固定化酶和固定化細(xì)胞ppt課件

1、主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 1 固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn) 2 酶固定化技術(shù)開展史酶固定化技術(shù)開展史 3 固定化酶的制備方法固定化酶的制備方法 4 固定化酶的特性固定化酶的特性 5 固定化活細(xì)胞固定化活細(xì)胞 6 酶催化反響器及其類型酶催化反響器及其類型游離酶的運(yùn)用游離酶的運(yùn)用蒸汽酶解罐簡易圖加熱滅酶酶無法回收穩(wěn)定性差1 固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)v所謂固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和延續(xù)運(yùn)用的酶。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：1同一批固定化酶能在工藝流程中反復(fù)多次地運(yùn)用；2固定化后，和反響物分開，有利于控制消

2、費(fèi)過程，同時(shí)也省去了熱處置使酶失活的步驟；3穩(wěn)定性顯著提高；4可長期運(yùn)用，并可預(yù)測(cè)衰變的速度；5提供了研討酶動(dòng)力學(xué)的良好模型。2 酶固定化技術(shù)開展史 起始研討起始研討1916年年系統(tǒng)研討系統(tǒng)研討1950年年-工業(yè)化運(yùn)用工業(yè)化運(yùn)用1969年年-1916年，Nelson和Griffin將蔗糖酶吸附在骨炭粉上，吸附以后酶不溶于水且具有和液體酶同樣的活性，實(shí)現(xiàn)了酶的固定化，惋惜長期未得到注重。1953年Grubhofer和Schleith將聚氨基苯乙烯樹脂重氮化，然后將淀粉酶等與這種載體結(jié)合，制成了固定化酶。60年代后期，酶固定化技術(shù)迅速開展，出現(xiàn)了很多新的酶固定化方法。1969年，千畑一郎等將固定化

3、氨基?；高\(yùn)用于DL-氨基酸的光學(xué)拆分上，來消費(fèi)L-氨基酸，開創(chuàng)了固定化酶運(yùn)用于工業(yè)消費(fèi)的先例。 1973年，將固定化微生物細(xì)胞初次運(yùn)用于工業(yè)消費(fèi)。v 目前，固定化技術(shù)曾經(jīng)獲得了許多重要成果，充分發(fā)揚(yáng)了固定化酶和固定化細(xì)胞在改革工藝和降低本錢方面的宏大潛力。v 但從目前的開展情況來看，雖然酶種類繁多，但曾經(jīng)固定化的酶卻相對(duì)有限，采用固定化酶技術(shù)大規(guī)模消費(fèi)的企業(yè)尚屬少數(shù)，真正在工業(yè)上運(yùn)用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數(shù)不多的十幾個(gè)酶種，故仍需大力研討開發(fā)使更多的固定化酶和細(xì)胞能適用于工業(yè)規(guī)模消費(fèi)。運(yùn)用現(xiàn)狀：運(yùn)用現(xiàn)狀：3 固定化酶的制備方法v酶的固定化方法主要可分為

4、四類：吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法和交聯(lián)法。v對(duì)于特定的目的酶，要根據(jù)酶本身的性質(zhì)、運(yùn)用目的、運(yùn)用環(huán)境來選擇固定化載體和方法。在詳細(xì)選擇時(shí)，普通應(yīng)遵照以下在詳細(xì)選擇時(shí)，普通應(yīng)遵照以下6個(gè)原那么。個(gè)原那么。 v 1酶與載體的結(jié)合部位不該當(dāng)是酶的活性部位，固定化時(shí)應(yīng)采取盡能夠溫暖的條件。v 2酶與載體必需有一定的結(jié)合程度，利于反復(fù)運(yùn)用。v 3用于固定化的載體必需有一定的機(jī)械強(qiáng)度，不易破壞或受損。v 4固定化應(yīng)盡能夠不妨礙酶與底物的接近，以提高催化效率和產(chǎn)物的量。v 5所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反響液發(fā)生化學(xué)反響。v 6固定化酶的本錢適中，以利于工業(yè)運(yùn)用。3.1吸附法v吸附法是經(jīng)過載體外表和酶分子外

