第十九章吸光光度法

1、第一節(jié) 吸光光度法的基本原理第二節(jié) 光吸收的基本定律第三節(jié) 吸光光度法分析條件的選擇第四節(jié) 分光光度計(jì)第五節(jié) 吸光光度法的測定方法第十九章 吸光光度法 吸光光度法是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立的一種分析方法，包括比色法、可見吸光光度法、紫外吸光光度法和紅外光譜法等。 吸光光度法屬于儀器分析方法，它所測定的是物質(zhì)對光的吸收程度。 吸光光度法主要具有以下特點(diǎn)： （1）測定的靈敏度高。常用于測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10-3 1 的微量組分，甚至可測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至 10-5 10-4 的痕量組分。 （2）測定的準(zhǔn)確度較高。一般吸光光度法測定的相對誤差為 2 5，若使用精密儀器，相對誤差可降至 1 2，完全可

2、以滿足微量組分測定的要求。 （3）儀器設(shè)備簡單，操作簡便、快速，選擇性好。由于新的顯色劑和掩蔽劑不斷發(fā)現(xiàn)，提高了選擇性，一般不需分離干擾物質(zhì)就能進(jìn)行測定。 （4）應(yīng)用廣泛。幾乎所有的無機(jī)離子和具有共軛雙鍵的有機(jī)化合物都可以直接或間接地用吸光光度法進(jìn)行測定。第一節(jié) 吸光光度法的基本原理一、光的基本性質(zhì)二、物質(zhì)對光的選擇性吸收三、吸收曲線 一、光的基本性質(zhì)波譜名稱 波長范圍 分 析 方 法 射線 0.005 0.17 nm 中子活化分析，穆斯堡爾譜法 X 射線 0.1 10 nm X 射線光譜法 遠(yuǎn)紫外 10 200 nm 真空紫外光譜法 近紫外 200 400 nm 紫外光譜法 可見光 400

3、750 nm 比色法，可見吸光光度法 近紅外 0.75 2.5紅外光譜法 中紅外 2.5 50紅外光譜法 遠(yuǎn)紅外 50 1000紅外光譜法 微 波 1 1000 mm 微波光譜法 射 頻 1 1000 m 核磁共振光譜法 mmm表 19-1 電磁波譜 光具有波粒二相性。光的波長、頻率 、速率 c、能量 E 之間的關(guān)系為： 不同波長的光具有不同的能量，光的波長越短， 光的能量就越大；光的波長越長，光的能量就越小。/Ehvhc二、物質(zhì)對光的選擇性吸收 人的眼睛能感覺到的光稱為可見光，其波長在 400 760 nm 范圍內(nèi)。通常將具有某一波長的光稱為單色光，由不同波長的單色光組合得到的光稱為復(fù)合光。

4、 物質(zhì)之所以呈現(xiàn)不同的顏色，是由于物質(zhì)對不同波長的單色光選擇吸收而產(chǎn)生的。當(dāng)一束白光通過一有色溶液時，某種波長的單色光被溶液吸收，而其他波長的單色光透過溶液。因此，溶液呈現(xiàn)的顏色取決于透過光的顏色。物質(zhì)的顏色 吸 收 光 物質(zhì)的顏色 吸 收 光 顏色 /nm顏色 /nm黃綠 紫 400 450紫 黃綠 560 580 黃 藍(lán) 450 480 藍(lán) 黃 580 600 橙 綠藍(lán) 480 490 綠藍(lán) 橙 600 650 紅 藍(lán)綠 490 500 藍(lán)綠 紅 650 760 紫紅 綠 500 560 如果將兩種單色光按適當(dāng)?shù)谋壤旌虾蟮玫桨坠?，則這種單色光稱為互補(bǔ)色光。顯然，透過光和吸收光是互補(bǔ)色光。

5、表 19-2 物質(zhì)的顏色與吸收光顏色的關(guān)系 三、吸收曲線 如果將不同波長的光通過一定濃度的某一溶液，分別測定該溶液對各種波長的光的吸光度。以入射光的波長為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)作圖，可得到一條吸光度隨波長變化的曲線，稱為吸收曲線或吸收光譜。 吸收曲線中吸光度最大時所對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長。當(dāng)溶液的濃度不同時，其吸收曲線的形狀和最大吸收波長的位置不變，只是吸光度隨濃度的增大而增大。圖 19-1 KMnO4 溶液的吸收曲線第二節(jié) 光吸收的基本定律一、朗伯-比爾定律二、偏離朗伯-比爾定律的原因 一、朗伯-比爾定律 在吸光光度法中，吸光度和透光率分別定義為： 0lgIAI0ITI吸光度與透光

