任務(wù)1-2-1谷氨酸生產(chǎn)菌

1、 任務(wù)任務(wù)1-2谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸生產(chǎn)菌1 1 2 2 3 3 4 4 谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸生產(chǎn)菌國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌特性比較國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌特性比較谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略5 5 6 6 菌種的擴大培養(yǎng)及種子的質(zhì)量要求菌種的擴大培養(yǎng)及種子的質(zhì)量要求 菌種的保藏與復(fù)壯菌種的保藏與復(fù)壯一、谷氨酸生產(chǎn)菌種類與特征一、谷氨酸生產(chǎn)菌種類與特征一）現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類一）現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌小桿菌屬及節(jié)

2、桿菌屬中的細(xì)菌。屬中的細(xì)菌。 1. 1. 棒狀桿菌屬棒狀桿菌屬( (CorynebacteriumCorynebacterium) )直到微彎的桿菌，一直到微彎的桿菌，一端膨大呈棒狀，折斷端膨大呈棒狀，折斷分裂形成分裂形成“八八”字形字形或柵狀排列。葡萄糖或柵狀排列。葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，發(fā)酵產(chǎn)酸，G G+ +2 2 短桿菌屬短桿菌屬( (BrevibacteriumBrevibacterium) ) 短的不分枝直桿菌。短的不分枝直桿菌。多數(shù)從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，多數(shù)從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖。不發(fā)酵乳糖。 G G+ +3 3 小桿菌屬小桿菌屬( (MicrobacteriumMicrobacteri

3、um) ) 形態(tài)與棒狀桿菌相似。形態(tài)與棒狀桿菌相似。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸弱，主發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸弱，主要產(chǎn)乳酸。要產(chǎn)乳酸。 G G+ +4 4 節(jié)桿菌屬節(jié)桿菌屬( (ArthrobacteriumArthrobacterium) ) 培養(yǎng)過程中，細(xì)胞形態(tài)變化較大培養(yǎng)過程中，細(xì)胞形態(tài)變化較大球菌球菌 桿菌，桿菌桿菌，桿菌 球菌。球菌。 G G+ + G G- - , G , G- - G G+ + 能液化明膠，能液化明膠，從碳水化合物從碳水化合物產(chǎn)酸極少或不產(chǎn)酸極少或不產(chǎn)酸。產(chǎn)酸。二）谷氨酸生成菌的主要特征二）谷氨酸生成菌的主要特征（1 1）細(xì)胞形態(tài)球形、棒狀以及短桿狀。）細(xì)胞形態(tài)球形、棒狀以及短桿狀。（

4、2 2）G G+ +，無芽孢、無鞭毛，不能運動。，無芽孢、無鞭毛，不能運動。（3 3）需氧型、生物素缺陷型微生物。）需氧型、生物素缺陷型微生物。（4 4）脲酶強陽性脲酶強陽性（5 5）不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白）不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白以及明膠。以及明膠。（6 6）發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同）發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化。時發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化。（7 7）COCO2 2固定反應(yīng)酶系活力強。固定反應(yīng)酶系活力強。（8 8）異檸檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循環(huán)）異檸檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循環(huán)弱。弱。（9 9）- -酮戊二酸氧化能力微弱。酮戊二酸氧化能力

5、微弱。（1010）NADPH2NADPH2進(jìn)入呼吸鏈能力弱。進(jìn)入呼吸鏈能力弱。（1111）檸檬酸合成酶、烏頭酸梅、異檸檬）檸檬酸合成酶、烏頭酸梅、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強。酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強。（1212）能利用醋酸，不能利用石蠟。）能利用醋酸，不能利用石蠟。（1313）具有向環(huán)境中泄露谷氨酸的能力。）具有向環(huán)境中泄露谷氨酸的能力。（1414）不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度）不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5%5%以上。以上。二、國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌特性比較二、國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌特性比較 1 1、形態(tài)特征、形態(tài)特征 短桿至小棒狀，有時微彎曲，兩