5、表間的次級(jí)鍵相互作用而到達(dá)固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。v酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。v吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。 v 物理吸附法是經(jīng)過物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體外表上而使酶固定化的方法。是制備固定化酶最早采用的方法。v 常用的載體：纖維素、膠原、淀粉及面筋、活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。v 優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、價(jià)廉、條件溫暖，載體可反復(fù)運(yùn)用，酶與載體結(jié)合后，活性部位及空間構(gòu)象變化不大，固定化酶活力較高。v 缺陷：酶和載體結(jié)合不結(jié)實(shí)，在運(yùn)用過程中容易零落，常與交聯(lián)法結(jié)合運(yùn)用。1物理吸附法物理吸附法v離子

6、吸附法(ion adsorption)是將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法，即經(jīng)過離子鍵使酶與載體相結(jié)合的固定化方法。vDEAE-纖維素吸附的-淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。 v具有操作簡便、條件溫暖、酶活力不易喪失等優(yōu)點(diǎn)。此外，吸附過程同時(shí)可以純化酶。2離子吸附法離子吸附法3.2包埋法v包埋法是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。1凝膠包埋法凝膠包埋法 凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚

7、乙烯醇和光交聯(lián)樹脂等合成凝膠或樹脂。 1-2%1-2%海藻酸鈉海藻酸鈉+ +酶液酶液EEEE5%CaCl25%CaCl2溶液溶液2微膠囊包埋法微膠囊包埋法 v微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。v它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的零落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而添加了酶的穩(wěn)定性。v常用于制造微膠囊的資料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。 v適宜于小分子為底物和產(chǎn)物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、過氧化氫酶等。3.3共價(jià)鍵結(jié)合法v共價(jià)鍵結(jié)合法(covalent binding是將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有

8、以下幾種：v1酶蛋白N末端的-氨基或賴氨酸殘基的-氨基。2酶蛋白C末端的-羧基、天門冬氨酸殘基的-羧基以及谷氨酸殘基的-羧基。3半胱氨酸殘基的巰基。4絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。5組氨酸殘基的咪唑基。6色氨酸殘基的吲哚基。7苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。v其中最普遍的共價(jià)鍵結(jié)合基團(tuán)是氨基、羧基以及苯環(huán)。常用來和酶共價(jià)偶聯(lián)的載體的功能基團(tuán)有芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。這種方法是固定化酶研討中最活潑的一大類方法，v但必需留意，參與共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基該當(dāng)是酶催化活性非必需基團(tuán)，如假設(shè)共價(jià)結(jié)合包括了酶活性中心有關(guān)的基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致酶的活力損失。v 用共價(jià)鍵結(jié)合法制備的固定化酶，酶和載體之間都是經(jīng)

9、過化學(xué)反響以共價(jià)鍵偶聯(lián)。由于共價(jià)鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)結(jié)實(shí)，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會(huì)使酶分子從載體上零落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可延續(xù)運(yùn)用較長時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。 v 但是采用該方法時(shí)，載體活化的難度較大，操作復(fù)雜，反響條件較猛烈，制備過程中酶直接參與化學(xué)反響，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化，酶活回收率普通為30%左右，甚至酶的底物的專注性等性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，往往需求嚴(yán)厲控制操作條件才干獲得活力較高的固定化酶。 3.4交聯(lián)法v 交聯(lián)法交聯(lián)法cross-linking是運(yùn)用雙功能或多功能試劑使酶是運(yùn)用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀構(gòu)造的固定化方法。分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀構(gòu)造

10、的固定化方法。v 由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基等參與反響，所由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基等參與反響，所以酶的活性中心構(gòu)造能夠遭到影響，使酶明顯失活。以酶的活性中心構(gòu)造能夠遭到影響，使酶明顯失活。v 常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯(lián)苯和氮聯(lián)苯和N,N-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等，其中運(yùn)用最廣泛乙烯雙順丁烯二酰亞胺等，其中運(yùn)用最廣泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反響，反響，構(gòu)成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)構(gòu)成固定化酶。構(gòu)成薛夫堿，從而使酶