6、率之間的關(guān)系為： defdefA =lgT 1760 年， 朗伯指出： 一束平行單色光通過有色溶液后，光的吸收程度與溶液液層的厚度成正比。A = k1 d 1852 年，比爾指出：一束平行單色光通過有色溶液后，光的吸收程度與溶液的濃度成正比。A = k2 cB 將朗伯定律和比爾定律合并起來，就得到朗伯-比爾定律： B=Ad c例題 例 19-1 用鄰菲羅啉法測定鐵，已知 Fe2+ 的質(zhì)量濃度為 1.010-3 g L-1。用 2 cm 吸收池，在波長 508 nm 處測得吸光度為 0.38，計(jì)算鄰菲羅啉合鐵()配離子的摩爾吸收系數(shù)。 解：Fe3+ 濃度為：2+32+512+(Fe )1.0 1

7、0(Fe )1.8 10 mol L(Fe )55.85cM 配離子的摩爾吸收系數(shù)為： 5B5210.381.8 100.20 1.1 10 dmmolAc d 如果溶液的組成用質(zhì)量濃度表示，朗伯 - 比爾定律可表示為： 摩爾吸收系數(shù)與吸收系數(shù)的關(guān)系為： 溶液中含有多種吸光物質(zhì)時，若吸光物質(zhì)之間沒有相互作用，則溶液吸光度等于各吸光物質(zhì)的吸光度之和：BAa dBa M121 122=+= ()iiiAA AAdccc二、偏離朗伯-比爾定律的原因 根據(jù)朗伯-比爾定律，以 A 為縱坐標(biāo)，以 cB或 B 為橫坐標(biāo)作圖，應(yīng)得到一條通過原點(diǎn)的直線，此直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線或工作曲線。 但在實(shí)際測定中，常會出現(xiàn)標(biāo)

8、準(zhǔn)曲線偏離直 線的現(xiàn)象，曲線向上或向下發(fā)生彎曲，這種現(xiàn)象稱為偏離朗伯-比爾定律。圖 19-2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 19-3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的偏離 1. 非單色光引起的偏離 假設(shè)入射光是由波長為 和 的兩種單色光組成，其強(qiáng)度分別為 I0,1 和 I0,2 ，當(dāng)通過濃度為 cB、厚度為 d 的吸光物質(zhì)溶液后，透射光的強(qiáng)度分別為 I1 和 I2。（一）物理因素引起的偏離12 對波長為 的單色光：0,111B1lgIAdcI1B10,110dcII1 對波長為 的單色光：0,222lgIAdcI2B20,210dcII2B2 實(shí)際測定的是它們的總吸光度 A總。由于總?cè)肷涔鈴?qiáng)度為 I0,1I0,2，總透射光強(qiáng)度為 I

9、1I2：0,10,20,10,2120,10,2lglg1010dcdcIIIIAIIII1B2B總?cè)?2，則有：B0,10,20,10,2lg()10dcIIAdcIIB總即總吸光度與濃度仍服從朗伯-比爾定律。 上述討論可能對應(yīng)以下兩種不同的情況： （1） 很小，可近似認(rèn)為 ， 入射光近似為單色光，故 A 與 cB 仍成正比。 （2）盡管 較大，但在所選擇的入射光波長范圍附近吸收曲線較平坦，因此變化較小，故 A 與 cB 仍保持較好的線性關(guān)系。 如果 較大時， 不等于 ，則 A 與 cB 不成正比而偏離朗伯-比爾定律， 與 相差越大，偏離就越顯著。通常在最大吸收波長處附近一小范圍內(nèi)吸收曲線較

10、為平坦， 較小。因此選擇 為入射波長，既有較高靈敏度，又可減小由非單色光引起的偏差。21121212max 2. 非平行入射光引起的偏離 若入射光束為非平行光，就不能保證光束全部垂直通過吸收池，可能導(dǎo)致光束通過吸收池的實(shí)際平均光程大于吸收池的厚度，使實(shí)際測得的吸光度大于理論值，從而導(dǎo)致與朗伯-比爾定律產(chǎn)生正偏離。 3. 介質(zhì)不均勻引起的偏離 若溶液中生成溶膠或產(chǎn)生渾濁，當(dāng)入射光通過該溶液時，除一部分光被吸光物質(zhì)吸收外，還有一部分光被溶膠粒子和粗分散相粒子散射而損失，使透光率減小，實(shí)測的吸光度偏高，從而對朗伯-比爾定律產(chǎn)生正偏離。 1. 溶液濃度過高引起的偏離 若吸光物質(zhì)溶液的濃度較高時，吸光粒

