講義4：微生物基本操作規(guī)范(4)接種、分離純化

1、 1清洗、消毒和滅菌操作清洗、消毒和滅菌操作 2培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 3采樣和取、制樣采樣和取、制樣 4接種、分離純化接種、分離純化 5制片、染色及顯微觀察制片、染色及顯微觀察 6實(shí)驗(yàn)室安全基礎(chǔ)知識(shí)實(shí)驗(yàn)室安全基礎(chǔ)知識(shí)4.1接種 將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。 1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 圖4-1接種和分離工具 培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。 在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操

2、作無(wú)菌操作。 接種時(shí)，打開(kāi)培養(yǎng)皿的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。 接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來(lái)回通過(guò)火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來(lái)挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過(guò)火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。 平板接種時(shí)，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開(kāi)一小部分進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過(guò)。 含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物混和

3、培養(yǎng)物（Mixed culture）。 如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純純培養(yǎng)培養(yǎng)（Pure culture）。 在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱為分離純化分離純化。 平板劃線分離培養(yǎng)法，用無(wú)菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線，使培養(yǎng)物中混在的多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面分散生長(zhǎng)，各自形成菌落，根據(jù)菌落的形態(tài)及特征，挑選單個(gè)菌落，經(jīng)過(guò)移種而獲得純種細(xì)菌（純培養(yǎng)）。 分離細(xì)菌的方法很多，最常用的是平板劃線分離法。根據(jù)劃線的方式不同有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖4-2） 圖4-2平板劃線分離法 1.斜線法 2.曲

4、線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 1)先將接種環(huán)火焰滅菌,待冷后取培養(yǎng)物少許;2) 左手拿起平板，以中指為支點(diǎn)，并用拇指和食指將平板蓋打開(kāi)；3)右手迅速將取有培養(yǎng)物的接種環(huán)從打開(kāi)的空間插入平板內(nèi)，使接種環(huán)與培養(yǎng)基表面呈45角，在酒精燈上方56cm處劃線接種。先在平板上1/5處輕輕涂布，然后即可左右來(lái)回以曲線形式作連續(xù)劃線接種，線與線間留有適當(dāng)距離，將整個(gè)平板表面劃滿曲線；4)注明標(biāo)識(shí)后，置35培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般在1824小時(shí)后觀察結(jié)果。 1)用接種環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線,再在2、3區(qū)依次劃線。2)每劃完一個(gè)區(qū)域，均將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域。3)每一區(qū)域的劃線

5、均接觸上一區(qū)域的接種線12次，使接種量逐漸減少，以獲得單個(gè)菌落。4)其他操作與上述曲線劃線分離法相同。斜線接種示意圖斜線接種示意圖 將培養(yǎng)物涂布于平板上1/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自1/5劃線處作平行劃線56條，將接種環(huán)滅菌后，劃垂直線56條，使呈正方形格。其他操作同前。 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面只能在固定的地方生長(zhǎng)繁殖，經(jīng)過(guò)一定的培養(yǎng)時(shí)間后，可形成肉眼可見(jiàn)的菌落。菌落中只含有一種細(xì)菌，而每種細(xì)菌的菌落各有其特征。菌落形態(tài)往往有助于初步識(shí)別細(xì)菌；還可以由此獲得細(xì)菌而進(jìn)行一系列的鑒定。 識(shí)別菌落的能力識(shí)別菌落的能力是從事微生物檢驗(yàn)人員的極為重要的基本功。1)大小大小:以mm表示。菌落的大小隨細(xì)菌種

6、類、培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間等條件而不同。同一種細(xì)菌在同一平板上，在密集處的菌落比疏散處小。因此，表示菌落大小時(shí)，應(yīng)注明培養(yǎng)基名稱。一般以培養(yǎng)1824小時(shí)后，選散在處的菌落大小。1mm左右為小菌落；23mm為中等大；3mm以上以上為大菌落。2)形狀及邊緣：形狀及邊緣：圓形、不規(guī)則、放射狀、樹(shù)根狀、邊緣整齊、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等。3)隆起：隆起：平的平的、突起的、凸面的、凸形的等。4)表面：表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有無(wú)光澤等。 圖4-3細(xì)菌的培養(yǎng)特征1.點(diǎn)狀 2.圓形 3.絲狀 4.不規(guī)則形 5.假根狀 6.紡錘狀 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.墊狀 11.臍狀 12.邊緣整齊 13.

7、波狀 14.裂片狀 15.嚙蝕狀 16.絲狀 17.卷發(fā)狀 18.絲線狀 19.刺毛狀 20.串珠狀 21.疏展?fàn)?22.樹(shù)根狀 23.假根狀 24.絲狀 25.串珠狀 26.乳頭狀 27.絨毛狀 28.樹(shù)根狀 29.量杯狀 30.蘿卜狀 31.漏斗狀 32.囊狀 33.層狀 34.絮狀 35.環(huán)狀 36.蹼狀 37.膜狀5)構(gòu)造構(gòu)造:均勻、露滴狀、顆粒狀、發(fā)狀、皺招狀等。6)顏色：顏色：無(wú)色、白色、灰色、灰白色或乳白色、熒光綠、金黃色、檸檬色、紅色等、7)透明度：透明度：透明、半透明、不透明、微透明等。8)硬度：硬度：硬、軟、干燥、濕潤(rùn)，是否附著于培養(yǎng)基上或嵌入培養(yǎng)基內(nèi)不易刮取。9)質(zhì)地：質(zhì)