6、端鈍圓，不短桿至小棒狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，呈多種形態(tài)。分枝，呈多種形態(tài)。 單個、成對及單個、成對及“V V”字形排列。字形排列。 G+G+。胞內(nèi)有橫隔。不運動。無芽孢。胞內(nèi)有橫隔。不運動。無芽孢。一）北京棒桿菌一）北京棒桿菌(AS1299)(AS1299)的形態(tài)和生理特征的形態(tài)和生理特征2 2、培養(yǎng)特征、培養(yǎng)特征普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形， 24h24h白白色，色，48h48h淡黃色，中央隆起，表面濕潤、淡黃色，中央隆起，表面濕潤、光滑，有光澤，邊緣整齊且呈半透明狀，光滑，有光澤，邊緣整齊且呈半透明狀，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。

7、3 3、生理特征、生理特征 對氧的要求：好氧及兼性厭氧。 與溫度的關(guān)系：菌株2637 培養(yǎng)生長良好，不耐高溫，41 生長較弱。 pH的影響： Ph510均能生長，最適 pH67.5。 還原硝酸鹽：反映強烈。 石蕊牛奶培養(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿。 不水解淀粉，不分解纖維素。 對尿素的耐力，2.6%以上生長受抑制。 脲酶試驗：強陽性反應(yīng)。 產(chǎn)酸物質(zhì)的測定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖迅速產(chǎn)酸。 生長因素試驗：生物素是必需生長因素。硫胺素明顯促生長。二）鈍齒棒桿菌二）鈍齒棒桿菌(AS1542)(AS1542)的形態(tài)和生理特征的形態(tài)和生理特征1 1、 形態(tài)特征形態(tài)特征 短桿至棒狀，有時微彎曲，兩端鈍短桿至棒

8、狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝。單個、成對及圓，不分枝。單個、成對及“V V”字形排字形排列。列。 折斷分裂。折斷分裂。 G G+ +。胞內(nèi)有橫隔。不運動。無芽孢。胞內(nèi)有橫隔。不運動。無芽孢。2 2、 培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，近草黃色，普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，近草黃色， 表面濕潤、光滑，無光澤，邊緣頓齒狀，較表面濕潤、光滑，無光澤，邊緣頓齒狀，較薄，半透明，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。薄，半透明，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。 對氧的要求：兼性厭氧。 與溫度的關(guān)系：菌株2037 培養(yǎng)生長良好，不耐高溫，42 不生長。 pH的影響： pH69生長良好， pH10生長微弱， p

9、H45已不能生長。 還原硝酸鹽：反映強烈。 石蕊牛奶培養(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿。 水解淀粉，不分解纖維素。 對尿素的耐力，2.6%以上生長受抑制。 脲酶試驗：強陽性反應(yīng)。 產(chǎn)酸物質(zhì)的測定： G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈等迅速產(chǎn)酸。 生長因素試驗：生物素是必需生長因子。3 3、生理特征、生理特征三）天津短桿菌三）天津短桿菌(T613)(T613)的形態(tài)和生理特征的形態(tài)和生理特征典型的短桿狀，有時微彎曲，兩端稍典型的短桿狀，有時微彎曲，兩端稍鈍圓，不分枝。單個、成對及鈍圓，不分枝。單個、成對及“V V”字字形排列。折斷分裂。形排列。折斷分裂。 G G+ +。不運動。無芽孢。不運動。無芽孢

10、。1 1、形態(tài)特征、形態(tài)特征2 2、培養(yǎng)特征、培養(yǎng)特征 普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，淺普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，淺黃色，黃色， 表面濕潤、光滑，隆起，邊緣表面濕潤、光滑，隆起，邊緣整齊，較薄，半透明，無黏性，不產(chǎn)生整齊，較薄，半透明，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。水溶性色素。3 3、生理特征、生理特征 對氧的要求：好氧及兼性厭氧。 與溫度的關(guān)系：菌株2637 培養(yǎng)生長良好，75 處理10min不再生長。 pH的影響： pH610生長良好， pH5生長微弱， pH4和pH11已不能生長。 還原硝酸鹽：反映強烈。 不水解淀粉，不分解纖維素。 對尿素的耐力，5%以上生長受抑制。 脲酶試驗：強陽性反應(yīng)。