11、子之間的相互作用較強(qiáng)，改變了吸光粒子對光的吸收能力，使溶液的吸光度與溶液濃度之間的線性關(guān)系發(fā)生了偏離。 （二）化學(xué)因素引起的偏離 2. 化學(xué)反應(yīng)引起的偏離 朗伯 - 比爾定律中的濃度是指吸光物質(zhì)的平衡濃度，而在實(shí)際工作中常用吸光物質(zhì)的分析濃度來代替。當(dāng)吸光物質(zhì)的平衡濃度等于其分析濃度或與分析濃度成正比時，A 與 cB 的關(guān)系仍服從朗伯-比爾定律。 被測吸光物質(zhì)在溶液中常發(fā)生締合、解離、互變異構(gòu)、逐級配位等反應(yīng)，形成新的化合物而改變了其平衡濃度與分析濃度之間的正比關(guān)系，從而導(dǎo)致偏離朗伯-比爾定律。第三節(jié) 吸光光度法分析條件的選擇一、顯色反應(yīng)及其條件二、測定波長的選擇三、吸光度范圍的選擇四、參比溶

12、液的選擇 一、顯色反應(yīng)及其條件 可見光區(qū)的吸光光度法只能用于測定有色溶液。當(dāng)用吸光光度法對無色溶液和顏色較淺的溶液進(jìn)行測定時，必須加入一種能與被測組分反應(yīng)生成較深顏色的有色化合物的試劑，然后再進(jìn)行測定。將被測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的化學(xué)反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)，能與被測組分反應(yīng)使之生成有色化合物的試劑稱為顯色劑。 顯色劑必須滿足下述條件： （1）靈敏度要高：可見吸光光度法一般用于微量組分的測定，要求選擇的顯色劑能與待測組分生成摩爾吸收系數(shù)較大的有色化合物。生成的有色化合物的摩爾吸收系數(shù)越大，對入射光的吸收程度越大，測定的靈敏度就越高。 （2）選擇性要好：選用的顯色劑最好只與待測組分發(fā)生顯色反應(yīng)，而與溶液

13、中共存的其他干擾離子不顯色，或者顯色劑與被測組分所生成的有色化合物的顏色和顯色劑與干擾離子所生成有色化合物的顏色有明顯的不同。 （3）生成的有色化合物的穩(wěn)定性高：顯色劑與被測組分生成的有色化合物要有足夠的穩(wěn)定性，不易受外界條件的影響而發(fā)生變化。 （4）生成的有色化合物的組成確定：顯色劑與被測組分生成的有色化合物的組成要恒定，符合一定的化學(xué)式，否則測定的再現(xiàn)性就較差。 （5）最在吸收波長相差足夠大：有色化合物與顯色劑的最大吸收波長的差別要足夠大，一般要求相差 60 nm 以上。 （二）顯色條件的選擇 1. 顯色劑的用量 顯色劑的適宜用量常通過實(shí)驗(yàn)確定，其方 法是取 7 10 個相同濃度的被測組分

14、的溶液， 并固定其他條件，然后分別在溶液中加入不同 量的顯色劑，逐一測定吸光度，繪制出吸光度 A 與顯色劑濃度 cB 的關(guān)系曲線。圖 19-4 吸光度與顯色劑用量的關(guān)系cB 2. 溶液的酸度 溶液的酸度對顯色反應(yīng)的影響如下： （1）對被測組分存在狀態(tài)的影響：大多數(shù)被測金屬離子易水解，當(dāng)溶液 pH 增大時，可能生成各種類型的氫氧基配合物，甚至生成氫氧化物沉淀，使顯色反應(yīng)不能進(jìn)行完全。 （2）對顯色劑平衡濃度和顏色的影響：大多數(shù)的顯色劑是有機(jī)弱酸或有機(jī)弱堿，當(dāng)溶液的 pH 變化時，將影響顯色劑的平衡濃度，并影響顯色反應(yīng)的完全程度。另外，有一些顯色劑本身就是酸堿指示劑，它們在不同 pH 的溶液中具有