11、分子之間相互交聯(lián)構(gòu)成固定化酶。以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺陷見表以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺陷見表4-1。往往一種酶可以用。往往一種酶可以用不同方法固定化，但沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。不同方法固定化，但沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。在實(shí)踐運(yùn)用時(shí)，常將兩種或數(shù)種固定化方法并用，以取長補(bǔ)短。在實(shí)踐運(yùn)用時(shí)，常將兩種或數(shù)種固定化方法并用，以取長補(bǔ)短。4 固定化酶的特性4.1固定化酶的外形v固定化酶的方式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等外形。v其中顆粒占絕大多數(shù)，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵消費(fèi)，如裝成酶柱用于延續(xù)消費(fèi)，或在反響器中進(jìn)展批式攪拌反響；v薄膜主要用

12、于酶電極，運(yùn)用于分析化學(xué)；v酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，亦宜用于工業(yè)消費(fèi)。4.2酶活力v固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其緣由能夠是：v酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合；v當(dāng)酶與載體結(jié)合時(shí)，它的高級(jí)構(gòu)造發(fā)生了變化；v酶與底物間的相互作用遭到空間位阻的影響。v也有在個(gè)別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高，能夠是由于固定化后酶的抗抑才干提高使得它反而比游離酶活力高。4.3固定化酶的穩(wěn)定性 普通情況下，半衰期在一個(gè)月以上，即有工業(yè)運(yùn)用價(jià)值。大多數(shù)酶在固定化后，熱穩(wěn)定性提高，但有些酶采用吸附法固定化時(shí)會(huì)降低。可延伸酶的貯藏有效期。假設(shè)貯藏條件比較好，亦可較長時(shí)間堅(jiān)持活力。由于酶固定化后遭到

13、空間位阻的影響，蛋白酶不能有效接觸，因此抵抗力提高。多數(shù)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性提高。極少數(shù)酶固定化后由于酶活性構(gòu)象的敏感區(qū)遭到牽連導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。4.4固定化酶的反響特性v 固定化酶的反響特性，例如，底物特異性、酶反響的最適pH、酶反響的最適溫度、動(dòng)力學(xué)常數(shù)、最大反響速度等均與游離酶有所不同。1底物特異性底物特異性v 固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一定關(guān)系。普通來說，當(dāng)酶的底物為小分子化合物時(shí)，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生變化。v 而當(dāng)酶的底物為大分子化合物時(shí)，如蛋白酶、-淀粉酶、磷酸二酯酶等，普通隨著底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。v 這是由于載體引起的空間位阻作用，

14、使大分子底物難以與酶分子接近而無法進(jìn)展催化反響，酶的催化活力難以發(fā)揚(yáng)出來，催化活性大大下降。v 例如，糖化酶用CMC疊氮衍生物固定化時(shí)，對(duì)分子量8000的直鏈淀粉的活性為游離酶的77，而對(duì)分子量為50萬的直鏈淀粉的活性只需15%17。2反響的最適反響的最適pHv酶被固定后，其最適pH和pH曲線常會(huì)發(fā)生偏移。v普通來說，產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適pH與游離酶相比升高；產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶的最適pH與游離酶相比降低。3反響的最適溫度反響的最適溫度 v 固定化酶的最適反響溫度多數(shù)較游離酶高。v如色氨酸酶經(jīng)共價(jià)結(jié)合后最適溫度比固定前提高515，但也有不變甚至降低的。固定化酶的作用最適溫度會(huì)受固定化