11、 產(chǎn)酸物質(zhì)的測定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈 生長因素試驗：生物素是必需生長因子。硫胺素是促生長作用。四）北京棒桿菌四）北京棒桿菌(7338)(7338)與鈍齒棒桿與鈍齒棒桿菌菌(B9)(B9)的比較的比較菌 種 細(xì)胞大 小 細(xì)胞形 態(tài) 等 電 點 菌落顏 色 生物 素用 量 生 長 因子 發(fā)酵周 期 噬菌體類 型 7338 小 變化不 大 pH 3.0-4.2 接近 谷氨 酸 結(jié) 晶 等 電 點 乳白色 4-5ug/L 生 物 素和 硫 胺素 長 感染噬菌體的類型不同 ， 不 會交叉感染 B9 大 伸長膨 大 不 在 該pH范 圍 草黃色 5-8ug/L 生 物 素 短

12、后提取容后提取容易，收率易，收率較高，質(zhì)較高，質(zhì)量較好量較好分泌色分泌色素較多素較多2.5 2.5 天津短桿菌天津短桿菌(T613)(T613)與鈍齒桿與鈍齒桿菌菌(B9)(B9)的比較的比較 菌種 細(xì) 胞大小 細(xì) 胞形態(tài) 等電點 菌 落顏色 生 物素用量 糖 酸轉(zhuǎn) 化率 發(fā)酵溫度 噬 菌體 類型 T613 小 變 化更大 pH3.0-4.2 接 近谷氨酸結(jié)晶等電點 淡 白色 較B9低20-50% 高 前期32-34 中后期36-38 交 叉感染 B9 大 伸 長膨大 不在該 pH 范圍 草 黃色 5-8ug/L 低 前期30-32 中后期34-35 T613T613感染感染噬菌體時，噬菌體時

13、，不能換用不能換用B9B9，調(diào)換，調(diào)換7338.7338. 三、谷氨酸生產(chǎn)菌的篩選三、谷氨酸生產(chǎn)菌的篩選什么是篩選？什么是篩選？如何篩選？如何篩選？1.1.采樣采樣在哪采？如何采？2.2.分離分離分離什么？3.3.初篩初篩鑒別！4.4.復(fù)篩復(fù)篩產(chǎn)量！5.5.發(fā)酵實驗發(fā)酵實驗黃色短桿菌黃色短桿菌北京棒桿菌北京棒桿菌桿狀細(xì)菌四、菌種選育四、菌種選育谷氨酸菌體的選育方法主要有五谷氨酸菌體的選育方法主要有五種，種，自然選育、誘變選育、雜交自然選育、誘變選育、雜交選育、代謝控制選育和基因工程選育、代謝控制選育和基因工程選育。選育。一）自然選育一）自然選育以以基因自發(fā)突變基因自發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)。為基礎(chǔ)。有利于

14、谷氨酸產(chǎn)生菌保持純系良種有利于谷氨酸產(chǎn)生菌保持純系良種，使谷氨酸生產(chǎn)，使谷氨酸生產(chǎn)具有相對穩(wěn)定性，提高發(fā)酵水平。具有相對穩(wěn)定性，提高發(fā)酵水平。缺點：缺點：菌體自身存在著修復(fù)機制和某些酶的校正作菌體自身存在著修復(fù)機制和某些酶的校正作用，使得自發(fā)突變率極低，導(dǎo)致選育耗時長、工作用，使得自發(fā)突變率極低，導(dǎo)致選育耗時長、工作量大、效率低。量大、效率低。也稱自然分離，是指對微生物細(xì)胞群體不經(jīng)過人工也稱自然分離，是指對微生物細(xì)胞群體不經(jīng)過人工處理而直接進(jìn)行篩選的育種方法。處理而直接進(jìn)行篩選的育種方法。 二）誘變選育二）誘變選育 物理因素物理因素：紫外線、：紫外線、60Co、X射線、射線、-射線、快中射線、