8、地：脂狀、粘液狀、膜狀等。10)乳化性：乳化性：在鹽水中研磨是否形成均勻乳劑或顆粒狀。11)溶血性：溶血性：在血平板上，菌落周圍有無(wú)溶血環(huán)。 主要用于經(jīng)劃線分離培養(yǎng)所獲得的單個(gè)菌落的移種，以及觀察細(xì)菌的某些培養(yǎng)特征。 以菌種移種為例，其接種方法是：1.取一菌種管和培養(yǎng)基管，置左手食指、中指、無(wú)名指間，拇指壓住兩管底部上側(cè)面，使菌種管位于外側(cè)，培養(yǎng)基管位于內(nèi)側(cè)。2.右手拇指和食指分別旋松兩管棉塞?；鹧鏈缇臃N環(huán)。3. 以右手小指與手掌，小指與無(wú)名指分別夾取棉塞（先外管后內(nèi)管），將兩管口迅速通過(guò)火焰12次。4.將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向

9、上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線，直至斜面上方頂端。5.取出接種環(huán)，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內(nèi)管）；最后將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌放好。6.做好標(biāo)識(shí)，置35培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)1824小時(shí)。斜面培養(yǎng)一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特征。圖4-4斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作 (1)接種滅菌 (2)開(kāi)啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞 1.如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管。2.滅菌接種環(huán)，從菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調(diào)和，使細(xì)菌混合于培養(yǎng)基的液體中。液體培養(yǎng)基一般以1824小時(shí)培養(yǎng)后觀察生長(zhǎng)特征。

10、肉湯培養(yǎng)可觀察如下幾項(xiàng)： a.發(fā)育程度：有無(wú)生長(zhǎng)、微弱、中等、旺盛。 b.混濁度：有無(wú)及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長(zhǎng)。 c.沉淀:有無(wú)及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）。 d.表面：有無(wú)生長(zhǎng)、性狀（膜狀、環(huán)狀）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、顆粒、皺狀）。 e.其他：有無(wú)特殊氣味，色素。如果是糖發(fā)酵培養(yǎng)基則主要觀察是否產(chǎn)酸和有無(wú)氣體。 多用于保存菌種、觀察動(dòng)力及厭氧培養(yǎng)等也可以用于觀察細(xì)菌的某些生化反應(yīng)。1.如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管。2.以滅菌接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達(dá)近管底部（但不能完全刺到管底），接種針應(yīng)沿原

11、路退出。3.經(jīng)培養(yǎng)后半固體培養(yǎng)基可觀察到：沿穿刺線生長(zhǎng)，線外的培養(yǎng)基清亮表示細(xì)菌無(wú)動(dòng)力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴(kuò)散生長(zhǎng)，或整個(gè)培養(yǎng)基混濁表示細(xì)菌有動(dòng)力。 首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋，取一定量（1mL）的稀釋液加入已熔化并冷卻至4550的15mL（使用直徑90mm的平皿時(shí)）普通瓊脂管中，立即搖勻，趁瓊脂未凝固前傾注于已滅菌的平皿中，待凝固之后，將平板倒置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 （圖4-5 a） 培養(yǎng)后觀察，細(xì)菌大部分分散于瓊脂層內(nèi)，形成深層菌落，有一部分可生長(zhǎng)于表面。圖4-5傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解 1.菌懸液 2.熔化的培養(yǎng)基 3.培養(yǎng)物 4.無(wú)菌水 稀釋倒平板和涂布法稀釋倒

12、平板和涂布法 首先把微生物懸液通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無(wú)菌的已經(jīng)凝固的瓊脂平板上，然后用滅菌的L型玻璃棒把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)后即可觀察。（圖4-5 b） 研究和鑒定細(xì)菌時(shí)所提到細(xì)菌的特征指的是細(xì)菌菌落的特征，而不是單個(gè)細(xì)菌的特征。大量食品微生物的質(zhì)量檢測(cè)是對(duì)可見(jiàn)菌株的檢測(cè)，現(xiàn)在衍變到給待檢測(cè)細(xì)菌提供適當(dāng)?shù)臈l件使之代謝繁殖后再進(jìn)行檢測(cè)。因此在細(xì)菌學(xué)研究中，最基本的要求是有能促使單個(gè)細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì)和方法。能給細(xì)菌提供適當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)稱為培養(yǎng)基。 根據(jù)接種培養(yǎng)方式的不同，可將培養(yǎng)基以多種形式分裝到試管、三角瓶或螺帽瓶中，試管或三角瓶的瓶口可用適當(dāng)?shù)拿奕?、金屬帽、塑料帽等蓋緊。螺帽的優(yōu)勢(shì)是能夠阻止蒸汽蒸發(fā)，避免培養(yǎng)基在保存過(guò)程中干燥。1.液體批量培養(yǎng)：在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程不需要加入新的培養(yǎng)基。2.瓊脂斜面培養(yǎng)：在試管中裝入約5mL固體培養(yǎng)基融化后擺成斜面冷卻。將接種物涂布到斜面或用接種環(huán)在斜面上劃線。3.穿刺培養(yǎng)：將含瓊脂培養(yǎng)基的試管或瓶子垂直放置，使培養(yǎng)基凝固，用接種針挑取少量接種物垂直穿入至容器的中部。4.半固體培養(yǎng)：菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基