15、方法以及固定化載體的影響。 4米氏常數(shù)米氏常數(shù)v酶經(jīng)固定化后，酶蛋白分子的高級(jí)構(gòu)造的變化以及載體電荷的影響可導(dǎo)致底物和酶的親合力的變化。v運(yùn)用載體結(jié)合法制成的固定化酶Km有時(shí)變動(dòng)的緣由，主要是由于載體與底物間的靜電相互作用的緣故。5最大反響速度最大反響速度 固定化酶的最大反響速度與游離酶大多數(shù)是一樣的。有些酶的最大反響速度會(huì)因固定化方法的不同而有所差別。5 固定化活細(xì)胞v 20世紀(jì)70年代，在固定化酶的根底上科學(xué)家們研制成固定化細(xì)胞Immobilized Cell，并且用于消費(fèi)。v 直接固定那些含有所需胞內(nèi)酶的細(xì)胞，并且利用這樣的細(xì)胞來催化化學(xué)反響。v 70年代末，法國研討勝利固定化細(xì)胞消費(fèi)啤

16、酒，80年代初我國居乃琥等用固定化細(xì)胞批量消費(fèi)啤酒和酒精獲得重要研討成果。 v 固定化細(xì)胞按其生理形狀又可分為固定化死細(xì)胞和活細(xì)胞兩大類。固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)和缺陷：固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)和缺陷：固定化活細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)缺陷必需堅(jiān)持菌體的完好，防止菌體的自溶，否那么影響產(chǎn)物的純度；必需抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)目的酶的分解；胞內(nèi)多酶的存在，會(huì)構(gòu)成副產(chǎn)物；載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會(huì)呵斥底物浸透與分散的妨礙等。無需進(jìn)展酶的分別和純化，減少酶活損失，降低本錢； 可進(jìn)展多酶反響，且不需添加輔助因子；活細(xì)胞堅(jiān)持了酶的原始形狀，穩(wěn)定性更高，對(duì)污染的抵抗力更強(qiáng)；細(xì)胞生長停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反響快等等。物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法 6

17、 酶催化反響器及其類型以酶為催化劑進(jìn)展反響所需求的設(shè)備稱之為酶催化反響器，簡稱酶反響器。6.1酶反響器的類型v 酶反響器有兩種類型：v 一類是直接用游離酶進(jìn)展反響，即均相酶反響器；v 另一類是運(yùn)用固定化酶進(jìn)展的非均相酶反響器。v 均相酶反響能在批量式攪拌桶反響器或超濾膜反響器中進(jìn)展，而非均相酶反響那么可在多種反響器中進(jìn)展，適用于延續(xù)催化反響，包括：延續(xù)流攪拌桶反響器、填充床反響器、流化床反響器、延續(xù)攪拌桶-超濾和循環(huán)式反響器等。 6.2反響器的構(gòu)造特點(diǎn)反響器的構(gòu)造特點(diǎn) v 這類反響器構(gòu)造簡單，造價(jià)較低，傳質(zhì)阻力很小，反響能迅速到達(dá)穩(wěn)態(tài)，主要運(yùn)用在飲料等食品工業(yè)中。v 其缺陷是操作費(fèi)事，在反復(fù)回

18、收過程中固定化酶容易損失，所以工業(yè)規(guī)模的固定化酶很少采用。但是，常用于游離酶。圖圖4-2 批量式攪拌桶反響器批量式攪拌桶反響器6.2.1 批量式攪拌桶反響器v 這種反響器在運(yùn)轉(zhuǎn)過程中，底物以恒定的流速流入反響器，與此同時(shí)，反響液那么以同樣的流速流出反響器。反響桶內(nèi)裝有攪拌器，使反響組分與固定化酶顆粒混合均一，出口處有過濾膜，可使不斷補(bǔ)充新穎底物與反響液流量維持動(dòng)態(tài)平衡，如圖4-3。 6.2.2 延續(xù)流攪拌桶反響器圖圖4-3 延續(xù)流攪拌桶反響器延續(xù)流攪拌桶反響器6.2.3 填充床反響器圖4-4填充床反響器PBR具有高效率、易操作、構(gòu)造簡單等優(yōu)點(diǎn)。它適用于各種外形的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大