15、快中子、子、-射線、射線、-射線、超聲波、射線、超聲波、He-Ne激光輻照、激光輻照、離子束等。離子束等。化學(xué)因素：化學(xué)因素：氮芥、亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺氮芥、亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基甲基脲、亞硝酸、酸乙酯、亞硝基甲基脲、亞硝酸、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶等。溴尿嘧啶等。其它因素其它因素：生物誘導(dǎo)因子，如噬菌體誘發(fā)抗性突變：生物誘導(dǎo)因子，如噬菌體誘發(fā)抗性突變等。等。 例：例：王歲樓；張一震；李志。谷氨酸高產(chǎn)菌王歲樓；張一震；李志。谷氨酸高產(chǎn)菌TZ-310TZ-310的誘變的誘變選育及其發(fā)酵的研究選育及其發(fā)酵的研究 。中國調(diào)味品中國調(diào)味品，19971997年年

16、0909期期 。 摘要：以天津短桿菌摘要：以天津短桿菌- -為出發(fā)菌株，經(jīng)為出發(fā)菌株，經(jīng)射線射線、紫外線紫外線和和硫酸二乙酯硫酸二乙酯復(fù)合誘變并經(jīng)高溫復(fù)合誘變并經(jīng)高溫馴化，獲得一株琥珀酸和生物素雙營養(yǎng)缺陷型突變株。馴化，獲得一株琥珀酸和生物素雙營養(yǎng)缺陷型突變株。該菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利該菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利用及耐高溫（用及耐高溫（）的優(yōu)點。）的優(yōu)點。原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合就是將兩個親株的細(xì)胞壁分別通過酶解就是將兩個親株的細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以剝除，制得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，在高滲條作用加以剝除，制得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，在高滲條件下混合，由聚乙二醇件下混

17、合，由聚乙二醇(PEG)助融，促使原生質(zhì)體凝助融，促使原生質(zhì)體凝集、融合，兩個基因組之間接觸、交換、遺傳重組，集、融合，兩個基因組之間接觸、交換、遺傳重組，在再生細(xì)胞中獲得重組體。在再生細(xì)胞中獲得重組體。 三）雜交育種三）雜交育種雜交育種雜交育種常規(guī)雜交常規(guī)雜交原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合谷氨酸產(chǎn)生菌的前處理谷氨酸產(chǎn)生菌的前處理因為其有著特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對溶菌酶一般不因為其有著特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對溶菌酶一般不敏感。敏感。方法：加入方法：加入EDTA（乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸 ）、甘氨酸、青霉）、甘氨酸、青霉素和素和D-環(huán)絲氨酸等，這些物質(zhì)可以使細(xì)胞壁變得環(huán)絲氨酸等，這些物質(zhì)可以使細(xì)胞壁變得疏松，

18、便于溶菌酶處理。疏松，便于溶菌酶處理。如，李蒲興等將如，李蒲興等將6株谷氨酸產(chǎn)生菌以株谷氨酸產(chǎn)生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶的甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同組合不同組合處理處理，對其原生質(zhì)體形成進(jìn)行比較，對其原生質(zhì)體形成進(jìn)行比較，在最佳條件下，原生質(zhì)體在最佳條件下，原生質(zhì)體形成率形成率可達(dá)可達(dá)95100。 張蓓等以谷氨酸產(chǎn)生菌天津短桿菌張蓓等以谷氨酸產(chǎn)生菌天津短桿菌T6-13為出發(fā)菌株，獲得了具有目的遺傳為出發(fā)菌株，獲得了具有目的遺傳標(biāo)記寡霉素抗性標(biāo)記寡霉素抗性(Orm)和氟乙酸抗性和氟乙酸抗性(FEAr)的突變株的突變株TN63和和TN115。然后，。然后，分別以分別以TN63和和TN115為親

