī)的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實(shí)現(xiàn)目的基因敲除。如果一個(gè)外源性供體基因序列存在，NHEJ 機(jī)制會(huì)將其連入雙鏈斷裂DSB 位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的基因敲入。 （ 移碼突變：在正常DNA分子中，堿基缺失或增加3的倍數(shù)，造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯(cuò)誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。）第4頁/共22頁 2. 同源重組修復(fù)（HR） 是一種相對(duì)高保真度的修復(fù)過程，在一個(gè)帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會(huì)通過

3、同源重組過程完整的整合到靶位點(diǎn)，不會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。如果在一個(gè)基因兩側(cè)同時(shí)產(chǎn)生DSB，在一個(gè)同源供體存在的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。第5頁/共22頁第6頁/共22頁基因編輯技術(shù)的種類目前主要有 3 種基因編輯技術(shù)， 分別為：n 人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技術(shù)；n 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技術(shù)； n RNA 引導(dǎo)的 CRISPR- Cas 核酸酶技術(shù)(CRISPR- Cas 9）。第7頁/共22頁 1. ZFN 基

4、因組編輯技術(shù)ZFN 技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實(shí)現(xiàn)是基于具有獨(dú)特的DNA序列識(shí)別的鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年Diakun 等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的 DNA 結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2- His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對(duì)由4個(gè)鋅指連接而成的ZFN可識(shí)別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。第8頁/共22頁ZFN 由鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中，由 ZFP 構(gòu)成的 DNA 識(shí)別域能識(shí)別特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由Fok構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙

5、鏈DNA 斷裂(DSB)。于是， 細(xì)胞可以通過同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來修復(fù) DNA。HR 修復(fù)有可能會(huì)對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而 NHEJ 修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。第9頁/共22頁ZFN 誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?3 個(gè)方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和時(shí)間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) ZFN 對(duì)細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)。第10頁/

6、共22頁 2. TALEN 基因組編輯技術(shù) 2009 年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子，它的蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有較恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨后，TALE特異識(shí)別 DNA 序列的特性被用來取代 ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它可設(shè)計(jì)性更強(qiáng)，不受上下游序列影響，具備比ZFN 更廣闊的應(yīng)用潛力。第11頁/共22頁TALENs 包含兩個(gè) TALEN 蛋白, 每個(gè) TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個(gè) TALEN 靶向正義鏈上靶標(biāo)位點(diǎn), 另一個(gè)則靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點(diǎn). 然后 Fok形成二聚體, 在靶

7、向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細(xì)胞啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 針對(duì)不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長(zhǎng)度不同, 其長(zhǎng)度范圍一般為1220 bp. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時(shí), 第一個(gè)堿基為 T 時(shí)其結(jié)合效果更佳。第12頁/共22頁目前， TALEN 已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、 哺乳動(dòng)物和植物的位點(diǎn)特異性基因打靶， 與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)， 但仍然有些問題需要解決，例如:脫靶效應(yīng)、TALEN 與基因組進(jìn)行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近序列有關(guān)等。CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù)第13頁/共22頁1987年，

8、Ishino 等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫的關(guān)系。第14頁/共22頁CRISPR/Cas 系統(tǒng)由 Cas9 核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成. 轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與 Cas9 蛋白形成復(fù)合體, 指導(dǎo) Cas9 核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定靶標(biāo)位點(diǎn), 在 PAM 序列上游處切割 DNA 造成雙鏈 DNA 斷裂, 并啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 從不同菌種中分離的 CRISPR/Cas 系統(tǒng), 其 CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長(zhǎng)度不同, PAM 序列也可能不同。第15頁/共22頁第16頁/共22頁第17頁/共22頁第18頁/共22頁基因編輯的優(yōu)勢(shì)與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比