19、的底物溶液，以及有產(chǎn)物抑制的轉(zhuǎn)化反響。其缺陷是傳質(zhì)系數(shù)和傳熱系數(shù)相對(duì)較低。當(dāng)?shù)孜锶芤汉腆w顆?；蝠ざ群艽髸r(shí)，不宜采用目前工業(yè)消費(fèi)及研討中運(yùn)用最為普遍的反響器。目前工業(yè)消費(fèi)及研討中運(yùn)用最為普遍的反響器。6.2.4 流化床反響器圖4-5 流化床反響器主要被用來處置一些粘度高的液體和顆粒細(xì)小的底物，如用于水解牛乳中的蛋白質(zhì)。同時(shí)，亦可用于需求供氣體或排放氣體的酶反響即固、液、氣三相反響。但因FBR混合均勻，故不適用于有產(chǎn)物抑制的酶反響。 6.2.5 延續(xù)攪拌桶-超濾反響器(CSTRUF)圖4-6 延續(xù)攪拌桶-超濾反響器適用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。如：纖維素的延續(xù)

20、糖化、-淀粉酶水解淀粉6.2.6 循環(huán)反響器Recycle Reactor，RCR外循環(huán)反響器 內(nèi)循環(huán)反響器 循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸時(shí)機(jī)，以到達(dá)所需的轉(zhuǎn)化率。這種反響器觸時(shí)機(jī)，以到達(dá)所需的轉(zhuǎn)化率。這種反響器可用于難溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反響?？捎糜陔y溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反響。 6.3膜式反響器膜式反響器v 膜式反響器是20世紀(jì)70年代以來開展起來的一種新型反響器，它是利用膜的分別功能，同時(shí)完成反響和分別過程的一種反響器。v 6.3.1膜式反響器的類型：v 根據(jù)酶的存在形狀、相數(shù)、膜組件型式、膜資料類型、耦合方式、傳質(zhì)推進(jìn)力等的不同，酶膜反響器有

21、不同的分類方式。根據(jù)膜組件的型式不同，可把酶膜反響器分為板框式、螺旋卷式、管式和中空纖維式酶膜反響器。以下以螺旋卷膜式反響器和中空纖維膜式反響器為例來闡明。1螺旋卷膜式反響器螺旋卷膜式反響器 v 此反響器的螺旋構(gòu)造是將含酶的膜片與支持資料交替地纏繞在中心棒上。所用的膜片普通是膠原蛋白；而支持資料那么是一種稱為凡克塞的惰性聚合網(wǎng)狀物。v 把上述螺旋元件裝進(jìn)圓筒，筒兩端加蓋板，并安裝進(jìn)出口管，這樣，就制成了螺旋卷膜式反響器。v 螺旋模型可將流體流動(dòng)的單元分隔成許多獨(dú)立空間，改善接觸效果，消除短路；v 另外，網(wǎng)狀支持資料可以提高每一流動(dòng)間隔的混合效果，加快物質(zhì)傳送。2中空纖維膜式反響器中空纖維膜式反響器外層：中空纖維膜中空纖維膜 水和小分子產(chǎn)物多孔海綿狀的支持層固定酶半透性膜大分子底物用這種固定化酶填充的反響器可以提供較大的催化外表，缺陷：中空纖維的制造極為困難，難以保證纖維束內(nèi)流體流動(dòng)的均勻性，以及存在較大的物質(zhì)傳送阻力等。6.3.2 膜式反響器的特點(diǎn)1膜的選擇透過性使某些組分膜的選擇透過性使某些組分(如產(chǎn)物如產(chǎn)物)延續(xù)脫除，使反響轉(zhuǎn)化率不受延續(xù)脫除，使反響轉(zhuǎn)化率不受化學(xué)平衡轉(zhuǎn)化率的限制，提高了反響的轉(zhuǎn)化率?；瘜W(xué)平衡轉(zhuǎn)化率的限制，提高了反響的轉(zhuǎn)化率。2酶膜反響器可將目的產(chǎn)物分別出去，而酶可以反復(fù)利用，可實(shí)現(xiàn)延酶膜反響器可將目的產(chǎn)物分別出去，而酶可以反復(fù)利