19、株，通過原為親株，通過原生質(zhì)體融合，獲得了具有生質(zhì)體融合，獲得了具有Orm +FEAr標(biāo)標(biāo)記的融合子記的融合子FTN9108，其原生質(zhì)體融，其原生質(zhì)體融合頻率為合頻率為2.610-3。OrmFEAr+OrmFEArOrmFEAr四）代謝控制選育四）代謝控制選育 以誘變育種為基礎(chǔ)，獲得以誘變育種為基礎(chǔ)，獲得各種解除或繞過微生物正各種解除或繞過微生物正常代謝途徑的突變株，從常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產(chǎn)物選擇而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量生成積累。性地大量生成積累。 Glu產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌誘變育種誘變育種突變株突變株代謝控制發(fā)酵代謝控制發(fā)酵大量積累大量積累Glu1.選育耐高糖、高谷氨酸的菌株選

20、育耐高糖、高谷氨酸的菌株 如選育在含如選育在含2030葡萄糖的平板上生長良好的葡萄糖的平板上生長良好的耐高糖突變株；耐高糖突變株；在含在含15 20味精的平板上生長良好的耐高谷氨味精的平板上生長良好的耐高谷氨酸突變株；酸突變株；在在20的葡萄糖加的葡萄糖加15味精的平板上生長良好的耐味精的平板上生長良好的耐高糖、耐高谷氨酸的菌株。高糖、耐高谷氨酸的菌株。2.選育能強化谷氨酸合成代謝、削弱或阻斷選育能強化谷氨酸合成代謝、削弱或阻斷支路代謝的菌株支路代謝的菌株（1）選育不分解利）選育不分解利用谷氨酸的突變株用谷氨酸的突變株 選育在以選育在以谷氨酸為谷氨酸為唯一碳源唯一碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上不長或生長

21、微弱的不長或生長微弱的突變株突變株 。谷氨酸谷氨酸谷氨酰胺鳥氨酸瓜氨酸精氨酸（2）選育強化）選育強化CO2固定反應(yīng)的突變株固定反應(yīng)的突變株 a.選育選育以琥珀酸或蘋果酸為唯一碳源，生長良好以琥珀酸或蘋果酸為唯一碳源，生長良好的的菌株。因為細(xì)胞內(nèi)碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧菌株。因為細(xì)胞內(nèi)碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧反應(yīng)，該反應(yīng)與反應(yīng)，該反應(yīng)與C02固定反應(yīng)是相同酶所催化，固定反應(yīng)是相同酶所催化，C02固定反應(yīng)相應(yīng)地加強。固定反應(yīng)相應(yīng)地加強。b.選育選育氟丙酮酸敏感氟丙酮酸敏感突變株。突變株。因為氟丙酮酸是丙酮酸脫氫酶的抑制劑，即抑制因為氟丙酮酸是丙酮酸脫氫酶的抑制劑，即抑制丙酮酸向乙酰丙酮酸向

22、乙酰CoA轉(zhuǎn)化，相應(yīng)地轉(zhuǎn)化，相應(yīng)地CO2固定反應(yīng)加固定反應(yīng)加強。突變株對氟丙酮酸越敏感，效果越理想。強。突變株對氟丙酮酸越敏感，效果越理想。c.選育選育減弱乙醛酸循環(huán)減弱乙醛酸循環(huán)的突變株。的突變株。乙醛酸循環(huán)減弱不僅能使乙醛酸循環(huán)減弱不僅能使C02固定反應(yīng)比例增大，固定反應(yīng)比例增大，而且異檸檬酸也能高效率地轉(zhuǎn)化為而且異檸檬酸也能高效率地轉(zhuǎn)化為-酮戊二酸，酮戊二酸，再生成谷氨酸。常見的該突變株有琥珀酸敏感型再生成谷氨酸。常見的該突變株有琥珀酸敏感型突變株和不分解利用乙酸的突變株。突變株和不分解利用乙酸的突變株。（3）選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的）選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的