15、不同的結(jié)構(gòu)，而產(chǎn)生不同的顏色，所以對顯色反應(yīng)也有影響。 （3）對有色化合物組成的影響：在不同 pH 的溶液中，顯色劑與待測離子形成的有色化合物的組成往往不同，因此它的顏色也不同。必須控制合適的 pH，才能獲得好的分析結(jié)果。 不同的顯色反應(yīng)的適宜 pH 是通過實(shí)驗(yàn)確定的。具體方法是固定溶液中被測組分和顯色劑的濃度， 改變?nèi)芤?pH ，測定不同 pH 下溶液的吸 光度， 以 pH 為橫坐標(biāo)， 以吸光度為縱坐標(biāo)，作出 pH 與吸光度的關(guān)系曲線，從曲線上找出適宜的 pH 范圍。圖 19-5 吸光度與溶液 pH 的關(guān)系 3. 顯色溫度 顯色反應(yīng)一般在室溫下進(jìn)行，但有些顯色反應(yīng)需要加熱到一定溫度時才能完成

16、，而有些有色化合物當(dāng)溫度較高時又容易發(fā)生分解。對不同的顯色反應(yīng)，應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定其最佳溫度范圍。 4. 顯色時間 可通過實(shí)驗(yàn)來確定合適的顯色時間。實(shí)驗(yàn)的方法是配制一份待測溶液，從加入顯色劑起計(jì)算時間，每隔幾分鐘測定一次吸光度，繪制溶液的吸光度與反應(yīng)時間的關(guān)系曲線，根據(jù)曲線選擇合適的測定時間。 二、測定波長的選擇 根據(jù)溶液的吸收曲線，選擇該溶液具有最大吸收的波長 max 作為入射波長。在max 處摩爾吸收系數(shù) 最大，使測定具有較高的靈敏度；同時，在 max 處的一個較小范圍內(nèi)，吸光度變化較小，不會偏離朗伯 - 比爾定律，也使測定具有較高的準(zhǔn)確度。如果干擾物質(zhì)在 max 處也有強(qiáng)烈吸收時，可以選用不

17、是最大吸收的波長，但應(yīng)盡可能選擇吸光度隨波長改變而變化不大的區(qū)域內(nèi)的波長。 三、吸光度范圍的選擇 在吸光光度分析中，分光光度計(jì)的讀數(shù)誤差也是測定誤差的主要來源之一。對于同一臺儀器，透光率讀數(shù)的絕對誤差 基本上為一 定值。 由于透光率 T 與試液濃度 cB 之間為對數(shù)關(guān)系，因而在不同的透光率讀數(shù)范圍內(nèi)，這一恒定絕對誤差 所引起的濃度 cB 的測定的相對誤差是不同的。 TTB0.434ddlgdTTd cT 以上兩式相除：BBd0.434dlgcTcTT如果發(fā)生有限變化，上式可改寫成：BB0.434lgcTcTT 根據(jù)朗伯-比爾定律：BlgTAdc 當(dāng) d 為定值時，將上式微分：圖 19-6 濃度

18、測定的相對誤差與透光率的關(guān)系 在 T = 36.8 % (A = 0.434) 時，濃度測定的相對誤差最小。 在實(shí)際測定時，常將吸光度控制在 0.2 0.7 (T = 20% 65%) 之間，以減小濃度測定的相對誤差。表 19-2 不同透光率時濃度測定的相對誤差cB/cB(T = 0.01)T/% 9590 80 70 60 50 36.83020 10 5 2 20.6 10.7 5.6 4.0 3.3 2.9 2.7 2.8 3.2 4.3 6.5 13.0 BB(/)/% c c 四、參比溶液的選擇 選擇參比溶液的原則如下： （1）如果只有待測組分與顯色劑的生成物有吸收，可用純?nèi)軇┳鲄⒈?/p>

19、溶液。 （2）如果顯色劑或其他試劑略有吸收，可用不含待測組分的試劑溶液作參比溶液。 （3）如果試樣中的其他組分也有吸收， 但不與顯色劑反應(yīng)，則當(dāng)顯色劑無吸收時，可用試樣溶液作參比溶液；當(dāng)顯色劑略有吸收時，可在試液中加入適當(dāng)掩蔽劑，將待測組分掩蔽后，再加入顯色劑，以此溶液作參比溶液。第四節(jié) 分光光度計(jì)一、基本部件及性能二、幾種常用的分光光度計(jì) 一、基本部件及性能 分光光度計(jì)的基本組成部件為： 光源 色器吸收池 指示器 在可見光區(qū)測定時，常用鎢燈或碘鎢燈作光源，它發(fā)出波長為 320 2500 nm 范圍內(nèi)的連續(xù)光譜。（一）光源單檢測系統(tǒng)讀數(shù) 單色器是將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，它由棱鏡

