細胞生物學實驗技術

1、METHODS AND TECHNIQUES本章內容提要 第一節(jié)第一節(jié) 顯微技術顯微技術 一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡 二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 三、顯微操作技術三、顯微操作技術 第二節(jié)第二節(jié) 生物化學與分子生物學技術生物化學與分子生物學技術 第三節(jié)第三節(jié) 細胞分離技術細胞分離技術 第四節(jié)第四節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞雜交細胞培養(yǎng)與細胞雜交第一節(jié) 顯微技術光學顯微鏡與電子顯微鏡、光學顯微鏡（一）普通光學顯微鏡 1. 構成： 照明系統(tǒng) 光學放大系統(tǒng) 機械裝置 2. 原理：經物鏡形成倒立實像，經目鏡放大成虛像。Structure of MicroscopeLight Pathway of Micros

2、cope 3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 光學顯微鏡的分辨力光學顯微鏡的分辨力 R=0.61/NA 其中其中為入射光線波長；為入射光線波長； NA為鏡口率為鏡口率 sin/2； n=介質折射率； =鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。表一、幾種介質的折射率 顯微鏡的幾個光學特點：顯微鏡的幾個光學特點： 介質折射率越接近鏡頭玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin /2的最大值小于1；鏡口率最大約1.6； 普通光線的波長為400700nm，光鏡分辨力約為0.2m，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope特

3、點：光源為短波光；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green 用于觀察能激發(fā)出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描； 能顯示細胞樣品的立體結構； 分辨力是普通光學顯微鏡的3倍； 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。laser confocal scanning microscope, LCSM激光共聚焦掃

4、描顯微鏡光路圖（四）暗視野顯微鏡 dark field microscope 聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，物體邊緣是亮的。 可觀察 4200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。（五）相差顯微鏡 把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。1. 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。2. 相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。原理用途：

5、觀察未經染色的玻片標本。（六）偏光顯微鏡polarizing microscope 用于檢測具有雙折射性的物質，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。 進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器 （與起偏器方向垂直的偏振片）。 載物臺可以旋轉。淀粉（七）微分干涉差顯微鏡 Differential interference contrast microscope （DIC） 1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結構的三維立體投影。標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。（八）倒置顯微鏡 inverse microscope 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒

6、； 用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。 （九）當代顯微鏡的發(fā)展趨勢 采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體； 自動化與電子化。二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM1. 原理 以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比； 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構成； 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍； 用于觀察超微結構（小于0.2m）。表二、不同光線的波長TEM L

7、IGHT PATHWAYTRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM2. 制樣技術 1）超薄切片）超薄切片 超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。2）負染技術 用重金屬鹽(如磷鎢酸) 染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達1.5nm左右。Negative Stained Archaebacteria 3）冰凍蝕刻 freeze-etching亦稱冰凍斷

8、裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結構。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。an onion root tip cell with no etching. 斷面的三種處理方法： 蝕刻（ etching ）、不蝕刻（no etching ）、深度蝕刻（deep etching ）培養(yǎng)細胞內面的深度蝕刻電鏡照片，示 Clathrin衣被（二）掃描電子顯微鏡 20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結構； 分辨力為610nm，因人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為

9、0.2mm/10nm=20000X。Scanning electron microscope（ SEM） 工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。SEM LIGHT PATHWAY人類紅細胞人類紅細胞酵母酵母人類精子人類精子（三）掃描隧道顯微鏡scanning tunneling microscope，STM 原理：根據(jù)隧道效應設計

10、，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率：橫向為0.10.2nm，縱向可達0.01nm。 用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察。掃描隧道顯微鏡原理STM image of a DNA moleculeSchematic drawing of AFM三、顯微操作技術micromanipulation technique 是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。 包括細胞核

11、移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。 細胞核移植技術已有幾十年的歷史，1952 年，Briggs和King等將不同階段的蛙胚細胞核注入去核的蛙卵，構建核移植胚。Gordon（1962）證明原腸胚以后的細胞核移植能發(fā)育到成體。1997年，Wilmut等克隆了綿羊Dolly。 顯微操作儀顯微操作儀轉基因顯微操作過程 第二節(jié) 生物化學與分子生物學技術一、細胞化學技術一、細胞化學技術組織化學和細胞化學染色方法用于對某些細胞成分進行定性和定位研究。（一）固定（一）固定1. 物理固定：血膜空氣干燥、冷凍干燥。2. 化學固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定

12、，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。（二）顯示方法1.金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。2.Schiff反應：醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。3.聯(lián)苯胺反應：過氧化酶分解H202。產生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。4.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。5.茚三酮反應：顯示蛋白質。二、免疫細胞化學 immunocytochemistry 是利用抗體同特定抗原專一結合的原理，對抗原進行定位測定的技術。常用的標記物有熒光素和酶。 免疫熒光法

13、（immunofluorescent technique）：如異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標免疫法（enzyme-labeled antibody method）：如辣根過氧化物酶。三、放射自顯影術 用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。 原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內，經過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經放射性曝光，使乳膠感光。 一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。四

14、、分子雜交技術 具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系。 （一）原位雜交（一）原位雜交（in situ hybridization）。）。 用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片 （二）Southern雜交 是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經凝膠電泳分離后，轉移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過

15、放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。 將RNA轉移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。六、PCR 技術 PCR即：polymerase chain reaction。 反應體系：樣品DNA；引物（primer），約15-20個核苷酸；4種dNTP；Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌Thermus aquaticus，最適作用溫度7580，短時間在95下不失活。緩沖體系和Mg2+。 反應過程：變性：約90-95；復性：約60左右；延伸：70-75；重復 “變性復性延伸” 過程20-30次循環(huán)。PCR原理第三節(jié) 細胞分離技術一、離心技術 是分離細胞器及各種大分子基本手

16、段。 轉速1025kr/min的離心機稱為高速離心機。 轉速25kr/min，離心力89Kg者稱為超速離心機。 超速離心機的最高轉速可達100000r/min，離心力超過500kg。 （一）差速離心 Differential centrifugation 特點： 介質密度均一； 速度由低向高，逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內質網與高基體核蛋白體。 可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation（二）密度梯度離心 用介質在離心管內形

17、成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過離心力場的作用使細胞和細胞成分分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的介質要求： 1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）PH中性或易調為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細胞無毒。1. 速度沉降 velocity sedimentation 用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質密度較低，介質的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。2.等密度沉降 isopycnic

18、sedimentation 用途：分離密度不等的顆粒。 特點： 介質密度高，陡度大，介質最高密度大于被分離組分的最大密度。 力場比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質中經過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation二、流式細胞術 用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選快速定量分析與分選的一門技術。 原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光

19、，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果，并可根據(jù)這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flow cytometer）。三、細胞電泳 原理：在一定PH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。 各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同 。 用途：檢測細胞生理狀態(tài)、分離不同種類的細胞。第四節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞雜交一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)（一）動物細胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng)群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合

20、（confluence）后形成均勻的單細胞層； 克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) （primary culture）：即：培養(yǎng)來自動物機體的細胞群。將細胞轉移到新的容器中培養(yǎng)稱為傳代或傳代培養(yǎng)（passage），每代細胞分裂約3-6次。細胞系細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)細胞成功傳代即為細胞系。細胞株細胞株（cell strain）：從培養(yǎng)細胞中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群。 克隆克隆（clone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。表三、實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞Henrietta Lacks BHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP20骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 （二）植物細胞培養(yǎng)1.外植