23、突變株突變株 有酮基丙二酸抗性突變株、谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性有酮基丙二酸抗性突變株、谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和谷氨酰胺抗性突變株。突變株和谷氨酰胺抗性突變株。草酰乙酸草酰乙酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶天冬氨酸天冬氨酸+- -酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸- -酮戊二酸酮戊二酸NH3谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶（4）選育強化能量代謝的突變株）選育強化能量代謝的突變株 原因：使原因：使TCA循環(huán)前一段代謝加強，谷氨酸合成速循環(huán)前一段代謝加強，谷氨酸合成速率加快。率加快。a.選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株 如可選育丙二如可選育丙二酸、氧化丙二酸、氰化鉀、氰化鈉抗性突變株來酸、氧化丙二酸

24、、氰化鉀、氰化鈉抗性突變株來實現(xiàn)。實現(xiàn)。b.選育選育ADP磷酸化抑制劑抗性突變株磷酸化抑制劑抗性突變株 如可選育如可選育2,4-二硝基酚、羥胺、砷、胍等抗性突變株來實二硝基酚、羥胺、砷、胍等抗性突變株來實現(xiàn)?，F(xiàn)。c.選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株 如如可選育纈氨霉素、寡霉素等抗性突變株來實現(xiàn)。可選育纈氨霉素、寡霉素等抗性突變株來實現(xiàn)。（5）其它遺傳標(biāo)記）其它遺傳標(biāo)記 選育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶類似物、抗核苷酸選育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶類似物、抗核苷酸類抗生素、異亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸類抗生素、異亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、缺陷、

25、AEC抗性、抗性、AHV抗性、棕櫚酰谷氨酸等突抗性、棕櫚酰谷氨酸等突變株，都可以不同程度地提高谷氨酸產(chǎn)量。變株，都可以不同程度地提高谷氨酸產(chǎn)量。3.選育能提高谷氨酸通透性的菌株選育能提高谷氨酸通透性的菌株 （1）選育）選育生物素缺陷型生物素缺陷型菌株。菌株。（2）選育）選育油酸缺陷型油酸缺陷型菌株。菌株。（3）選育）選育甘油缺陷型甘油缺陷型菌株。菌株。（4）選育）選育溫度敏感型溫度敏感型突變株突變株 突變位置發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的突變位置發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的基因結(jié)構(gòu)的基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個堿基為另一上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個堿基為另一

26、個堿基所置換，這樣為基因所控制的酶在高溫下失活，導(dǎo)個堿基所置換，這樣為基因所控制的酶在高溫下失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。 另一個特點是在生物素豐富的培養(yǎng)基上也能分泌出谷氨另一個特點是在生物素豐富的培養(yǎng)基上也能分泌出谷氨酸。酸。 (5)其它突變型菌株其它突變型菌株抗藥性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙抗藥性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙酸缺陷型、棕櫚酰谷氨酸敏感型突變株等，都能酸缺陷型、棕櫚酰谷氨酸敏感型突變株等，都能增增強谷氨酸的通透性強谷氨酸的通透性。 五）基因工程選育五）基因工程選育 基因工程育種是指利用基因工程方法對產(chǎn)生菌株進(jìn)基因工程育種是指利用

27、基因工程方法對產(chǎn)生菌株進(jìn)行改造而獲得高產(chǎn)工程菌，或者是通過微生物間的行改造而獲得高產(chǎn)工程菌，或者是通過微生物間的轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法。轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法。 載體系統(tǒng)載體系統(tǒng) ：一般以質(zhì)粒、噬菌體或轉(zhuǎn)座子作為載體，尤以質(zhì)粒：一般以質(zhì)粒、噬菌體或轉(zhuǎn)座子作為載體，尤以質(zhì)粒為多。為多。 受體系統(tǒng)受體系統(tǒng) ：受體菌選用短桿菌屬和棒桿菌屬的野生菌或變異株。：受體菌選用短桿菌屬和棒桿菌屬的野生菌或變異株。 供體菌株供體菌株：供體菌株選擇短桿菌屬及棒桿菌屬的野生菌或變異：供體菌株選擇短桿菌屬及棒桿菌屬的野生菌或變異株。株。 工具酶：工具酶：切割供體切割供體DNA和載體和載體DNA的工具酶的工