20、或光柵等色散元件及狹縫和透鏡等組成。 （1）棱鏡：棱鏡是根據(jù)光的折射原理，將復(fù)合光色散為不同波長的單色光，然后再讓所需波長的光通過一個很窄的出射狹縫照射到吸收池上。 （2）光柵：光柵是根據(jù)光的衍射和干涉原理來達(dá)到色散目的。光柵的分辨率比棱鏡高，適用波長范圍寬 ，而且色散均勻。 （二）單色器 （三）吸收池 吸收池是用光學(xué)玻璃或石英制成的無色透明的長方體容器，用于盛放參比溶液或待測溶液。在可見光區(qū)測定時，使用玻璃吸收池。 利用光電效應(yīng)將透射光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為電流進(jìn)行測定的光電轉(zhuǎn)換部件稱為檢測器。可見分光光度計(jì)常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管。（四）檢測系統(tǒng) （1）光電池：常用的光電池是硒光電池，

21、當(dāng)光照射在光電池上時，半導(dǎo)體硒表面就有電子逸出，被收集于金屬薄膜上帶負(fù)電，成為光電池的負(fù)極。由于硒的半導(dǎo)體性質(zhì)，電子只能單向移動，使鐵片成為正極。通過與電阻很小的外電路連接，能產(chǎn)生 10 100 的光電流，可直接用檢流計(jì)測定，電流的大小與照射光強(qiáng)度成正比。A （2）光電管：光電管是由一個陽極和光敏陰極組成的真空（或充有少量惰性氣體）二極管，陰極表面鍍有堿金屬或堿金屬氧化物等光敏材料，當(dāng)它被具有足夠能量的光照射時，能夠發(fā)射電子。當(dāng)兩極之間有電位差時，發(fā)射出的電子就流向陽極而產(chǎn)生電流，電流的大小取決于入射光的強(qiáng)度。 （3）光電倍增管：光電倍增管中有一個光敏陰極和若干個倍增光敏陰極，當(dāng)光照射光敏陰極

22、時發(fā)射出電子，由于外電場的加速作用，這些電子高速轟擊相鄰的第一陰極，該陰極經(jīng)電子轟擊后又產(chǎn)生次級電子，其數(shù)目比入射的電子多，這些電子再次被加速轟擊第二陰極，從而發(fā)射出更多的電子。通常使用 9 12 個這種陰極，可將電流放大幾百萬倍以上。最后倍增了電子射向陽極形成電流，光電流通過負(fù)載電阻變成電壓信號，經(jīng)放大后將信號輸入讀數(shù)指示器。 （五）讀數(shù)指示器 讀數(shù)指示器的作用是把光電流放大的信號以適當(dāng)方式顯示或記錄下來。通常使用懸鏡式光電反射檢流計(jì)測定產(chǎn)生的光電流。檢流計(jì)光點(diǎn)偏轉(zhuǎn)刻度直接標(biāo)為吸光度和透光率，測定時可直接讀出。 二、幾種常用的分光光度計(jì)（一）721 型分光光度計(jì) 由光源 1 發(fā)出的光照射到聚

23、光透鏡 2 上，會聚后經(jīng)反射鏡 7 轉(zhuǎn)角 90后，反射至入射狹縫 6，再經(jīng)狹縫射至準(zhǔn)光鏡 4，被 4 反射以一束平行光射向色散棱鏡 3，光線進(jìn)入 3 被色散后依原路稍偏轉(zhuǎn)一個角度反射回來，這樣從色散棱鏡 3 色散后出來的光線再經(jīng)過準(zhǔn)光鏡 4 反射后就會聚在出射狹縫 6 上，經(jīng)聚光透鏡 9 后，照射在吸收池 10 上，未被吸收的光通過光門 11 照射在光電管 13 上。圖 19-7 721 型分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)簡圖（二）751 型分光光度計(jì) 光源 2 發(fā)出的光經(jīng)凹面鏡 3 反射成平行光，到達(dá)平面反光鏡 7 轉(zhuǎn)角 90，通過狹縫 6 至準(zhǔn)直鏡 5，進(jìn)入石英棱鏡 4，色散后再經(jīng)準(zhǔn)直鏡 5 聚焦至出光狹縫 6，經(jīng)透鏡 9 后通過吸收池 8，透射光進(jìn)入光電管 10 或