28、具酶限制性內(nèi)切限制性內(nèi)切核酸酶有許多種，核酸酶有許多種，Hind、Bcl I、Xba I和和Xam I效果最好。效果最好。 載體系統(tǒng)載體系統(tǒng) 受體系統(tǒng)受體系統(tǒng) 供體菌株供體菌株 工具酶工具酶 谷氨酸產(chǎn)生菌的許多谷氨酸產(chǎn)生菌的許多關(guān)鍵酶的基因關(guān)鍵酶的基因已被已被克隆克隆，Ozaki等克等克隆了谷氨酸棒桿菌的分枝酸變位酶和預(yù)苯酸脫水酶基因，隆了谷氨酸棒桿菌的分枝酸變位酶和預(yù)苯酸脫水酶基因，通過質(zhì)粒載體導(dǎo)回谷氨酸棒桿菌，產(chǎn)量提高了通過質(zhì)粒載體導(dǎo)回谷氨酸棒桿菌，產(chǎn)量提高了50。 周盛等從大腸桿菌周盛等從大腸桿菌E.coli k-12中通過中通過PCR克隆出克隆出磷酸果糖磷酸果糖激酶編碼基因激酶編碼基因

29、(pfkA)，將其連到表達(dá)，將其連到表達(dá)載體載體，連接構(gòu)建成重，連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒組質(zhì)粒pKu-1，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌谷氨酸棒桿菌B4，并得到表達(dá)；酶活，并得到表達(dá)；酶活性測定表明性測定表明pf-kA基因表達(dá)活力為基因表達(dá)活力為128.6o.86ug的蛋白。的蛋白。同時，轉(zhuǎn)化子菌株對同時，轉(zhuǎn)化子菌株對糖轉(zhuǎn)化率糖轉(zhuǎn)化率比比B4高高10.64，產(chǎn)酸率產(chǎn)酸率比比B4高高17.1。保藏原理：挑選優(yōu)良品種，抑制微生物的代謝活性，創(chuàng)造休眠環(huán)境。 保藏要求：保持菌種優(yōu)良特性，經(jīng)濟方便。保藏后使用前需再次檢測和確定保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo))。一）保藏方法(1)

30、 低溫冷凍保藏；(2) 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?3) 礦物油保藏；(4) 土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。(1) 低溫冷凍保藏-20以下冷凍，使微生物代謝活動停止以下冷凍，使微生物代謝活動停止分類：普通冷凍保藏分類：普通冷凍保藏(-20) 超低溫冷凍保藏超低溫冷凍保藏(-60一一-80) 凍干保藏凍干保藏 液氮冷凍保藏液氮冷凍保藏特點：簡單有效特點：簡單有效 培養(yǎng)物運輸較困難培養(yǎng)物運輸較困難超低溫冷凍保藏超低溫冷凍保藏(-60- -80)超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2min。一些細(xì)菌和真菌菌種可保藏一些細(xì)菌和真菌菌種可保藏5年而活力不受影響。年而活力不受影響。

31、凍干保藏凍干保藏 是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。特點：特點：凍干狀態(tài)下一般可保藏凍干狀態(tài)下一般可保藏10年不喪失活力。凍干后的菌株可常溫保存，便于運年不喪失活力。凍干后的菌株可常溫保存，便于運輸。輸。必須使用冷凍保護劑，常用脫脂乳、蔗糖等。必須使用冷凍保護劑，常用脫脂乳、蔗糖等。液氮冷凍保藏液氮冷凍保藏此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細(xì)胞均